The role of Galectin-3 and Survivin in invasion and drug resistance in human cancer

Galectin-3 is an apoptosis-related gene previously found to be over-expressed in invasive tumours and to cause in v itroinvasiveness and metastasis in colon, breast and thyroid follicular cancer cells. Galectin-3 over-expressing clones were obtained following stable transfection of galectin-3 cDNA into the non-invasive human lung carcinoma cell line DLKP. These clones exhibited increased invitro invasiveness and motility and altered cell adhesion properties, but did not exhibit a drug resistant phenotype. Survivin is an antiapoptotic gene highly expressed in all cancer types and during fetal development, but not in most normal adult tissue. To determine whether survivin over-expression plays a role in drug-resistance, transient transfections of survivin cDN into SKOV-3 ‘Tet off , MCF-7 'Tet off and DLKP cells, were carried out. All three transfections resulted in an overexpression of survivin mRNA, but not survivin protein. To further investigate the role o f galectin-3 and survivin in drug resistance and invasiveness, RT-PCR and western blot analysis were carried out on DLKP and RPMI- 2650 cells which had been exposed to sequential pulsing with three (vincristine, taxotere and 5-fluorouracil) and five (vincristine, 5-fluorouracil, CCNU, carboplatin and epirubicin) chemotherapy drugs, respectively. Drug selection of DLKP resulted in two MDR variants, DLKP-taxotere and DLKP-vincristine. The taxotere-resistant variant displayed a highly invasive phenotype. Drug selection of RPMI-2650 cells resulted in unstable MDR variants, with no induction of invasiveness. Galectin-3 expression was examined in the drug-selected variants, along with the expression of the MDR-related genes, by RT-PCR analysis. Galectin-3 mRNA expression was unaltered in all the drug-selected variants of DLKP and RPMI-2650. Survivin expression was examined in the drug-selected variants by RT-PCR and western blot analysis. Survivin protein expression was dramatically down-regulated in DLKP-vincristine and DLKP-taxotere MDR variants. This decrease was not observed at the mRNA level, indicating that this down-regulation of survivin protein may be at the post-transcriptional level in this cell system. In addition, DNA microarray technology was used to investigate differences in gene expression between the DLKP MDR variants and to identify new targets involved in MDR and invasion/metastasis. Results indicated a dramatic increase o f Mdr-1 expression and a slight increase of MRP2 expression in DLKP-taxotere and DLKP-vincristine. The expression of other genes studied were unaltered in the MDR variants compared to the parental cells. Finally, to establish a role for apoptosis-related and drug resistance-related genes as potential clinical markers in breast cancer, the expression of survivin, galectin-3 and MRP1 genes were examined in breast tumour specimens, by RT-PCR analysis. The expression of these genes was correlated with clinicopathological parameters to investigate an association between them and gene expression. As galectin-3 was expressed in almost all the tumour specimens, it was not possible to correlate its expression with any of the parameters. No significant association was detected between disease outcome and the mRNA expression of either survivin or MRP1

Caractérisation de nouvelles voies régulant l’expression et l’activité des protéines Mcl-1 et PUMA

Cancer is a major public health issue, killing millions of people worldwide each year. The inhibition of apoptosis, a programmed cell death, in its onset and development has been well documented, making it one of the hallmarks of cancer. The regulation of the intrinsic (mitochondrial) pathway of apoptosis is regulated by the Bcl-2 (B cell lymphoma-2) family. Up until now, PUMA, a pro-apoptotic protein, was thought to be mainly expressed at the mitochondria, based on experiments where it had been overexpressed. We showed that endogenous PUMA is mainly expressed in the cytosol of activated or resting B cells. However, upon apoptotic stress, PUMA was able to translocate from the cytosol to the mitochondria, in a caspase-independent but p38-dependent manner, allowing PUMA to bind and inhibit the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Mcl-1, and thereby leading to cell death. The anti-apoptotic proteins, especially Mcl-1, are often overexpressed in tumors. Mcl-1 is a protein with a short half-life, degraded rapidly by the proteasome. This degradation is ubiquitin-dependent, requiring E3 ligases (E3). A handful of E3s and one deubiquitinase (DUB), that hydrolyses the ubiquitin chains, have been reported to regulate Mcl-1 expression. However, they were either very poorly expressed or their inhibition had no impact on Mcl-1 expression in our model. We thus undertook to characterize new E3s and DUBs mediating Mcl-1 ubiquitination. After an immunoprecipitation of Mcl-1 in our cells, followed by a mass spectrometry analysis, we identified the DUB USP14. When knockdown, Mcl-1 expression was selectively increased and its stability enhanced. Our results could help build “double-edge” therapies, removing the breaks on apoptosis on one hand via Mcl-1 downregulation while activating it on the other via PUMA translocation.Le cancer est un problème majeur de santé public, tuant chaque année plusieurs millions de personnes. L’inhibition de la mort cellulaire programmée, l’apoptose, est considérée comme l’un des paramètres principaux impliqués dans son initiation et son développement. La régulation de la voie intrinsèque (mitochondriale) de l’apoptose est régulée par la famille Bcl-2. Jusqu’à maintenant, on pensait que la protéine PUMA, une protéine pro-apoptotique, était principalement exprimée au niveau mitochondrial. Nous avons montré qu’à l’état basal, PUMA était exprimé au niveau du cytosol des lymphocytes B humains. Cependant, suite à un signal apoptotique, PUMA est capable de transloquer du cytosol à la mitochondrie, de façon indépendante des caspases mais dépendante de l’activation de la MAPKinase p38, permettant ainsi son interaction avec les protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Mcl-1 dont l’inhibition conduit à l’apoptose. Les protéines anti-apoptotiques, Mcl-1 notamment, sont souvent surexprimées dans les tumeurs. Mcl-1 est une protéine à courte demi-vie, rapidement dégradée par le protéasome. Cette dégradation dépend de son ubiquitination réalisée par des E3 ligases (E3). Quelques E3 et une déubiquitinase (DUB), hydrolysant les chaînes d’ubiquitine, régulant l’expression de Mcl-1 ont été décrites. Cependant, ces protéines sont soit très peu exprimées, soit leur inhibition n’a pas d’impact sur l’expression de Mcl-1 dans notre modèle. Nous avons donc entrepris de caractériser de nouvelles E3 et DUB régulant l’ubiquitination de Mcl-1. Après une immunoprécipitation de Mcl-1 dans nos cellules, suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, nous avons identifié la DUB USP14. Lorsque son expression est diminuée, l’expression et la stabilité de Mcl-1 augmentent de façon sélective. Nos résultats pourraient contribuer à une approche à double-tranchant dans le traitement du cancer, en retirant les freins à l’apoptose via une diminution de l’expression de Mcl-1 d’une part et en l’activant via PUMA de l’autre

The role of p38 MAPK in cell cycle checkpoint control following DNA damage

Ph.DDOCTOR OF PHILOSOPH

The synthesis, isolation and evaluation of novel anticancer and antibacterial therapeutics derived from natural products

This study focused on isolation, synthesis, development and evaluation of novel antimicrobial and anticancer agents from natural product. Natural products have found lead applications in the pharmaceutical industry as sources of chemotherapeutics against cancers and infectious diseases. This investigation focussed on isolating sesquiterpene lactones from natural products, and synthesis of flavonoid based anticancer and antimicrobial agents from the flavonoid – chrysin because sesquiterpene lactones and flavonoids are potent anticancer and antimicrobial agents.In addition to the sesquiterpene lactones – alantolactone (D1) and isoalantolactone (D2), this is the first time costunolide (D3) has been isolated from Inula helenium. A series of 8-novel and 10 known Chrysin-derivatives were also synthesised via microwave-assisted O-alkylation of chrysin and other synthetic methods, and their antimicrobial and anticancer activities investigated.Twenty compounds were screened against eight bacteria and one fungus - Candida albicans using Gentamycin and Fluconazole as standard drugs for antibacterial and antifungal studies. 4-((5-Hydroxy-4-oxo-2-phenyl-4H-chromen-7-yl)oxy)butyl acetate (C1), 7-((3,5-dimethylbenzyl)oxy)-5-hydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one (C2) and 7-(2,4-Dinitrophenoxy)-5-hydroxy-3-phenyl-4H-chromen-4-one (C3) indicated bactericidal inhibition against a broad spectrum of bacteria and Candida albicans; Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus and Enterococcus faecalis were the most susceptible bacteria to inhibition by these compounds. MIC of C1 against these microorganisms was 25, 50, 50 and 50 µg / mL, C2: 50, 100, 100 and 100 µg / mL, C3: 12.5, 12.5, 25.0 and 50 µg / mL. MIC values indicated by these compounds were better than those indicated by chrysin and were comparable to those showed by the standard drug – Gentamycin. C1 and C3 also inhibited the growth of the drug-resistant bacteria MRSA at doses of 65 and 100 µg / mL respectively. Chrysin derivatives also inhibited the growth of extended spectrum beta lactamase (ESBL) bacteria – E. coli, K. pneumoniae and P. aeruginosa. C1 and C3 also showed superior antifungal activity against the pathogenic fungus – Candida albicans at MIC values of 50 µg / mL respectively compared to the standard antifungal drug – Fluconazole (MIC 125 µg / mL). 7-O-bromochrysin and 7-O-alkylchrysin derivatives of chrysin showed weak antimicrobial activities (MIC ≥ 125 µg / mL) against all bacteria and fungus tested. D1, D2 and D3 also inhibited the growth of S. aureus and B. cereus at MIC values ≤ 125 µg / mL. The best antimicrobial agent synthesised were C1 and C3. The antiproliferative activities of D1, D2 and D3 were also investigated in hypoxia and normoxia (under hypoglycaemic and hyperglycaemic conditions). In hypoxia D1, D2 and D3 elicited a 10 to 55-fold significant antiproliferative activity against leukaemia cell line (K562) in hypoglycaemic conditions with cytotoxicity (IC50 values) 0.58, 0.66 and 3.07 µM compared to the antiproliferative activity indicated in hyperglycaemic condition (IC50 values – 0.80, 1.18 and 4.77 µM) respectively. In normoxia (normal oxygen concentration), the IC50 values in hypoglycaemia were 1.80, 1.90 and 6.72 µM for D1, D2 and D3. The IC50 values in hyperglycaemia were 2.60, 3.29 and 7.15 µM for D1, D2 and D3 respectively. The antiproliferative activities indicated by D1, D2 and D3 under the conditions stated above were better than those indicated by the positive control – Chlorpromazine hydrochloride (CPZ) with IC50 values 32.88, 27.05, 9.36 and 16.21 µM respectively. D1, D2 and D3 were selectively cytotoxic against cancer cell lines but not the normal cell line – BEAS-2B. Anticancer activities against colorectal cancer cell lines (HCT 116 and Caco-2) indicated by C1, C2 and C3 (IC50 ≤ 2.0 µM for HCT 116, and IC50 ≤ 6.0 µM for Caco-2 cell line), were better than those indicated by chrysin and the positive control drug – (CPZ) – IC50 4.07 and 5.9 µM respectively, and IC50 4.84 µM (chrysin) and 5.17 µM (CPZ) for Caco-2 cell line. C1, C2 and C3 also elicited better anticancer activities against leukaemia (K562) at concentrations of 7.27 µM, 5.58 µM and 8.69 µM; and mesothelioma (Mero-14) cell lines at concentrations of 7.65 µM, 26.31 µM and 8.71 µM respectively, compared to chrysin (IC50 13.13 µM for K562 cell line and 45.99 µM for Mero-14 cell line) and CPZ (IC50 7.38 µM for K562 cell line and 13.42 µM for Mero-14 cell line). Similarly, C1 and C2 also elicited significant cytotoxic inhibition against the triple-negative breast cancer cell line – MDA-MB 468 at IC50 values 7.49 and 16.59 µM compared to chrysin.Anticancer activities elicited by long-chain 7-O-alkylchrysin derivatives (C10, C11 and C12) against HCT 116 cancer cells (IC50 16.4, 17.5 and 18.9 µM) was comparable to those indicated by chrysin and CPZ (IC50 5.9 µM). C16 and C17 also elicited good to moderate cytotoxic inhibition against a broad spectrum of the ten cancer cell lines tested. Interestingly, C1, C2 and C3 were selectively cytotoxic against cancer cell lines but not the normal cell line – BEAS-2B. Chrysin was selectively cytotoxic but CPZ killed both cancer and normal cell lines. D1, D2 and D3 also indicated anticancer inhibition against K562 cell lines during hypoxia and normoxia, and during hyperglycaemia and normoglycaemia. Anticancer inhibition during hypoxia and low glucose for D1 and D2 (IC50 ≤ 0.66 µM) was better than the anticancer inhibition elicited in normoxia and low glucose concentrations (IC50 ≤ 1.8 and 1.9 µM respectively).In this study, novel anticancer and antimicrobial agents which elicited better bioactivity and solubilities compared to standard antimicrobial agents (Gentamycin and Fluconazole), anticancer positive control agent (Doxorubicin) and chrysin (the parent compound) have been synthesised. Furthermore, hyperglycaemia in normoxic condition was associated with rapid cell proliferation in contrast to hypoxia in hypoglycaemic condition. Compounds isolated in this study were more cytotoxic under hypoxic conditions. Costunolide was isolated for the first time from Inula helenium. In-vivo cytotoxicity studies of costunolide against leukaemia cell line – K562 in mammalian models is necessary. Some modified chrysin-derivatives also indicated significant cytotoxicity in-vitro. In-vivo cytotoxicity studies using mammalian model is also required. Synthesised chrysin derivatives were selectively cytotoxic against cancer cell lines but were not toxic against normal cell line at IC50 ≤ 100 µM. From the structure–activity point of view, nature and position of the electron withdrawing and electron donating functional groups on the chrysin core might have contributed to the observed antibacterial and anticancer action.The observed anticancer activity of alantolactone, isoalantolactone, costunolide, C1, C2, C3, C6, C8 and C10 and the antimicrobial activity of C1, C2 and C3 makes them an attractive drug candidate than chrysin and shows that substitution at the 7-OH position of chrysin could enhance the bioactivity of chrysin

Desarrollo y evaluación toxicológica de nuevos materiales para su aplicación en la conservación de alimentos.

En la actualidad, la industria alimentaria está apostando por la incorporación de sustancias naturales a envases alimentarios con el fin de incrementar la perdurabilidad del alimento en el mercado. Debido al empleo de estas sustancias en esta nueva aplicación, la seguridad de los consumidores y del medio ambiente puede verse comprometida debido a una mayor exposición, desconociéndose en gran medida, hasta el momento, las posibles consecuencias. De entre las sustancias naturales seleccionadas por la industria alimentaria para este fin, destacan las arcillas y minerales de arcillas, y los aceites esenciales y sus respectivos componentes mayoritarios, constituyendo las primeras (arcillas) el principal objeto de estudio de la presente Tesis Doctoral. Por todo ello, decidimos realizar una evaluación toxicológica mediante una batería de ensayos tanto in vitro como in vivo, para investigar los posibles efectos tóxicos que pueden desencadenarse tras la exposición a estas sustancias, tanto puras como ya incorporadas en el envase. La relevancia de la información toxicológica de estas sustancias es tal que constituye un requisito reglamentario por parte de las autoridades competentes antes de su comercialización. En el caso de las arcillas y minerales de arcilla, se ha demostrado una mejora de las propiedades mecánicas, térmicas y barrera de las matrices poliméricas debido a su incorporación, lo que está, íntimamente relacionado con el incremento de la vida útil de los alimentos. Con el fin de contextualizar la situación ante la que se encontraban las arcillas y sus derivados en el área del envasado de la industria alimentaria y así abordar posteriores estudios, nos pareció importante realizar una exhaustiva revisión bibliográfica sobre los datos de toxicidad publicados en la literatura científica hasta la actualidad. La disparidad de los resultados disponibles hasta el momento hace necesaria una evaluación toxicológica caso por caso. Diferentes parámetros pueden estar involucrados en la respuesta obtenida, incluyendo: (i) condiciones de exposición tales como concentraciones seleccionadas o tiempos ensayados; (ii) modelos experimentales elegidos; (iii) modificadores o surfactantes incorporados a la estructura de la arcilla, (iv) sensibilidad de los ensayos llevados a cabo, etc. Dicha revisión bibliográfica ha dado lugar a la siguiente publicación: •TOXICOLOGICAL EVALUATION OF CLAY MINERALS AND DERIVED NANOCOMPOSITES: A REVIEW. (Maisanaba y col., 2015; Environmental Research 138, 233-254). La vía de exposición más importante en el contexto que nos engloba es la vía oral, dado que las arcillas van a ser incorporadas a un envase que posteriormente se va a poner en contacto con un alimento, y éste último será ingerido por los consumidores. En este caso los órganos que principalmente se podrían ver afectados serán los que componen el sistema digestivo, destacando entre ellos el intestino, encargado de la absorción de nutrientes, y el hígado, crucial en la biotransformación de xenobióticos. Se llevó a cabo una batería de ensayos de los materiales objeto de estudio con el fin de esclarecer sus principales efectos tóxicos, teniendo en cuenta la escasez y disparidad de los datos disponibles. Las líneas celulares seleccionadas fueron una línea celular de hepatoma humano (HepG2) y una línea celular de adenocarcinoma de colon (Caco-2). Éstas fueron expuestas a diversas arcillas no modificadas y modificadas con sales de amonio cuaternario, tanto comercializadas (Cloisite®Na+ (CNa+), Cloisite®20A (C20A) y Cloisite®30B (C30B)) o desarrolladas por el Instituto Tecnológico de Embalaje, Transporte, y Logística (ITENE) de Valencia (Clay1 y Clay2). Los experimentos llevados a cabo incluyeron la evaluación de: citotoxicidad basal, análisis de la morfología celular, genotoxicidad (ensayo cometa y ensayo de micronúcleos (MN)) y estrés oxidativo (producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y contenido de glutatión (GSH)). De forma general se obtuvo ausencia de toxicidad en el caso de las arcillas CNa+, C20A y Clay1, y sólo en el caso de la primera arcilla mencionada se obtuvo una inducción de MN significativa y alguna alteración de la morfología celular. Sin embargo, pudimos observar daño en ambas líneas celulares tras la exposición a C30B y Clay2 en la mayoría de los parámetros evaluados. Además, se ha llevado a cabo por primera vez en la línea celular HepG2 el estudio de la influencia de las arcillas en la modulación de la expresión génica de un extenso grupo de genes involucrados en activación/destoxicación y otros mecanismos de acción tóxica. CNa+ y Clay2 sí demostraron alterar la regulación de distintos genes, no así C30B y Clay1. Los resultados de estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: •IN VITRO TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF CLAYS FOR THEIR USE IN FOOD PACKAGING APPLICATIONS. (Maisanaba y col., 2013, Food and Chemical Toxicology 37, 266-275). •GENETIC POTENTIAL OF MONTMORILLONITE CLAY MINERAL AND ALTERATION IN THE EXPRESSION OF GENES INVOLVED IN TOXICITY MECHANISMS IN THE HUMAN HEPATOMA CELL LINE HEPG2. (Maisanaba y col., 2015; Journal of Hazardous Materials (en revision/ under revision)). •INDUCTION OF MICRONUCLEI AND ALTERATION OF GENE EXPRESSION BY AN ORGANOMODIFIED CLAY IN HEPG2 CELLS. (Maisanaba y col., 2015; Archives of Toxicology (en revisión/ under revision)). •EFFECTS OF TWO ORGANOMODIFIED CLAYS INTENDED TO FOOD CONTACT MATERIALS ON THE GENOMIC INSTABILITY AND GENE EXPRESSION OF HEPATOMA CELLS. (Maisanaba y col., 2015); Toxicology Letters (en revision/ under revision). •TOXIC EFFECTS OF A MODIFIED MONTMORILLONITE CLAY ON THE HUMAN INTESTINAL CELL LINE CACO-2. (Maisanaba y col., 2014; Journal of Applied Toxicology 34, 714-725). •TOXICITY ASSESSMENT OF ORGANOMODIFIED CLAYS USED IN FOOD CONTACT MATERIALS ON HUMAN TARGET CELL LINES. (Houtman y col., 2014; Applied Clay Science 90, 150-158). Aunque los órganos y tejidos del sistema digestivo serían probablemente los más afectados por exposición a las arcillas, hay otras dianas que también podrían verse dañadas, destacando el tejido endotelial vascular, involucrado en la distribución y absorción. Hasta el momento los datos disponibles acerca de los efectos de este modelo experimental expuesto a arcillas son limitados. Por ello, se ha llevado a cabo la evaluación de la viabilidad de la línea celular endotelial de vena umbilical humana (HUVEC) expuestas a CNa+, C30B, Clay1 y Clay2. Los resultados obtenidos indicaron que las células HUVEC seguían un patrón de respuesta muy similar al de HepG2 y Caco-2 ante la exposición a las arcillas, presentando una sensibilidad parecida a la línea celular hepática. Además, el estudio del potencial mutagénico mediante el Test de Ames es una prueba exigida antes de la comercialización de cualquier producto que vaya a entrar en contacto con alimentos (EFSA 2011b, 2015), siendo en este caso necesaria la evaluación de las arcillas que estén destinadas a ser incorporadas al envasado alimentario. El modelo experimental seleccionado fue Salmonella typhimurium (5 cepas), el cual se expuso a las cuatro arcillas mencionadas, en ausencia y presencia de fracción metabólica externa. Únicamente pudimos observar una respuesta mutagénica positiva en el caso de C30B y Clay1. Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente publicación: •CYTOTOXICITY AND MUTAGENICITY ASSESSMENT OF ORGANOMODIFIED CLAYS POTENTIALLY USED IN FOOD PACKAGING. (Maisanaba y col., 2015; Toxicology In Vitro 29, 1222-1230).La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) no sólo propone la evaluación de los materiales que se incorporan a las matrices poliméricas de envasado, sino también, siendo incluso de mayor importancia, la evaluación de los envases resultantes (EFSA, 2011a,b). En este sentido, ITENE desarrolló dos materiales nanocompuestos basados en ácido poli(láctico) (PLA) y Clay1/Clay2, ambas arcillas diseñadas por ellos. Con estos materiales se llevaron a cabo ensayos de migración, utilizando como simulante alimentario agua destilada, aceptado por el Reglamento UE Nº 10/2011 dado el tipo de alimentos hacia los que van dirigidos los mismos (hidrófilos). Una vez obtenidos los extractos de migración de PLA-Clay1 y PLA-Clay2, se evaluaron distintos parámetros con el fin de determinar los posibles efectos tóxicos debido a la migración de las arcillas tras la exposición a los mismos. En este sentido, se evaluó la viabilidad celular de HepG2 y Caco-2 expuestas a ambos extractos, así como el potencial mutagénico de los mismos mediante el Test de Ames. En los ensayos llevados a cabo se observó la ausencia de citotoxicidad y mutagenicidad en las condiciones ensayadas. Por otro lado, teniendo en cuenta que la presencia de los metales mayoritarios de la estructura de las arcillas son Al, Ca, Fe, Mg y Si, se evaluó el contenido de los mismos en los extractos de migración mediante Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente (ICPMS) y Espectroscopía de Plasma Inductivo acoplado a Espectroscopía de Emisión Óptica (ICP-OES), no obteniéndose diferencias significativas con respecto al grupo control. Estos resultados se recogen en la siguiente publicación: •CYTOTOXICITY AND MUTAGENICITY STUDIES ON MIGRATION EXTRACTS FROM NANOCOMPOSITES WITH POTENTIAL USE IN FOOD PACKAGING. (Maisanaba y col., 2014 Food and Chemical Toxicology 66, 366-372). Una vez realizado el estudio toxicológico in vitro de las arcillas y considerando las mejoras tecnológicas presentadas por los polímeros nanocompuestos resultantes, se seleccionó la arcilla de mejor perfil toxicológico y tecnológico, siendo en este caso Clay1 la seleccionada para continuar la investigación. Con el fin de completar los resultados obtenidos in vitro y dada la escasez de información in vivo, se realizó un ensayo de toxicidad subcrónica durante 90 días en ratas Wistar expuestas a Clay1 (40 mg/kg/día) en la dieta y su extracto de migración (PLA-Clay1) como agua de bebida (ad libitum). En este sentido, transcurrido el periodo de exposición, los animales fueron sacrificados y se extrajeron sus órganos (hígado, riñón, intestino, cerebro, corazón, testículos, pulmones y bazo) y sangre mediante punción cardiaca. Se evaluaron una serie de parámetros, incluyendo: análisis histopatológico de todos los tejidos, bioquímica clínica del suero sanguíneo, liberación de interleucina 6 (IL-6), biomarcadores involucrados en la respuesta del posible estrés oxidativo generado en hígado y riñón, tales como la ratio glutatión reducido/glutatión oxidado (GSH/GSSG), peroxidación lipídica (LPO), y actividades de enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión–S-transferasa (GST). Además, la expresión génica y abundancia proteica de SOD y CAT en hígado y riñón también fueron evaluadas. Podemos destacar un aumento de la actividad de CAT en riñón, así como de expresión génica y abundancia proteica, observado tras la exposición a Clay1. El resto de los marcadores evaluados tras la exposición a la arcilla o al extracto no se vieron afectados. Por otro lado, nos pareció interesante evaluar el contenido de los metales característicos de la composición de la arcilla en bazo de ratas expuestas a la arcilla y el extracto, no hallando diferencias notables con respecto a las ratas controles. Los resultados obtenidos en estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: •EFFECTS OF THE SUBCHRONIC EXPOSURE TO AN ORGANOMODIFIED CLAY MINERAL FOR FOOD PACKAGING APPLICATIONS ON WISTAR RATS. (Maisanaba y col., 2014; Applied Clay Science 95, 37-40). •IN VIVO EVALUATION OF ACTIVITIES AND EXPRESSION OF ANTIOXIDANT ENZYMES IN WISTAR RATS EXPOSED FOR 90 DAYS TO A MODIFIED CLAY. (Maisanaba y col., 2014; Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A: Current Issues 77,456-466). •IN VIVO TOXICITY EVALUATION OF THE MIGRATION EXTRACT OF AN ORGANOMODIFIED CLAY-POLY(LACTIC) ACID NANOCOMPOSITE. (Maisanaba y col., 2014; Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A: Current Issues 77,731-446). •EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD DE UNA ARCILLA MODIFICADA Y SU EXTRACTO DE MIGRACIÓN EN BAZO DE RATAS WISTAR EXPUESTAS DE FORMA SUBCRÓNICA. (Maisanaba y col., 2013 Revista de Toxicología 30, 125- 130). Para la realización de esta Tesis Doctoral, la doctoranda realizó una estancia de investigación en ITENE, bajo la dirección de las Dras. Susana Aucejo y María Jordá, en la que se abordaron varios objetivos. Durante la estancia, se llevó a cabo el desarrollo de nuevas arcillas basadas en CNa+ modificadas con silanos, Clay3, Clay4A y Clay4B, destinadas al envasado. La caracterización de las mismas se realizó por espectroscopía de infrarrojos (FTIR), difracción de rayos X y termogravimetría (TGA). Los resultados preliminares mostraron una buena incorporación de los modificadores y mejoraron el perfil tecnológico de la arcilla original no modificada. Posteriormente, se evaluó la toxicidad de las tres arcillas sintetizadas. Los biomarcadores estudiados incluyeron citotoxidad basal, genotoxicidad (mediante el ensayo cometa) y estrés oxidativo (producción de ERO y contenido de GSH) en las líneas HepG2 y Caco-2. Por otro lado, también se determinó mediante citometría de flujo el posible mecanismo de muerte celular de células Caco-2 expuestas a Clay4A y Clay4B. Además, se evaluó el potencial mutagénico de las arcillas mediante el Test de Ames. De forma general, los resultados preliminares dieron lugar a una ausencia de efectos tóxicos por parte de Clay3, sin embargo, tanto Clay4A y Clay4B mostraron toxicidad en la mayoría de los parámetros ensayados. Dado que Clay3 fue la arcilla con mejor perfil tecnológico y toxicológico ésta fue seleccionada para realizar ensayos de vida útil, observándose un incremento de aproximadamente 24h en comparación con el control. Por otro lado, se valoró la migración de metales (Al, Ca, Fe, Mg y Fe) en dos simulantes diferentes, etanol al 10% e isooctano, procedentes de materiales nanocompuestos de polipropileno (PP) más Clay3 o PP-Clay4A. En todos los casos se obtuvieron diferencias con el control en alguno de los metales determinados. Los resultados obtenidos en estos experimentos darán lugar a diferentes publicaciones, aún pendientes de envío: •DEVELOPMENT, CHARACTERIZATION AND CYTOTOXICITY OF NOVEL SILANES MODIFIED CLAYS INTENDED TO PACKAGING (Título provisional). •TOXICITY EVALUATION OF A NEW SILANE-MODIFIED CLAY AND ITS MIGRATION EXTRACT FROM A NANOCOMPOSITE INTENDED TO FOOD PACKAGING (Título provisional). •TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF TWO SILANE-MODIFIED CLAYS IN HUMAN HEPATOMA CELLS AND SALMONELLA TYPHIMURIUM STRAINS (Título provisional). •CYTOTOXICITY, OXIDATIVE STRESS AND GENOTOXICITY ASSAYS OF SILANES-MODIFIED CLAYS IN THE HUMAN INTESTINAL CELL LINE CACO-2 (Título provisional). En relación a los aceites esenciales y sus componentes mayoritarios, también éstos están teniendo un gran auge en la industria alimentaria, empleándose en un nuevo tipo de envasado conocido como envasado activo. En este sentido, en vez de dar lugar a mejoras tecnológicas en sí como en el caso de las arcillas, lo que se aprovecha de estos aceites y sus componentes es su potencial antioxidante y antimicrobiano natural. Sin embargo, debe ser establecido un rango de concentraciones seguro para evitar los posibles efectos contraproducentes que puedan desencadenarse por un abuso de los mismos. En primer lugar, vimos necesario realizar una contextualización del uso actual de este tipo de envasado y las propiedades antimicrobianas y antioxidantes que presentan, así como una revisión de los principales efectos citotóxicos en diferentes líneas celulares de origen humano. Dicha revisión ha dado lugar a la presente publicación: •NEW ADVANCES IN ACTIVE PACKAGING INCORPORATED WITH ESSENTIAL OILS OR THEIR MAIN COMPONENTS FOR FOOD PRESERVATION. (Maisanaba y col., 2015. Food Reviews International (en revisión, under revision). Por último, la evaluación de los componentes mayoritarios de los aceites esenciales antes de ser incorporados a los envases es también obligatoria, tal y como establece la EFSA (EFSA, 2011b). En este sentido, el aceite esencial de orégano es uno de los más utilizados por sus destacadas propiedades antimicrobianas, siendo timol y carvacrol sus dos componentes mayoritarios. Existen en la bibliografía resultados sobre sus perfiles genotóxicos obtenidos por otros autores (Azizan y Blevins, 1995; Stammati y col., 1999; Ipek y col., 2005; Buyukleyla y Recuzogullari, 2009; Llana-Ruíz-Cabello y col., 2014). Estos resultados son dispares en algunos aspectos, siendo necesaria una evaluación de su toxicidad más amplia con el fin de esclarecer el perfil genotóxico de estos dos compuestos mayoritarios. Por consiguiente nos pareció interesante llevar a cabo el ensayo de MN, y, por primera vez, elensayo de Linfoma de Ratón. Los resultados obtenidos no mostraron una relevancia biológica notable para ninguno de los compuestos bajo las condiciones ensayadas. Dichos resultados se reflejan en la siguiente publicación: •IN VITRO GENOTOXICITY TESTING OF CARVACROL AND THYMOL USING THE MICRONUCLEUS AND MOUSE LYMPHOMA ASSAYS. (Maisanaba y col., 2015; Mutation Research 784-785, 37-44).Premio Extraordinario de Doctorado U