Assessment of mammary adiposity in breast cancer using digital pathology

L'obesit\ue0 \ue8 un fattore di rischio significativo per molti tumori, compreso il carcinoma della mammella. I pazienti con carcinoma della mammella che sono sovrappeso o obesi hanno un aumentato rischio di recidiva e di mortalit\ue0 correlata al tumore. Sebbene siano state proposte diverse ipotesi per descrivere i meccanismi biologici alla base dell\u2019interazione tra obesit\ue0 e carcinoma della mammella, i progressi nella comprensione del microambiente tumorale e del ruolo degli adipociti presenti in esso e della loro rilevanza per lo sviluppo e la progressione tumorale o per l'emergere di resistenze alle terapie sono ancora limitati. Parallelamente alle importanti scoperte sull'obesit\ue0 come fattore di rischio per diverse malattie e tipi di tumore, i ricercatori hanno iniziato a utilizzare la patologia digitale per caratterizzare il microambiente tumorale. Studi pionieristici hanno scoperto l'esistenza di un tipo particolare di adipociti chiamati adipociti associati al tumore presenti nel microambiente di tumori che crescono a stretto contatto con il tessuto adiposo. Nel momento in cui \ue8 stata scritta questa tesi, solo pochi studi con piccole coorti di pazienti e spesso, un numero limitato di adipociti analizzati, per lo pi\uf9 distanti dal tumore, hanno mostrato la rilevanza del tessuto adiposo e degli adipociti come componente del microambiente tumorale. Tuttavia, allo stato attuale manca ancora una conoscenza approfondita del ruolo degli adipociti nel carcinoma della mammella. Lo studio presentato in questa tesi descrive le potenzialit\ue0 della patologia digitale e fornisce una rappresentazione dello stato dell'arte sui software con algoritmi dedicati per la misurazione degli adipociti, con una attenzione per gli adipociti presenti nel microambiente di carcinomi mammari. Oltre a stabilire criteri istopatologici per l'analisi degli adipociti, i risultati presentati dimostrano che \ue8 possibile effettuare l'analisi degli adipociti associati al tumore come di quelli distanti, utilizzando un software di patologia digitale. Inoltre, abbiamo mostrato che gli adipociti associati al tumore sono pi\uf9 piccoli degli adipociti distanti, riflettendo il processo di delipidazione subito dagli stessi. Infine, l'indice di massa corporea del paziente \ue8 associato alle dimensioni degli adipociti distanti e associati al tumore, fornendo nuove prospettive per la valutazione dell'adiposit\ue0 mammaria di un paziente. I dati qui presentati, sono preliminari per un cambiamento diretto nella pratica clinica, ma forniscono i criteri per eseguire l'analisi degli adipociti su coorti pi\uf9 ampie di pazienti ed evidenziano l\u2019importanza della valutazione del tessuto adiposo nella gestione del carcinoma della mammella.Increased adiposity is a significant risk factor for many cancers, including breast cancer. Patients with breast cancer who are overweight or obese have an increased risk of recurrence, and breast cancer-related mortality. While several hypotheses have been proposed to explain the biological mechanisms that drive the obesity-breast cancer interconnections, progress in our understanding of the adipose tissue tumor microenvironment and its relevance to breast cancer initiation and progression or the emergence of resistance to therapy has been limited. In parallel to major breakthroughs on the increased adiposity as risk factor for several diseases and cancers, researchers have begun to utilize digital pathology to characterize the tumor microenvironment in diverse types of adipose tissue-rich neoplasia. Pioneering studies have uncovered the existence of a peculiar type of adipocytes named cancer-associated adipocytes in the microenvironment of tumors that grow in close contact with adipose tissue. At the time this thesis was started, only a few studies with small cohorts of patients and often, a limited number of adipocytes analyzed, mostly distant from the tumor, have shown the importance of the adipose tissue tumor microenvironment. However, an in-depth knowledge was currently lacking for breast cancer. The work presented here harnesses the strength of digital pathology and state of the art of adipocyte measurement tools to analyze adipocytes in the adipose tissue microenvironment of breast cancer. Beyond providing histopathological criteria for adipocyte analysis, these results suggest that the analysis of mammary cancer-associated adipocytes is feasible using image analysis software. Moreover, our analyses reveal that cancer-associated adipocytes are smaller than distant adipocytes, reflecting the delipidation process undergone by cancer-associated adipocytes. The body mass index of the patient is associated with the size of distant and cancer-associated adipocytes giving new insights in the evaluation of mammary adiposity of a patient. The data presented here are too preliminary to derive practice-changing evidence but provide the basis for performing adipocyte analysis on larger number of patients and support the concept that the evaluation of adipose tissue should be taken into account in breast cancer management

Improving biomarker assessment in breast pathology

The accuracy of prognostic and therapy-predictive biomarker assessment in breast tumours is crucial for management and therapy decision in patients with breast cancer. In this thesis, biomarkers used in clinical practice with emphasise on Ki67 and HER2 were studied using several methods including immunocytochemistry, in situ hybridisation, gene expression assays and digital image analysis, with the overall aim to improve routine biomarker evaluation and clarify the prognostic potential in early breast cancer. In paper I, we reported discordances in biomarker status from aspiration cytology and paired surgical specimens from breast tumours. The limited prognostic potential of immunocytochemistry-based Ki67 scoring demonstrated that immunohistochemistry on resected specimens is the superior method for Ki67 evaluation. In addition, neither of the methods were sufficient to predict molecular subtype. Following this in paper II, biomarker agreement between core needle biopsies and subsequent specimens was investigated, both in the adjuvant and neoadjuvant setting. Discordances in Ki67 and HER2 status between core biopsies and paired specimens suggested that these biomarkers should be re-tested on all surgical breast cancer specimens. In paper III, digital image analysis using a virtual double staining software was used to compare methods for assessment of proliferative activity, including mitotic counts, Ki67 and the alternative marker PHH3, in different tumour regions (hot spot, invasive edge and whole section). Digital image analysis using virtual double staining of hot spot Ki67 outperformed the alternative markers of proliferation, especially in discriminating luminal B from luminal A tumours. Replacing mitosis in histological grade with hot spot-scored Ki67 added significant prognostic information. Following these findings, the optimal definition of a hot spot for Ki67 scoring using virtual double staining in relation to molecular subtype and outcome was investigated in paper IV. With the growing evidence of global scoring as a superior method to improve reproducibility of Ki67 scoring, a different digital image analysis software (QuPath) was also used for comparison. Altogether, we found that automated global scoring of Ki67 using QuPath had independent prognostic potential compared to even the best virtual double staining hot spot algorithm, and is also a practical method for routine Ki67 scoring in breast pathology. In paper V, the clinical value of HER2 status was investigated in a unique trastuzumab-treated HER2-positive cohort, on the protein, mRNA and DNA levels. The results demonstrated that low levels of ERBB2 mRNA but neither HER2 copy numbers, HER2 ratio nor ER status, was associated with risk of recurrence among anti-HER2 treated breast cancer patients. In conclusion, we have identified important clinical aspects of Ki67 and HER2 evaluation and provided methods to improve the prognostic potential of Ki67 using digital image analysis. In addition to protein expression of routine biomarkers, mRNA levels by targeted gene expression assays may add further prognostic value in early breast cance

Endometriosis

Endometriosis is a common and serious disease that is estimated to cost the world economy $9.7 billion a year. Most of these costs come from lost productivity at work. As such, it is important to help women receive earlier diagnosis and more effective treatment. This book presents a comprehensive overview of endometriosis, including information on molecular diagnostics and imaging methods for early detection as well as new, less-invasive treatments that preserve women’s fertility

Papel funcional y potencial terapéutico de los sistema somatostatina y ghrelina y sus variantes de splicing en tumores de próstata

El cáncer es una de las amenazas más serias y complejas para la salud de la población mundial1. En concreto, el cáncer de próstata es el segundo tipo de tumor solido más frecuente entre los hombres, y causa 300.000 muertes al año en todo el mundo1. Desde su aparición en la década de los 90, el test del PSA (“antígeno prostático específico”) revolucionó el diagnóstico del cáncer de próstata, incrementado el número de pacientes diagnosticados en una fase temprana de la enfermedad 1,2. Sin embargo, debido a la compleja biología y heterogeneidad de los tumores prostáticos, la mayoría de los tumores detectados por el test del PSA presentan una baja agresividad y la probabilidad de que el paciente muera debido a su desarrollo también es relativamente baja 2-4. Desafortunadamente, el tratamiento de tumores de “baja agresividad” puede producir por sí mismo más efectos secundarios que el propio tumor2. Además, debido a que el PSA se puede elevar por causas benignas (prostatitis, toma de medicamentos, etc) presenta un elevada proporción de falsos positivos2. Aunque se están estudiando en la actualidad otros biomarcadores, ninguno de ellos ha mostrado evidencia clínica suficiente como para justificar su uso y, por tanto, se requieren nuevos biomarcadores que complementen y/o mejoren el uso del test de PSA2,5. El cáncer de próstata depende de la estimulación androgénica para su supervivencia y proliferación celular6. En la clínica del cáncer de próstata se pueden diferenciar dos fases: una primera fase en la cual los pacientes se tratan hormonalmente con el objetivo de bloquear la producción de andrógenos mediante anti-andrógenos o con análogos o antagonistas de LHRH7, y una segunda fase conocida como “cáncer de próstata resistente a la castración” (en inglés CRPC “Castration-Resistant Prostate Cancer”), en la cual los tumores se vuelven resistentes a la terapia hormonal6. Actualmente se concede un papel vital a los andrógenos residuales tras la castración y al receptor de andrógenos en la biología del CRPC8,9. De hecho, la aparición de formas truncadas de splicing aberrante del receptor de andrógeno (AR-V7) es uno de los fenómenos más importantes de esta fase, y actualmente, su presencia se considera como un marcador de prognosis e indicador de resistencia a la terapia hormonal10-12. Numerosos neuropéptidos, como los pertenecientes a la familia de factores reguladores del eje hipotálamo-hipofisario, desempeñan multitud de funciones en diversos tejidos bajo condiciones normales o en situaciones patológicas, como el cáncer. Una característica común de muchas de estas situaciones endocrino-metabólicas es la presencia atípica/ectópica, la alteración y/o la pérdida total/parcial de moléculas que, como los neuropéptidos y sus receptores, pueden controlar la función de estas células. De hecho, numerosos estudios indican que los procesos de splicing alternativo, y en particular la aparición de formas de splicing no canónico o aberrante, contribuyen al desarrollo de las patologías tumorales, y en muchos casos son potenciales biomarcadores de la enfermedad, como es el caso de las variantes del receptor de andrógeno en cáncer de próstata. En este sentido, el objetivo de la tesis doctoral se ha centrado en estudiar la presencia y el papel funcional que ejercen dos sistemas pleiotrópicos de control del organismo; en concreto, el sistema formado por la somatostatina (SST), la cortistatina (CORT) y receptores (sst1-5), incluyendo las variantes de splicing sst5TMD4/5, y el sistema de la ghrelina y sus receptores (GHSR1a/b), que incluye la variante de splicing In1-ghrelina, y la enzima GOAT, en muestras humanas de próstata sana y de cáncer de próstata. Asimismo, se evaluó la utilidad de algunas de estas moléculas como nuevos biomarcadores de diagnosis y/o prognosis de la enfermedad, y su potencial terapéutico en cáncer de próstata. 2. Contenido de la investigación El análisis inicial mediante la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) de la expresión de los sistemas somatostatina y ghrelina demostró una profunda desregulación de algunos de los componentes de ambos sistemas en cáncer de próstata. Concretamente, se encontró que los receptores sst1 y sst5TMD4 del sistema somatostatina, y la enzima GOAT y la forma de splicing alternativo In1-ghrelina del sistema ghrelina, se encuentran significativamente sobreexpresados en tejidos tumorales prostáticos. La sobreexpresión del receptor sst1 ha sido previamente publicada y se relaciona con la agresividad de la enfermedad13. Por el contrario, nuestros resultados son los primeros que demuestran la sobreexpresión de sst5TMD4, In1-ghrelina y GOAT en cáncer de próstata. La sobreexpresión del receptor truncado sst5TMD4 fue especialmente significativa en los pacientes con presencia de metástasis y con peor prognosis, pudiendo ser por ello un nuevo biomarcador de agresividad. Este resultado fue descubierto inicialmente con la técnica de qPCR y se corroboró después a nivel proteico en otra cohorte de pacientes mediante la técnica de inmunohistoquimica (IHQ). Posteriormente, se analizaron las consecuencias que podría ejercer la sobreexpresión de sst5TMD4 en cáncer de próstata. Para ello, se usaron modelos in vitro (líneas celulares de cáncer de próstata andrógeno-dependientes y líneas resistentes a la castración) e in vivo (xenotransplantes en ratones inmunodeprimidos) para demostrar que la sobreexpresión de sst5TMD4 incrementa claramente la malignidad de las células prostáticas tumorales (ej. proliferación y migración celular) y que dichos efectos se llevaban a cabo a través de la modulación de diversas vías de señalización celular claves en la biología del cáncer de próstata (ej. MAPK/ERK, MAPK/JNK, MYC/MAX, WNT, RB y TGF-β14), y de la desregulación de la expresión de oncogenes (ej. CAV1, IL-6) y genes supresores de tumores (ej. CDKN2A, APC, SFRP1, NRIP1, RARB, LOXL1). Finalmente, y con el objetivo de demostrar el potencial terapéutico de sst5TMD4 en cáncer de próstata, se silenció la expresión endógena de sst5TMD4 mediante el diseño, validación y utilización de un siRNA (“ARN pequeño de interferencia”) específico para la secuencia de sst5TMD4. El silenciamiento disminuyó la proliferación y migración celular de las células en comparación con células control. Por su parte, la expresión de la enzima GOAT se encontró incrementada en muestras tumorales prostáticas respecto a controles, y dicha expresión se correlacionó con parámetros metabólicos de los pacientes tales como el peso, su índice de masa corporal (IMC) o la presencia de dislipidemia. Este resultado se corroboró a nivel proteico, mediante IHQ, con un anticuerpo específico de GOAT. La sobreexpresión de GOAT se observó también al comparar líneas celulares de cáncer de próstata respecto a líneas celulares de próstata normal. Además, por primera vez se demostró que las células prostáticas tumorales son capaces de secretar enzima GOAT y que el tratamiento con diferentes señales metabólicas (ej. insulina, IGF-1, ghrelina y/o In1-ghrelina) regulan su expresión en la próstata. Mediante un ELISA específico se descubrió que los niveles de esta enzima están aumentados en el plasma y orina de pacientes con cáncer de próstata respecto a controles y que se correlacionan con factores de agresividad de la enfermedad, así como con diferentes parámetros metabólicos, tales como la presencia de diabetes y dislipidemia. Además, demostramos que los niveles plasmáticos de GOAT podrían servir como un nuevo biomarcador no invasivo para el diagnóstico del cáncer de próstata, especialmente en pacientes no diabéticos en los que la sensibilidad y especificidad de los niveles plasmáticos de GOAT para detectar la enfermedad son particularmente elevadas. Asimismo, nuestros resultados demuestran que la expresión de In1-ghrelina, pero no ghrelina nativa, se encuentran significativamente elevados en muestras de tejido y en líneas celulares de cáncer de próstata, así como en muestras de plasma y orina de pacientes con cáncer de próstata en comparación con muestras de tejido normal o de pacientes sanos. Dado que tanto In1-ghrelina como ghrelina nativa se expresaba en tejido sano prostático, investigamos el posible papel funcional que ambas moléculas podrían presentar en la regulación de la función prostática. Para ello se realizaron cultivos celulares de células prostáticas no tumorales, que se trataron con los péptidos acilados de In1-ghrelina o ghrelina nativa. Resultó interesante observar que el tratamiento con los péptidos de la In1-ghrelina, pero no con ghrelina aumenta la expresión (mRNA) y secreción (proteína) de PSA. Además, la sobreexpresión de In1-ghrelina, pero no de ghrelina, aumentó la proliferación de las células prostáticas sanas. Posteriormente analizamos el papel patofisiológico de la sobreexpresión de In1-ghrelina en cáncer de próstata. Para ello, utilizamos diferentes líneas celulares de cáncer de próstata que representan el amplio espectro de la enfermedad. Tanto el tratamiento con péptidos In1-ghrelina como la transfección con un vector de expresión de In1-ghrelina aumentó la proliferación y migración celular de las diferentes líneas celulares de cáncer de próstata. Más aún, este resultado se corroboró en un modelo preclínico in vivo de xenotransplante en ratones inmunodeprimidos. Se comprobó que los efectos patológicos de la In1-ghrelina se llevaban a cabo a través de la modulación de la actividad de la vía de las quinasas ERK, de un aumento de expresión de ciertos oncogenes (ej. CAV1, CAV2, IGFBP-5, LOXL1) y por una disminución de determinados genes supresores tumorales (ej. APC, SFRP1, NRIP1). Finalmente, y con el objetivo de demostrar el potencial terapéutico de In1-ghrelina en cáncer de próstata, se silenció la expresión endógena de In1-ghrelina mediante el diseño, validación y aplicación de dos siRNAs (“ARN pequeño de interferencia”) específicos para la secuencia de In1-ghrelina en varias líneas celulares de cáncer de próstata; dicho silenciamiento disminuyó la proliferación celular y la secreción de PSA de esas células en comparación con células control. 3. Conclusiones Por todo ello, los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral sobre la regulación de la expresión y el papel patofisiológico de las variantes de splicing sst5TMD4 e In1-ghrelina y de la enzima GOAT en el contexto del cáncer de próstata, refuerzan la relevancia de los sistemas somatostatina y ghrelina, especialmente de sus formas de splicing alternativo, en el desarrollo y progresión tumoral del cáncer de próstata. Específicamente, nuestros hallazgos demuestran que las variantes de splicing sst5TMD4 e In1-ghrelina y la enzima GOAT están sobreexpresadas en cáncer de próstata, donde inducen importantes alteraciones relacionadas con la agresividad tumoral. Por tanto, estas moléculas podrían servir como nuevos biomarcadores de diagnóstico y/o pronóstico y podrían representar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento del cáncer de próstata

Histološka različitost u koštanoj biopsiji postmenopauzalnih i osteoporotičnih žena

Many investigations have been carried out on osteoporosis and showed this disorder in a new light. The reduction in bone structure and dynamics points to the etiology that may be of therapeutic significance. Today we still do not know everything about the histomorphometric characteristics of each metabolic disturbance and bone disease. Bone biopsy and histomorphometry are not available for most patients and that is the reason why a broad classification of these reductions in osteoporosis and osteomalacia are widely accepted in clinical practice. New findings from this complex domain are necessary to design a strategy in the evolution of new therapeutic devices and drugs with the intention to decrease the high disability and mortality rate in the vulnerable population of postmenopausal women.Brojna istraživanja provedena posljednjih godina pokazala su osteoporozu u novom svjetlu. Promjene u koštanoj strukturi i dinamici upućuju na etiologiju poremećaja, što je od presudnog značenja za liječenje bolesti. S obzirom na činjenicu da još uvijek malo znamo o histomorfometrijskim značajkama pojedinih metaboličnih bolesti te da je biopsija kosti i histomorfometrija još uvijek teže dostupna većem broju bolesnika, danas se u kliničkoj praksi uglavnom rabi klinička klasifikacija po kojoj se one dijele u dvije široke kategorije: osteoporozu i osteomalaciju. Nova saznanja iz ovoga područja su od presudne važnosti za planiranje buduće strategije razvoja novih terapijskih sredstava i lijekova kako bi se smanjio visok postotak invaliditeta i smrtnosti u osjetljivoj populaciji postmenopauzalnih žena