A Quantitative 3D Motility Analysis of Trypanosoma brucei by Use of Digital In-line Holographic Microscopy

We present a quantitative 3D analysis of the motility of the blood parasite Trypanosoma brucei. Digital in-line holographic microscopy has been used to track single cells with high temporal and spatial accuracy to obtain quantitative data on their behavior. Comparing bloodstream form and insect form trypanosomes as well as mutant and wildtype cells under varying external conditions we were able to derive a general two-state-run-and-tumble-model for trypanosome motility. Differences in the motility of distinct strains indicate that adaption of the trypanosomes to their natural environments involves a change in their mode of swimming

Three dimensional tracking of exploratory behavior of barnacle cyprids using stereoscopy

Surface exploration is a key step in the colonization of surfaces by sessile marine biofoulers. As many biofouling organisms can delay settlement until a suitable surface is encountered, colonization can comprise surface exploration and intermittent swimming. As such, the process is best followed in three dimensions. Here we present a low-cost transportable stereoscopic system consisting of two consumer camcorders. We apply this novel apparatus to behavioral analysis of barnacle larvae (? 800 lm length) during surface exploration and extract and analyze the three-dimensional patterns of movement. The resolution of the system and the accuracy of position determination are characterized. As a first practical result, three-dimensional swimming trajectories of the cypris larva of the barnacle Semibalanus balanoides are recorded in the vicinity of a glass surface and close to PEG2000-OH and C11NMe3 +Cl- terminated self-assembled monolayers. Although less frequently used in biofouling experiments due to its short reproductive season, the selected model species [Marechal and Hellio (2011), Int Biodeterior Biodegrad, 65(1):92-101] has been used following a number of recent investigations on the settlement behavior on chemically different surfaces [Aldred et al. (2011), ACS Appl Mater Interfaces, 3(6):2085-2091]. Experiments were scheduled to match the availability of cyprids off the north east coast of England so that natural material could be used. In order to demonstrate the biological applicability of the system, analysis of parameters such as swimming direction, swimming velocity and swimming angle are performed.DFG/Ro 2524/2-2DFG/Ro 2497/7-2ONR/N00014-08-1-1116ONR/N00014-12-1-0498EC/FP7/2007-2013/23799

Multiple object tracking with context awareness

[no abstract

Simultaneous two-color imaging in digital holographic microscopy

We demonstrate the use of two-color digital holographic microscopy (DHM) for imaging microbiological subjects. The use of two wavelengths significantly reduces artifacts present in the reconstructed data, allowing us to image weakly scattering objects in close proximity to strongly-scattering objects. We demonstrate this by reconstructing the shape of the flagellum of a single-cell eukaryotic parasite Leishmania mexicana in close proximity to a more strongly-scattering cell body. Our approach also yields a reduction of approximately one third in the axial position uncertainty when tracking the motion of swimming cells at low magnification, which we demonstrate with a sample of Escherichia coli bacteria mixed with polystyrene beads. The two-wavelength system that we describe introduces minimal additional complexity into the optical system, and provides significant benefits

Quantitative Untersuchung der Motilität des Blutparasiten Trypanosoma brucei brucei durch 4D-Tracking mittels digitaler In-line Holographie

In der vorliegenden Arbeit wurde die Motilität des Blutparasiten Trypanosoma brucei brucei untersucht. Dieser vor allem in Subsahara-Afrika verbreitete Organismus wird von der Tsetse-Fliege auf Menschen und Tiere übertragen und löst die unbehandelt tödlich verlaufende Afrikanische Schlafkrankheit aus. Nur wenige Medikamente sind bekannt, diese zeichnen sich jedoch meistens durch das Auftreten schwerer Nebenwirkungen aus. Der Organismus ist lange bekannt und seine Eigenmotilität wird seit langem mit seiner Pathogenität in Verbindung gebracht, trotzdem fehlen bislang weitgehend quantitative Untersuchungen zur Fortbewegung, vor allem der im infizierten Organismus vorkommenden Blutstromformen. Eine Strategie des Parasiten um die Immunantwort des Wirtes zu umgehen ist das „Abwaschen“ an der Zelloberfläche gebundener Antikörper durch gerichtetes Schwimmen. Desweiteren ist die Eigenbewegung von großer Bedeutung für die Zellteilung und damit erfolgreiche Vermehrung des Organismus sowie für die Verteilung im Wirt, da im Endstadium der Krankheit durch den Parasiten aktiv die Blut-Hirn-Schranke passiert wird. Die Kenntnis des zugrundeliegenden Fortbewegungsmechanismus ist also von grundlegender Bedeutung zum Verständnis der Pathogenese und damit zur Entwicklung von Strategien zur medikamentösen Bekämpfung des Erregers im infizierten Wirt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Motilitätsverhalten von Trypanosomen unterschiedlicher Lebenszyklusstadien bei verschiedenen Temperaturen mikroskopisch untersucht. Dazu wurde ein portables, holographisches Mikroskop entwickelt, dass die Vermessung von Trypanosomen bei physiologischen Temperaturen mit hoher Auflösung und Stabilität erlaubt. Die erhaltenen 3D-Daten erlauben erstmals eine quantitative Analyse frei schwimmender Trypanosomen über große Volumina und Zeiträume. Aus den Daten wurden zwei deutlich unterscheidbare Schwimmzustände abgeleitet, für die charakteristische Schwimmparameter, wie mittlere Schwimmgeschwindigkeiten und –winkel sowie typische Ausbreitungsverhalten abgeleitet werden konnten. Die Schwimmzustände konnten durch Referenzmessungen mit Motilitätsmutanten und unter Verwendung spezieller Probenkammern erfolgreich zwei unterschiedlichen Bewegungsmodi der die Trypanosomen antreibenden Struktur, dem Flagellum, zugeordnet werden. Die erhaltenen Daten zeigen deutlich die Adaption der Lebenszyklusstadien an ihre jeweils physiologische Temperatur und stützen eines der postulierten Modelle für die Trypanosomenbewegung, das run-and-tumble-Modell. Sie stellen somit einen wichtigen Beitrag zur Diskussion des Fortbewegungsmechanismus von Trypanosomen dar

How do spores select where to settle? : A holographic motility analysis of Ulva zoospores on different surfaces

Wie entscheiden Sporen, wo sie siedeln? - Eine holographische Bewegungsanalyse von Ulva Zoosporen an Oberflächen mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften Ulva Sporen siedeln auf Oberflächen, um dann makroskopisch sichtbare Algen zu bilden. Dieser Bewuchs auf künstlichen Oberflächen (z.B. Bootsrümpfen) verursacht enorme Kosten, z.B. durch den erhöhten Treibstoffverbrauch von Schiffen. Um die initiale Phase der Besiedlung von Oberflächen, die schließlich zu dem Bewuchs führt, besser zu verstehen, wurde das Bewegungs- und Siedlungsverhalten von Ulva Sporen in Echtzeit und dreidimensional (3D) mittels digitaler in-line Holographie untersucht. Für diese Analyse wurde ein transportables, digitales in-line holographisches Mikroskop gebaut, mit dem die Bewegungsmuster der Algensporen aufgenommen wurden. Weiterhin wurde die Entwicklung, Programmierung und Anwendung einer Analysensoftware, die eine Rekonstruktion der Hologramme sowie eine automatisierte Bestimmung der Sporenpositionen erlaubt, durchgeführt. Auf diese Weise konnte erstmals das Schwimmverhalten von Ulva Sporen und deren Änderung in der Nähe von Oberflächen in 3D bestimmt und quantifiziert werden. Hierfür wurden funktionalisierte Glasoberflächen mit unterschiedlicher Benetzbarkeit sowie unterschiedlicher Attraktivität für Ulva Sporen untersucht: hydrophiles Poly(ethylene glycol) (PEG), hydrophiles Glas (AWG) und mit hydrophoben Fluorooctyltriethoxysilan (FOTS) funktionalisiertes Glas. Bei allen Oberflächen wurde eine Sporenanreicherung bis zu einer Entfernung von mindestens 200µm zur Oberfläche beobachtet. Eine Änderung der Bewegung findet ab einer Entfernung von 50µm zur Oberfläche statt und äußert sich zum Beispiel in einer ausgeprägten Schwimmbewegung parallel zur Oberfläche. Diese Änderung der Schwimmrichtung wird durch hydrodynamische Kräfte in der Nähe von Oberflächen induziert. Für die drei verwendeten Oberflächenchemien können deutliche Unterschiede im Besiedlungsverhalten in Oberflächennähe beobachtet werden: Auf AWG wird ein zeitunabhängiges Explorationsverhalten mit hoher Variabilität detektiert. Für PEG zeigt sich, dass sich die meisten Sporen nach einem kurzen Kontakt mit der Oberfläche wieder von ihr entfernen. Dies führt zu der Hypothese, dass die Algen auf die physikochemische Wechselwirkung ihrer Flagellen mit der Oberfläche reagieren. Das Verhalten auf der besiedlungsreichen FOTS Oberfläche ist zeitabhängig. In der Anfangsphase der Erkundungszeit werden die Sporen an der Oberfläche festgehalten, was vermutlich auf starke hydrophobe Wechselwirkungen zurückzuführen ist. Die meisten dieser „gefangenen“ Sporen schwimmen nach einer Weile wieder zurück in die Lösung. Dennoch werden, im Vergleich zu den anderen beiden Oberflächen, frühzeitig eine relativ große Anzahl permanenter Besiedelungsereignisse beobachtet. Das analysierte Erkundungsverhalten in der Nähe der Oberfläche kann gut mit der integralen Besiedelungskinetik korreliert werden. Mittels der Motilitätsanalyse kann nach einer Aufnahmedauer von nur 2min innerhalb der ersten 5min der Oberflächenerkundungsphase die Besiedelungskinetik sehr gut vorhergesagt werden, die sonst nur in einem 45 minütigen Besiedelungsversuch bestimmt werden konnte. Basierend auf den Ergebnissen der hier vorgestellten Bewegungsanalyse und auf Daten aus früheren Besiedlungskinetik-Studien wird ein Sporen Besiedelungsmechanismus postuliert, der besagt, dass die anfänglich adhärierende Sporen die weitere Sporen-Besiedlung der Oberfläche katalysiere

Long-Term Quantitative Microscopy: From Microbial Population Dynamics to Growth of Plant Roots

Quantitative optical measurements at the micron scale have been crucial to the study of multiple biological processes, including bacterial chemotaxis, eukaryotic gene expression and y development. Extending measurements to long time scales allows complete observation of processes that are otherwise studied piecemeal, such as development and evolution. This thesis describes the development of two types of microscope for making long term, quantitative measurements, and the tools for image analysis. The rst device is a digital holographic microscope for measuring microbial population dynamics. It allows three dimensional localization of hundreds of cells within a mm3 sized volume, at micron resolution and an acquisition period of minutes. The technique is simple and inexpensive, which enabled us to construct ten replicate devices for parallel measurements. Each device incorporates precise and programmable control of light and temperature for the microbial ecosystem. Experiments were performed with the green algae Chlamydomonas reinhardtii and the ciliate Tetrahymena reinhardtii, both together and in isolation, and continued for as long as 90 days. The population dynamics exhibited a striking degree of repeatability, despite the presence of added noise in the illumination, spatial gradients of cell density, convection currents and phenotypic changes of both species. The second device is a thin light sheet fluorescence microscope for tracking nuclei in growing roots of the flowering plant Arabidopsis thaliana. The device incorporates a chamber designed to maintain optical quality while providing conditions for root growth. Optical feedback to a translation stage is used to maintain the root tip in the fi eld of view as the root grows by centimeters over several days. Data from a three day experiment is presented to demonstrate the technique. Over 1,000 nuclei were tracked simultaneously, and hundreds of cell divisions were automatically identif ed. The device was also used to image the regeneration of a root tip after surgical excision. The data corroborate earlier investigations at a more detailed level than was previously possible