130 research outputs found

    The Role of O-GlcNAc Transferase in C. elegans Reproduction

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    Core evolutionary pressures drive organisms to better survive and to successfully reproduce. At times, these drives can conflict with each other, and the response must take into account information about the external environment and the internal state. Nutrient sensing pathways are an important way in which the cell assesses the state of nutrient levels. The post-translational protein modification O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc), represents one such pathway which regulates many processes in the cell. The thousands of proteins which can be O-GlcNAc modified include components of signaling pathways, epigenetic regulatory proteins, and many more. The O-GlcNAc transferase (OGT) is responsible for transferring GlcNAc to serine or threonine residues of target proteins, and mutations in the human OGT gene have been associated with the rare genetic disorder X-linked intellectual disability (OGT-XLID). Though OGT loss of function is lethal in mammals, C. elegans can survive to adulthood with an absence of OGT and O-GlcNAcylation, which allows a genetics-based approach to investigating the roles of OGT in processes such as reproduction. Males with loss of ogt-1 produce very few progeny in mating assays. This finding correlates with reduced sperm transfer and behavioral differences which showed the males were less likely to engage in mating. Hypodermal expression of ogt-1 can restore the fertility of ogt-1 deletion males to wild-type levels, suggesting OGT-1 plays its role to promote male fertility in the hypodermis. Deletion of ogt-1 was also found to impair the entry of starved hermaphrodites from entering the adult reproductive diapause (ARD) state. Surprisingly, catalytic-dead mutations in ogt-1 did not impact either male fertility or ARD entry, suggesting both of these processes rely on a non-catalytic role of the OGT-1 protein. These findings demonstrate that beyond its role as a nutrient sensor, OGT-1 likely plays core evolutionary roles in reproduction

    CLUSTER HOMOLOG OF IMMUNOGLOBULIN-LIKE RECEPTOR GENES IN CHICKEN IMMUNE RESPONSES

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    This dissertation explores the identity and role of immunoglobulin-like (Ig-like) receptors in chickens, with focus on their implications in disease and disease progression. These receptors, wisely expressed across immune cells, interact with the major histocompatibility complex (MHC) class I molecules to modulate immune responses in mammals. Due to the insufficient representation of chicken Ig-like receptors in online databases, this study systematically annotates the chicken Cluster Homolog of Immunoglobulin-like Receptors (CHIR) genes using advanced bioinformatic techniques, aligning with the release of the 7th edition of the chicken genome assembly that comprises builds for a broiler and layer chicken. The analysis identifies over 150 CHIR genes, refining functional classifications of activatory (CHIRA), inhibitory (CHIRB), bifunctional (CHIRAB), and CHIR-like (CHIRL) genes through InterProScan, phylogeny and motif searches. Variations in CHIR gene counts across different chicken lines (broiler, N = 124, layer, N = 70) suggest links to selective breeding demands, emphasizing their importance in poultry health and production. Phylogenetically, CHIRs show close relationships with other poultry Ig-like receptors, and structural comparisons indicate analogous roles to Ig-like receptors in the human and rat. As an outcome of the analysis, CHIR genes were renamed with the Chicken Genome Nomenclature Consortium from “chicken homolog of Ig-like receptors” to “cluster homolog of Ig-like receptors”. Reanalyzing next-generation sequencing data reveals CHIR genes are expressed across all tissues of a UCD001 line, with generally higher expression in blood-containing organs. Examination of CHIR gene single nucleotide polymorphisms across various in inbred lines (UCD001, UCD003, Line 0, Line 6, Line 7, Line 15, Line N, Line P, Line C, and Line W) indicates an overall variant rarity and slightly more occurrence in CHIRB genes. Over 1,000 protein-encoding variants are associated with differential resistance and susceptibility to Marek’s disease (P \u3c 0.05). Two in vitro approaches assessed the roles of CHIR molecules in modulating immune responses or targeting pathogens. Re-examination of RNA-sequencing data of MHC-I types B2 and B19 macrophages, temporally stimulated with interferon-gamma, revealed dynamic and opposite CHIR expression trends, with B2s showing an increase and B19s displaying a decrease until returning to basal levels at 24 to 48 hours. These findings suggest nuanced and distinct regulatory patterns of CHIRs in different haplotypes during immune responses. Additionally, CHIR sequences were aligned for the design of small interfering RNA molecules targeting the CHIRB functional group on macrophages retrieved from birds of congenic (UCD331 and UCD335) and mixed (WVU1952) backgrounds. CHIRB silencing was observed to enhance cellular nitrate release and impact H2O2, particularly in specific MHC-I haplotypes and in different genetic backbones, in avian influenza virus infection. While this dissertation enhances our understanding of chicken Ig-like receptors and cellular involvement, it also acknowledges certain limitations, such as variations in gene annotations. Nevertheless, CHIRs merit a sizeable acknowledgment as pivotal contributors to the immune response, particularly in their intricate interactions with the MHC. Future studies integrating this understanding into breeding plans or other interventions becomes a strategic imperative for optimizing poultry health and immunity, ensuring wellbeing, and in turn, a more resilient and sustainable food supply

    Twin Research for Everyone. From Biology to Health, Epigenetics, and Psychology

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    Antigen Presentation in Central Nervous System Antitumor Immunity

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    Glioblastoma multiforme (GBM) patients face limited treatment options and poor outcomes. The median survival is less than two years, and there are no FDA approved immune therapies. Although GBM itself is an immune-suppressive, heterogeneous tumor, the lack of FDA approved immune therapies might be in part because the cancer immunity cycle is less well understood for GBM than for other tumor types. My studies focused on developing mouse models of malignant glioma that more faithfully recapitulate human GBM from an immunologic perspective, and on defining the role of the conventional dendritic cell 1 subset (cDC1) and lymphatic drainage in central nervous system (CNS) antitumor immunity. While genetically engineered mouse models of glioma have been described, they are for various reasons unsuitable to study the immune system’s reaction against the tumor, due to their use of outbred mice, immunologically immature mice, human oncogenes to drive transformation, or highly inflammatory initiation events. Furthermore, the most commonly deleted tumor suppressors in GBM are underrepresented in existing models. Thus, we engineered the tumor suppressor genes p16INK4a and p19ARF (INK4a/ARF; CDKN2A/B in humans) and phosphate and tensin homolog (PTEN) to be loxP-flanked on a pure C57BL/6 background. We used lentiviral transduction of Cre and the murine oncogene platelet derived growth factor beta (PDGFβ) to conditionally delete these tumor suppressors and transform target cells in brains of immunologically mature mice, which resulted in brain tumor formation. With the standard treatment, GBM invariably recurs, with 20%-30% of cases hypermutated. It is often the loss of mutS homolog 6 (MSH6), a mismatch repair protein, that confers resistance to temozolomide (standard-treatment) and leads to treatment-induced hypermutations. We developed the tools to model this phenomenon in a preclinically. We isolated astrocytes from the B6 INK4a/ARFfl/fl x PTENfl/fl mice and transformed them with the Cre/mPDGFβ lentivirus constructs. We used CRISPR to delete the mismatch repair protein MSH6 in these ex-vivo transformed astrocytes. We characterized their resistance to temozolomide and successfully induced hypermutation with long term temozolomide treatment and inhibition. Within the immunologically distinct location of the CNS the type of antigen presenting cell (APC) responsible for priming T cell responses against brain tumors remains undefined. In other non-CNS tumors, the conventional dendritic cell 1 (cDC1) subset cross-presents tumor-derived and cell-associated tumor antigen to generate antitumor CD8+ and CD4+ T cell responses. However, the homeostatic brain parenchyma is largely devoid of cDC1—their steady state location is restricted to the choroid plexus and the dura. Using orthotopic, syngeneic transplant models of murine glioblastoma, we investigated the roles of cDC1 and other antigen presenting cells in antitumor immunity of the CNS. We used the cDC1-deficient interferon regulatory factory 8-deficient (IRF8+32-/-) mice to determine that cDC1 are required to mediated αPD-L1 induced survival benefit as well as to generate neoantigen-specific CD8+ T cell responses against the brain tumors. Furthermore, using a fluorescent tracking system, we observed that dendritic cells (including the cDC1 subset) isolated from the tumor, the lymphatic vessel-containing dura, and the cervical lymph nodes harbored tumor-derived antigen. We extended these findings to humans. We identified several subsets of conventional dendritic cells, including the CD141+ cDC1 equivalent, in the immune cell infiltrate of a variety of human brain tumor types (including GBM), as well as in the tumor-adjacent dura. We determined tumor-infiltrating dendritic cells, including the CD141+ subset (equivalent to the mouse cDC1), contained the tumor-specific fluorescent metabolite of 5-aminolevulinic acid (5-ALA), protoporphyrin IX (PPIX), which is used for fluorescence guided resection of malignant glioma. The PPIX signal was absent in both tumor-infiltrating T cells and equivalent dendritic cell subsets isolated from intraoperatively harvested peripheral blood, which indicates that this phenomenon was specific to antigen presenting cells that had infiltrated the tumor. To our knowledge, this is the first observation in humans of antigen presenting cells ingesting tumor-derived material. Together, these data provide evidence that cDC1 play a significant role in CNS antitumor immunity in mice and humans. Collectively, these studies have yielded improved tools to study the immunity cycle in GBM and have shed light on some of the elements regarding the nature and mechanism of antigen presentation in CNS antitumor immunity

    Functional characterisation of genetic variants influencing human food preferences using bioinformatics and in vivo models

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    Chronic diseases place a huge burden on society and are the leading cause of death worldwide. Obesity, which is currently a worldwide epidemic, is a risk factor for chronic disease. Understanding drivers of food choices may help to address the escalating obesity problem. Many people are at an increased risk of obesity as they carry genetic variants linked to particular eating behaviours. Identification of causal variants can help to understand which genes and biological mechanisms underlie food preference. Previous work used UK Biobank data from ~500,000 individuals to identify 302 loci associated with food consumption. This research project aimed to understand which genes were responsible for these genetic associations, prioritise genes for functional validation study, and understand the function of these genes through in vivo food preference studies. It is well-known that there can be intake-related bias in food frequency questionnaire responses due to participants over- or under-reporting dietary intake and this makes nutritional research difficult. Mendelian randomization was used to statistically identify reporting bias in the UK Biobank food frequency questionnaire responses and these were subsequently corrected by the group using a bespoke method. A 6-stage gene prioritisation strategy was developed to identify a candidate gene for functional validation in vivo. Genes were allocated points based on three main components: gene expression in humans and mice, conservation of gene product across species using pairwise protein alignments, and knockout phenotype details from available mouse models. Genes were ranked in order of preference for functional follow-up study. The top two genes identified were IER5L (associated with meat and fat) and DCAF12 (associated with salt). It was difficult to determine a coherent role for IER5L in food preference. The top SNP mapped to IER5L was found to be in an eQTL containing two other genes: CRAT and PPP2R4. It was not possible to exclude any of these genes from the meat/fat association, but there were clear links in the literature between CRAT and food intake. CRAT was selected for functional follow up, along with the DCAF12 gene associated with adding salt to food. However, it was not possible to follow up the CRAT gene due to logistical reasons. The project instead progressed to the in vivo stage using the well-known MC4R appetite regulatory gene to develop a model of food preference that could be used with Crat–/– mice in the future. A novel 3-food preference model was developed using Mc4r–/– mice and WT mice. Mice were given a choice of three diets: protein-enriched diet (to model the CRAT meat association), fat-enriched diet (to model the CRAT fat association) and standard chow. Mice preferred to eat a completely fat diet or a mixed choice diet regardless of genotype. Mc4r–/– mice were heavier than WT mice but were not hyperphagic as was expected from previous studies. As expected, Mc4r–/– mice demonstrated hyperinsulinemia compared to WT mice but there were no differences in glucose or triglyceride levels found between Mc4r–/– and WT mice. In vivo modelling of the DCAF12 salt association was carried out using Dcaf12–/– and WT mice to investigate salt preference. Mice were given a choice of two bottles of water followed by a choice of 0.4% (75mM) salt solution and water. This was repeated using a higher concentration 0.8% (150mM) salt solution. Dcaf12–/– mice did not show a preference for the salt solution as expected, and preference reduced as salt concentration increased. Unexpectedly, mice demonstrated a right-hand side preference during the water bottle choice period. Furthermore, mice consumed less food as salt concentration increased. This salt-preference study highlighted a number of complexities that can be associated with translating human effects into in vivo models. Research into the genetics of eating behaviour can help to identify and understand the impact of genetic variants on dietary pathways. If we can understand biological drivers of individual food choices, this information may be used to guide people towards a healthier lifestyle and reduce levels of obesity

    Viral and host determinants of the impact of human cytomegalovirus in immunocompromised adults from Australia and Indonesia

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    This thesis explores a virus that is carried by about 80% of the world’s population called cytomegalovirus. Cytomegalovirus can cause disease in people whose immune systems are dysfunctional. The thesis focuses on the cytomegalovirus itself and utilises deep sequencing technologies to identify a range a variants. The genetic variants are then linked with immune responses to HCMV and markers of cardiovascular diseases in renal transplant recipients, people living with HIV and neonates

    Impact of Mitochondrial Genetic Variants in ND1, ND2, ND5 and ND6 Genes on Sperm Motility and Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) Outcomes

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    Sperm mitochondrial dysfunction generates an insufficient amount of the energy that required for the movement of sperm flagellum. In this case, sperm cannot reach the site of fertilization, thereby reducing sperm fertilization capacity, and thus usually causing most asthenozoospermic men to need assisted reproductive techniques. The etiology of asthenozoospermia itself remains largely unknown. The aim of this current study is therefore to investigate the effect of mitochondrial genetic variants on sperm motility and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) outcomes. Furthermore, this study aims to investigate the role of oxidative stress in mitochondrial dysfunction by measuring the protein carbonyl levels in the sperm of asthenozoospermic men. A total of 150 couples from the ICSI cycle were enrolled in this study. One hundred-and-five of the male partners were asthenozoospermic patients, and they were subdivided into three groups, according to their percentage of sperm motility, while forty-five of the male partners were normozoospermic. Genetic variants were screened using direct Sanger’s sequencing in four mitochondrial genes Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen (NADH) dehydrogenase 6 (ND6), NADH dehydrogenase 5 (ND5), NADH dehydrogenase 2 (ND2) and NADH dehydrogenase 1 (ND1) in the sperm of the male partners. Protein carbonyl was used as a biomarker to detect protein oxidative damage, a phenomenon which is induced by the attacks of reactive nitrogen species (RNS) in addition to reactive oxygen species (ROS). Furthermore, protein degradation causing the formation of carbonyl groups, which is derived from the direct oxidation process of a number of amino-acids’ side chains such as threonine and arginine residues. Quantitation of the protein carbonyl levels in the sperm of asthenozoospermic men was performed using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. Sperm motility was significantly positively correlated with the fertilization rate (r=0.701, p<0.001). The medians of the fertilization rate among groups (G) were: (G1 (36±1.86), G2 (40±1.63), G3 (47±13.41) and the control (67±14.69) p< 0.001). Sperm motility was also significantly positively correlated with the embryo cleavage score (r=0.549, p<0.001). The medians of the embryo cleavage score among the groups were: (G1 (3±0.31), G2 (3.34±0.36), G3 (3.58±0.31) and the control (3.66±0.25) p< 0.001). Furthermore, sperm motility was significantly positively correlated with the embryo quality score (r=0.656, p<0.001). The medians of the embryo quality score among the groups were: (G1 (1.5±0.31), G2 (1.75±0.39), G3 (2.14±0.44) and the control (2.5±0.27) p< 0.001). On the other hand, the fertilization rate was significantly positively correlated with the embryo cleavage score (r=0.590, p<0.001) and with the embryo quality score (r=0.745, p<0.001). The protein carbonyl levels were significantly negatively correlated with the sperm motility (r=-0.894, P<0.001). The medians of the protein carbonyl levels among the groups were: (G1 (2.24±0.3), G2 (1.97±0.17), G3 (1.22±0.2) and the control (0.32±0.12) p< 0.001). The protein carbonyl levels were negatively correlated with the fertilization rate (r = - 0.670, P <0.001), the embryo cleavage score (r = - 0.511, P <0.001) and the embryo quality score (r = - 0.623, P <0.001). The frequency of the total variants in all genes was negatively correlated with the percentage of sperm motility, P A (rs28359178) in ND5, 4216 T>C (rs1599988) in ND1 and a novel 12506T>A in ND5 with P-values: 0.006, 0.036 and 0.013, respectively. The medians of the sperm motility, the fertilization rate, the embryo quality score and the embryo cleavage score were significantly differed between men showing 4216 T>C, 12506T>A, 13708G>A and the wild type, Mann-Whitney P-values for the differences in the medians were < 0.05 in all of them. In conclusion, the sperm motility was positively correlated with the ICSI outcomes, while protein carbonyl levels were negatively correlated with sperm motility and ICSI outcomes. This demonstrates that sperm motility can predict the ICSI outcomes, and the quantification of protein carbonyl can be used as a biomarker for protein oxidative damage in sperm. The frequencies of total mitochondrial variants in ND1, ND2, ND5 and ND6 genes were negatively correlated with the percentages of sperm motility and the ICSI outcomes. Finally, the results from this study showed three missense variants, namely, 13708 G>A, 4216 T>C and 12506T>A, which were found to be negatively correlated with sperm motility and ICSI outcomes.Die mitochondriale Dysfunktion von Spermien erzeugt eine unzureichende Menge an Energie, die für die Bewegung der Spermiengeißel erforderlich ist. In diesem Fall können die Spermien den Ort der Befruchtung nicht erreichen, wodurch die Befruchtungsfähigkeit der Spermien reduziert wird und somit die meisten asthenozoospermischen Männer in der Regel assistierte Reproduktionstechniken benötigen. Die Ätiologie der Asthenozoospermie selbst ist noch weitgehend unbekannt. Das Ziel dieser aktuellen Studie ist es daher, den Einfluss mitochondrialer genetischer Varianten auf die Spermienmotilität und die Ergebnisse der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) zu untersuchen. Darüber hinaus soll in dieser Studie die Rolle von oxidativem Stress bei der mitochondrialen Dysfunktion untersucht werden, indem der Protein-Carbonyl-Gehalt in den Spermien von asthenozoospermischen Männern gemessen wird. Insgesamt wurden 150 Paare aus dem ICSI-Zyklus in diese Studie eingeschlossen. Einhundertfünfundfünfzig der männlichen Partner waren asthenozoospermische Patienten, und sie wurden in drei Gruppen unterteilt, je nach dem Prozentsatz ihrer Spermienmotilität, während fünfundvierzig der männlichen Partner normozoospermisch waren. Genetische Varianten wurden mittels direkter Sanger-Sequenzierung in vier mitochondrialen Genen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Hydrogenase 6 (ND6), NADH-Dehydrogenase 5 (ND5), NADH-Dehydrogenase 2 (ND2) und NADH-Dehydrogenase 1 (ND1) im Sperma der männlichen Partner untersucht. Protein-Carbonyl wurde als Biomarker verwendet, um oxidative Schäden an Proteinen nachzuweisen, ein Phänomen, das durch den Angriff reaktiver Stickstoffspezies (RNS) zusätzlich zu den reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) induziert wird. Darüber hinaus verursacht der Proteinabbau die Bildung von Carbonylgruppen, die aus dem direkten Oxidationsprozess einer Reihe von Seitenketten von Aminosäuren wie Threonin- und Argininresten stammen. Die Quantifizierung der Protein-Carbonyl-Gehalte in den Spermien asthenozoospermischer Männer wurde mit der Enzymimmunoassay (ELISA)-Technik durchgeführt. Die Spermienmotilität war signifikant positiv mit der Befruchtungsrate korreliert (r=0,701, p<0,001). Die Mediane der Befruchtungsrate zwischen den Gruppen (G) waren: (G1 (36±1.86), G2 (40±1.63), G3 (47±13.41) und die Kontrolle (67±14.69) p< 0.001). Die Spermienmotilität war auch signifikant positiv mit dem Embryo-Cleavage-Score korreliert (r=0,549, p<0,001). Die Mediane des Embryo-Cleavage-Scores zwischen den Gruppen waren: (G1 (3±0,31), G2 (3,34±0,36), G3 (3,58±0,31) und die Kontrolle (3,66±0,25) p<0,001). Außerdem war die Spermienmotilität signifikant positiv mit dem Embryoqualitätsscore korreliert (r=0,656, p<0,001). Die Mediane des Embryoqualitätsscores zwischen den Gruppen waren: (G1 (1,5±0,31), G2 (1,75±0,39), G3 (2,14±0,44) und die Kontrolle (2,5±0,27) p<0,001). Andererseits war die Befruchtungsrate signifikant positiv korreliert mit dem Embryo-Cleavage-Score (r=0,590, p<0,001) und mit dem Embryo-Quality-Score (r=0,745, p<0,001). Die Protein-Carbonyl-Werte waren signifikant negativ mit der Spermienmotilität korreliert (r=-0,894, p<0,001). Die Mediane der Protein-Carbonyl-Werte zwischen den Gruppen waren: (G1 (2,24±0,3), G2 (1,97±0,17), G3 (1,22±0,2) und die Kontrolle (0,32±0,12) p<0,001). Die Protein-Carbonyl-Gehalte waren negativ korreliert mit der Befruchtungsrate (r = - 0,670, p <0,001), dem Embryo-Cleavage-Score (r = - 0,511, p <0,001) und dem Embryo-Quality-Score (r = - 0,623, p <0,001). Die Häufigkeit der Gesamtvarianten in allen Genen war negativ mit dem Prozentsatz der Spermienmotilität korreliert, P A (rs28359178) in ND5, 4216 T>C (rs1599988) in ND1 und eine neue 12506T>A in ND5 mit P-Werten: 0,006, 0,036 und 0,013, jeweils. Die Mediane der Spermienmotilität, der Befruchtungsrate, des Embryo-Qualitäts-Scores und des Embryo-Cleavage-Scores unterschieden sich signifikant zwischen Männern mit 4216 T>C, 12506T>A, 13708G>A und dem Wildtyp, Mann-Whitney P-Werte für die Unterschiede in den Medianen waren in allen Fällen < 0,05. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Spermienmotilität negativ mit den ICSI-Ergebnissen korreliert war. Die Protein-Carbonyl-Werte waren ebenfalls negativ mit der Spermienmotilität und den ICSI-Ergebnissen korreliert. Dies zeigt, dass die Spermienmotilität die ICSI-Ergebnisse vorhersagen kann, und die Quantifizierung von Protein-Carbonyl kann als Biomarker für oxidative Proteinschäden in Spermien verwendet werden. Die Häufigkeiten der gesamten mitochondrialen Varianten in den Genen ND1, ND2, ND5 und ND6 waren negativ mit den Prozentsätzen der Spermienmotilität und den ICSI-Ergebnissen korreliert. Schließlich zeigten die Ergebnisse dieser Studie drei Missense-Varianten, nämlich 13708 G>A, 4216 T>C und 12506T>A, die negativ mit der Spermienmotilität und den ICSI-Ergebnissen korreliert waren

    Genetic analysis of familial Alzheimer’s disease, primary lateral sclerosis and paroxysmal kinesigenic dyskinesia: a tool to uncover common mechanistic points

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    Las enfermedades neurológicas pueden tener un amplio espectro de fenotipos, causando interrupciones en las actividades de la vida diaria y, a menudo, una enfermedad progresiva que termina en la pérdida de la vida. Los mecanismos moleculares que subyacen a muchas de estas enfermedades pueden tener vías comunes y, dependiendo del gen en cuestión, su disfunción puede llevar a una variedad de condiciones. La enfermedad de Alzheimer (EA) es la demencia neurodegenerativa más común en el mundo, con una estimación de 50 millones de personas que viven con demencia en todo el mundo. Los síntomas de la EA incluyen dificultad para recordar nombres o eventos recientes, apatía, depresión , desorientación, confusión, dificultad de hablar, caminar y tragar. La división canónica de la EA en inicio temprano (EOAD por sus siglas en inglés) e inicio tardío (LOAD por sus siglas en inglés) se establece en los 65 años de edad. Ambos se caracterizan por agregados de proteína tau hiperfosforilada intracelular llamados ovillos neurofibrilares (NFT por sus siglas en inglés) y placas seniles extracelulares compuestas principalmente por grupos de péptido amiloide-β (Aβ). La patología de EA comienza en la corteza entorrinal, una región del lóbulo temporal medial, y causa la muerte de las neuronas provocando la atrofia del tejido cerebral. La EA es una enfermedad multifactorial con un patrón de herencia dicotómico. Aproximadamente el 70 % de las causas son genéticas y el resto ambientales. Mutaciones en los genes: APP, PSEN1 y PSEN2, son las causas más comunes de EOAD y el alelo ε4 de APOE es un factor de riesgo bien establecido de LOAD. Tres vías principales contienen la mayoría de los factores de riesgo genéticos de EA: la respuesta inmune, el metabolismo lipídico y la endocitosis. Entre los genes involucrados en la respuesta inmune, CR1 se ha asociado con la EA mediante estudios de asociación de todo el genoma (GWAS por sus siglas en inglés). CR1 forma un parte importante del sistema del complemento y es significativo para este trabajo. Una isoforma de CR1, CR1*2, se expresa en niveles más bajos que la isoforma CR1*1 y se especula que provoca un menor aclaramiento de Aβ y una desregulación del sistema del complemento. La esclerosis lateral primaria (ELP) se considera una parte del espectro patológico de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La ELA, aunque se considera una enfermedad rara, es la enfermedad de la neurona motora (ENM) más común. La ELP se caracteriza por la espasticidad espinobulbar causada por la degeneración de las neuronas motoras superiores (NMS), mientras que la ELA se caracteriza por la degeneración tanto de las NMS como de las neuronas motoras inferiores (NMI) a nivel espinal y bulbar, lo que causa parálisis de las extremidades, disartria, disfagia y muerte por insuficiencia respiratoria. Características clínicas de ELP incluyen la espasticidad, ligera debilidad en las extremidades inferiores, inicio en adultos, curso progresivo, duración de más de 4 años y los síntomas seudobulbares. Los déficits cognitivos y conductuales pueden ocurrir con ELA, que van desde la demencia leve, moderada a la demencia frontotemporal (DFT) que también se observó en pacientes con ELP. La base genética de la ELP no se conoce bien, aunque se conocen mutaciones en los genes SPG7 y TBK1 en pacientes afectados por ELP familiar. Las mutaciones en el gen SOD1, que codifica una enzima antioxidante, y en la proteína codificada por el gen C9orf72 son las causas más comunes de ELA. La patogenia de la ELA puede ser causada por excitotoxicidad del glutamato, disfunción mitocondrial, alteración de la estructura o transporte en los axones y estrés oxidativo. La discinesia paroxística cinesigética (PKD por sus siglas en inglés), el trastorno del movimiento paroxístico más común, se caracteriza por una variedad de movimientos involuntarios desencadenados por movimientos repentinos. Con inicio en la niñez o adolescencia, sus características clínicas incluyen ataques recurrentes que involucran corea, atetosis, posturas distónicas o balismo. La gravedad de estos ataques suele disminuir con la edad. Las mutaciones en el gen PRRT2 son, hasta ahora, la única causa conocida de este trastorno. Se sabe que PRRT2 interactúa con las proteínas SNAP-25, SYT1 y SYT2 en la membrana presináptica de las neuronas, que participan en la señalización en las células nerviosas. La falta de PRRT2, a menudo causada por la vía de degradación del ARN mensajero mediada por mutaciones terminadoras (NMD por sus siglas en inglés), debido a codones de terminación prematura (PTC por sus siglas en inglés) en el transcripto, es el mecanismo molecular común involucrado en la haploinsuficiencia que causa PKD. Objetivos El objetivo principal de este trabajo es comprender la etiopatogenia de tres enfermedades neurológicas que afectan a tres familias españolas distintas y estudiar los mecanismos genéticos y moleculares que afectan a estas enfermedades.   Materiales y métodos Se recogieron muestras de ADN de miembros de tres familias españolas: UGM037 (11 individuos) afectados por EA, UGM471 (7 individuos) afectados por ELP y UGM478 (7 individuos) afectados por PKD. También se dispone de una población de control de individuos sanos y otra de individuos afectados por EA disponible. Las muestras se recogieron con la aprobación de los Comités de Ética en la Investigación de los hospitales correspondientes con el consentimiento informado firmado por los pacientes. La cepa bacteriana utilizada para todas las manipulaciones necesarias fue Escherichia coli DH5α y la línea celular humana fue SH-SY5Y. La secuenciación del exoma completo (WES por sus siglas en inglés) se utilizó como herramienta para identificar variantes dentro del exoma de los pacientes. A través de “base-calling” y análisis de imágenes, alineación de lectura y “SNP calling”, los datos podrían transformarse en una base de datos viable de variantes. Se utilizó el filtrado y la priorización seguida de la validación de secuenciación de Sanger de los resultados para identificar las variantes más interesantes, posiblemente involucradas en la causa de las enfermedades. Para la evaluación de variantes se utilizaron bases de datos públicas como Collaborative Spanish Variant Server (CSVS) o Genome Aggregation Database (gnomAD). La frecuencia de la variante también se verificó mediante PCR específica de alelo (ASPCR por sus siglas en inglés) realizada en las poblaciones de control. Después de identificar las variantes más interesantes, se realizaron manipulaciones de plásmidos para obtener ADNc, correspondientes a secuencias de los genes con estas variantes, en vectores de expresión específicos. Se utilizó mutagénesis dirigida para la introducción de variantes de un solo nucleótido (SNV por sus siglas en inglés), el epítopo FLAG y sitios de restricción enzimática. La subclonación se utilizó para transferir ADNc específicos a los correspondientes vectores de expresión. El análisis in silico se realizó utilizando los servicios web HOPE, I-Mutant 2.0 y ConSurf. De esa forma se pudo establecer la influencia de una variante específica en la función y estabilidad de la proteína. También el grado de conservación de los residuos. En el caso de genes implicados en la EA, conocer los genotipos de APOE y CR1 es importante y se realizó mediante PCR. En el caso de APOE, la PCR fue seguida por restricción enzimática y análisis del patrón de bandas en un gel de agarosa. En el caso de CR1, la PCR fue seguida por secuenciación de Sanger o análisis de presencia o ausencia de bandas en un gel de agarosa. Las células SH-SY5Y se mantuvieron en un medio de crecimiento completo y se utilizó el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 para transfectarlas con plásmidos correspondientes a experimentos específicos. Un experimento consistió en comparar los niveles de ARNm y proteínas de genes específicos afectados por las variantes identificadas. En otro, se realizó la misma comparación después de la inhibición de la vía NMD, usando NMDI14. Para medir los niveles de ARNm, se extrajo el ARNm de células SH-SY5Y transfectadas después de aproximadamente 48h de incubación y se obtuvo el ADNc mediante retrotranscripción. Estos se utilizaron en PCR cuantitativa (qPCR por sus siglas en inglés) con cebadores diseñados específicamente para amplificar el producto de la transcripción reversa con controles apropiados. Para medir los niveles de proteína, las proteínas se extrajeron de las células SH-SY5Y transfectadas después de aproximadamente 48h de incubación y se usaron para el análisis por Western Blot (WB). El gen constitutivo de actina se utilizó como control. Para el análisis funcional de las distintas variantes de ADPRH, las proteínas se extrajeron de las células SH-SY5Y transfectadas y se sometieron a purificación utilizando una columna de afinidad de proteínas marcadas con GST. Después de la diálisis y concentración de la muestra, las proteínas podrían usarse para un ensayo de actividad. Esto implicó la ADP-ribosilación del sustrato por la toxina del cólera (CT) seguida de la hidrólisis de este enlace por ADPRH y sus variantes. Las muestras se cargaron luego en una columna de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC por sus siglas en inglés) que permitió la separación, identificación y cuantificación de los componentes basándose en los datos de un detector que mide la absorbancia a 260 nm. También se utilizó co-inmunoprecipitación con extractos de proteínas de células SH-SY5Y cotransfectadas con ADPRH y ADPRHL1 para determinar si tiene lugar la interacción proteína-proteína. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student y ANOVA unidireccional o bidireccional para comparar las diferencias entre las medias de los grupos, con una prueba post hoc de Tukey de comparaciones múltiples de medias. Se utilizó el software R para realizar las pruebas. Resultados y discusión La filtración, priorización y validación mediante secuenciación Sanger identificó la variante rs764542666 en el gen CR1 que codifica un PTC c.C406T p.R136* (CR1R136*) como la causa probable de EA en la familia UGM037. Los datos clínicos sugirieron LOAD en la familia, que estaría más en consonancia con los factores de riesgo que con las mutaciones causales. Los miembros de la familia poseían el alelo APOE ε4, sin embargo, sorprendentemente, el análisis de la familia reveló que un miembro con un genotipo APOE ε4/ε4 y una edad de 88 años no presentaba alteración cognitiva alguna. La variante CR1R136* segrega con la enfermedad en el pedigrí, y no aparece en ninguno de los miembros sin EA. Estudios anteriores mostraron que la isoforma CR1*2 de CR1, asociada con un mayor riesgo de LOAD, se expresaba menos que CR1*1. Según esto, el tránscrito de CR1R136* podría causar un efecto similar al activar el NMD y causar sí haploinsuficiencia. El estudio de los niveles de ARNm y proteínas reveló que CR1R136* se expresa en niveles más bajos que el tipo silvestre. Estos niveles aumentaron significativamente después del tratamiento con inhibidor de NMD, lo que sugiere la participación de esta vía en la degradaciódel transcrito CR1R136*. El genotipado de la isoforma CR1*2 y rs3818361 en CR1 en muestras de la familia UGM037, mostró que ninguno de ellos tenía isoforma CR1*2 y rs3818361 no se segregó con la enfermedad, no estando presente en ninguna de las muestras de pacientes. Ambos fueron genotipados, ya que se describieron previamente como asociados con la EA. La isoforma CR1*2, como se mencionó anteriormente, se expresa a niveles más bajos que CR1*1, por lo que posiblemente afecte un aclaramiento de Aβ más bajo y una desregulación del sistema del complemento. El rs3818361 fue genotipado para verificar si puede ser el verdadero culpable de la enfermedad, estando en desequilibrio de ligamiento con CR1R136*. Los hijos de los pacientes y el miembro de la familia sano, no fueron diagnosticados con EA, sin embargo, sus muestras de ADN se recolectaron entre las edades de 50 y 57. Pueden estar en riesgo de desarrollar la enfermedad a una edad posterior, especialmente porque todos excepto uno de ellos tenía una copia del alelo APOE ε4. Además, tres de siete de ellos tenían la variante CR1R136*. Aunque la sobreexpresión in vitro de una proteína en un modelo celular tiene sus limitaciones, el mecanismo molecular detrás de la EA en la familia UGM037 parece ser la haploinsuficiencia causada por la destrucción del transcripto CR1R136* por la vía NMD. Son necesarios más estudios funcionales sobre los efectos de CR1R136* y un seguimiento futuro de los miembros más jóvenes de la familia. Según mi conocimiento, CR1R136* (rs764542666) sería la primera mutación causante de EA conocida en el gen CR1. Los datos clínicos disponibles respaldaron el diagnóstico de ELP en miembros de la familia UGM471. A través de la priorización y filtración de datos de WES y la validación por secuenciación de Sanger, se identificaron dos variantes que posiblemente podrían causar los síntomas en la familia. Uno era una nueva variante c.G884C p.R295P en ADPRH (ADPRHR295P) y el otro era una mutación c.T497C p.L166P previamente descrita en PSEN1 (rs63750265; PSEN1L166P). Este último fue descubierto recientemente dentro del genoma de la familia UGM471, por lo que se discutirán cronológicamente, a partir del descubrimiento. La ADPRH es una proteína ubicua que se encuentra en el citoplasma de ratones y humanos. ADPRH hidroliza el enlace N-glicosídico entre la arginina y la ADP-ribosa, escindiendo la ADP-ribosa del sustrato en el ciclo de ADP-ribosilación. La reacción resulta ser específica para sustratos mono-ADP-ribosilados, debido a la estructura de la proteína. El ciclo de ribosilación de ADP es muy importante para la regulación celular. El variante ADPRHR295P se prevé que sea perjudicial por SIFT y Polyphen. No se encontró en ninguna base de datos pública y la secuenciación de Sanger confirmó su segregación con la enfermedad en el pedigrí de la familia UGM471. Sin embargo, dos individuos sanos de esta familia también portaban ADPRHR295P. La evaluación de la frecuencia de ADPRHR295P por ASPCR en la población de control, mostró que ninguno de los 196 individuos que no eran afectedos por ELP eran portadores. Se encontró que la arginina en la posición 295 en ADPRH era un residuo conservado y un cambio a una prolina podría afectar la función o estabilidad de la proteína de manera significativa. La reevaluación de los datos de WES mostró un parálogo de ADPRH, ADPRHL1 afectado por una variante ADPRHL1L294R, que también se predice que es perjudicial. Esta variante se segrega con la enfermedad en la familia, no estando presente en los individuos sanos. Se especula que ADPRH junto con ADPRHL1 están implicados en el ensamblaje de filamentos de actina y la modulación de la polimerización de actina puede estar implicada en la interrupción del transporte nucleocitoplasmático que es importante en la patogénesis de la ELA. Así, la variante ADPRHR295P puede tener una penetrancia baja, provocando la enfermedad solo en ciertos miembros de la familia, o puede ir acompañada de la variante ADPRHL1L294R, para afectar a los pacientes. La coinmunoprecipitación no mostró una interacción entre las dos proteínas, sin embargo, pueden funcionar al unísono sin una interacción directa. El ensayo de actividad para ADPRHR295P, donde se usó CT para ADP-ribosilar un sustrato y ADPRH de tipo silvestre (ADPRHWT) y sus variantes (ADPRHR295P y ADPRHD55A/D56A) se usaron para hidrolizar la ADP-ribosa, mostró que ADPRHR295P tenía una eficiencia de actividad similar a la del ADPRHWT. La variante ADPRHD55A/D56A, en la que se cambiaron los residuos esenciales del sitio activo, no mostró actividad hidrolasa. Aunque este ensayo no mostró disminución de la actividad de la variante ADPRHR295P, no tuvo en cuenta el posible efecto desestabilizador de la variante. El ensayo RT-qPCR para medir los niveles de ARNm de esta variante mostró que no variaban del tipo silvestre, sin embargo, los niveles de proteína medidos con WB demostraron ser significativamente más bajos que los del ADPRHWT o para otras variantes examinadas (ADPRHR295Q, ADPRHD55A/D56A). Solo la variante ADPRHR295* que se ha descrito previamente, demostró tener niveles de ARNm muy bajos y no pudo detectarse ninguna proteína. Esto sugiere que puede verse afectado por la vía NMD. Si bien es difícil decir si la variante de ADPRHR295P afecta la enfermedad en la familia UGM471, es importante conocer su fuerte efecto sobre la estabilidad de la proteína para el estudio adicional de la mono-ADP-ribosilación poco estudiada. La mutación c.T497 C p.L166P en PSEN1 (rs63750265) se descubrió recientemente en la familia UGM471. Aunque las mutaciones en PSEN1 comúnmente causan EOAD, ha habido informes que asocian PSEN1 con ELP y ELA. PSEN1A431E y PSEN1L381V son dos ejemplos de mutaciones asociadas con ELP y EA, que provocan un inicio temprano alrededor de los 40 años de edad. Se sabe que la mutación PSEN1L166P causa EA y paraparesia espástica a una edad temprana, siendo el primer caso encontrado en una niña de 15 años. También se encontró que otras mutaciones en la posición L166 en PSEN1 estaban asociadas con la EA (PSEN1L166V, PSEN1L166R (rs63750265), PSEN1L166H (rs63750265) y PSEN1L166del (rs63751458)). La mayoría de ellos se asociaron con deterioro cognitivo, aunque algunos se asociaron con síntomas motores. La mutación PSEN1L166P causa pérdida parcial de función de escisión de la γ-secretasa y aumenta la proporción Aβ42/Aβ40 mediante la reducción de los niveles de Aβ40. Además, PSEN1 funciona formando canales de fuga de Ca2+ del retículo endoplásmico (RE), y la mutación PSEN1L166P interrumpe esa función. El descubrimiento reciente de la mutación PSEN1L166P en la familia UGM471 no permitió una investigación más exhaustiva de sus efectos, pero se confirmó que se segrega con la enfermedad en el pedigrí. La naturaleza agresiva de esta mutación, la edad temprana de aparición y los síntomas motores, sugieren fuertemente que es PSEN1L166P el que causa la enfermedad en la familia. Si bien no está asociado con ELA ni ELP, los pacientes también pueden haber sido afectados por otros factores ambientales o genéticos para producir este fenotipo. Al mismo tiempo, existen informes de pacientes con ELP con mutaciones en PSEN1. O el efecto de las mutaciones de PSEN1 es lo suficientemente heterogéneo como para causar estos diferentes trastornos, los trastornos están mucho más relacionados debido a los mecanismos moleculares que los causan, o el efecto de la mutación de PSEN1 se ve afectado por la interacción con otras proteínas. Ciertamente, los genes comunes relacionados con la neurodegeneración deben considerarse al identificar una posible causa de una enfermedad, independientemente de la enfermedad con la que estén asociados. Los pacientes con ELP, ELA o paraparesia espástica deben ser investigados para detectar mutaciones en PSEN1. En PKD, la filtración, priorización y validación de secuenciación de Sanger identificaron una nueva variante c.C316T p.Q106* en PRRT2 (PRRT2Q106*) como la causa probable de la enfermedad en la familia UGM478. Los datos clínicos de la familia apoyan el diagnóstico de PKD. La evaluación de los resultados de WES conduce a una fuerte sospecha de PRRT2Q106* como mutación causante de la enfermedad. Las mutaciones en PRRT2 son la única causa conocida de PKD hasta el momento y, a menudo, son mutaciones truncadas que conducen a una haploinsuficiencia debido a la destrucción del transcripto portador de PTC por la vía NMD. PRRT2Q106* no se encontró en ninguna base de datos, por lo que los únicos datos de frecuencia se obtuvieron a través de nuestro ensayo ASPCR para una población de control de 192 muestras. Ninguno de ellos portaba esta variante, sin embargo, se segregó con la enfermedad en el pedigrí, no estando presente en ninguno de los miembros de la familia que no tenían PKD. De acuerdo con los resultados previos, se encontraron niveles de ARNm significativamente más bajos para las variantes con PTC (PRRT2Q106*, PRRT2Q163*, PRRT2Q250*), en comparación con el tipo silvestre (PRRT2WT), en un modelo celular con PRRT2 y sus variantes sobreexpresadas. PRRT2Q163* y PRRT2Q250* se eligieron como controles, siendo variantes descritas previamente en PRRT2. La inhibición de la ruta NMD, por el tratamiento de células SH-SY5Y transfectadas con NMDI14, aumentó los niveles de ARNm para PRRT2Q106* y PRRT2Q163* y mostró una tendencia creciente para PRRT2Q250*. Esto sugiere que la vía de la NMD puede ser la culpable de la desintegración del ARNm provocada por las PTC en las variantes estudiadas. Curiosamente, los niveles de proteína de la nueva variante PRRT2Q106* eran indetectables con WB antes y después del tratamiento con NMDI14, mientras que las otras variantes estudiadas (PRRT2Q163* y PRRT2Q250*) tenían niveles de proteína significativamente más bajos que el PRRT2WT antes del tratamiento y niveles aumentados después. Esto puede deberse a que las regiones ricas en prolina son importantes para la estabilidad de la proteína, ya que PRRT2Q106* tiene una PTC antes de esa región y PRRT2Q163* y PRRT2Q250* en el medio y después de ella. Estos resultados sugieren que la nueva variante PRRT2Q106* es probablemente la causa de PKD en la familia española UGM478. Los mecanismos moleculares responsables de la aflicción pueden ser la vía NMD que causa la degradación del transcripto que conduce a la haploinsuficiencia. La falta de PRRT2 a su vez provoca hiperexcitabilidad a través de la liberación desregulada de neurotransmisores y la hiperactividad de los canales de Na+. Mecanismos moleculares patológicos comunes, o relacionados, pueden afectar diversos trastornos neurológicos tradicionalmente considerados como no relacionados, en la intrincad
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