Assessment of In-House Natural Product and Synthetic Compound Libraries Based on In vitro Inhibition of Cholinesterases

The first line medication for mild to moderate Alzheimer s disease (AD) is based on cholinesterase inhibitors which prolong the effect of the neurotransmitter acetylcholine in cholinergic nerve synapses which relieves the symptoms of the disease. Implications of cholinesterases involvement in disease modifying processes has increased interest in this research area. The drug discovery and development process is a long and expensive process that takes on average 13.5 years and costs approximately 0.9 billion US dollars. Drug attritions in the clinical phases are common due to several reasons, e.g., poor bioavailability of compounds leading to low efficacy or toxic effects. Thus, improvements in the early drug discovery process are needed to create highly potent non-toxic compounds with predicted drug-like properties. Nature has been a good source for the discovery of new medicines accounting for around half of the new drugs approved to market during the last three decades. These compounds are direct isolates from the nature, their synthetic derivatives or natural mimics. Synthetic chemistry is an alternative way to produce compounds for drug discovery purposes. Both sources have pros and cons. The screening of new bioactive compounds in vitro is based on assaying compound libraries against targets. Assay set-up has to be adapted and validated for each screen to produce high quality data. Depending on the size of the library, miniaturization and automation are often requirements to reduce solvent and compound amounts and fasten the process. In this contribution, natural extract, natural pure compound and synthetic compound libraries were assessed as sources for new bioactive compounds. The libraries were screened primarily for acetylcholinesterase inhibitory effect and secondarily for butyrylcholinesterase inhibitory effect. To be able to screen the libraries, two assays were evaluated as screening tools and adapted to be compatible with special features of each library. The assays were validated to create high quality data. Cholinesterase inhibitors with various potencies and selectivity were found in natural product and synthetic compound libraries which indicates that the two sources complement each other. It is acknowledged that natural compounds differ structurally from compounds in synthetic compound libraries which further support the view of complementation especially if a high diversity of structures is the criterion for selection of compounds in a library.Koliiniesteraasien estäjiä käytetään lievän tai keskivaikean Alzheimerin taudin ensisijaisena lääkehoitona. Koliiniesteraasien estäjät pidentävät asetyylikoliini-hermovälittäjäaineen vaikutusta hermosynapseissa, mikä johtaa Alzheimerin taudin oireiden lievenemiseen. Viitteet koliiniesteraasien estäjien mahdollisista vaikutuksista myös taudin etenemiseen ovat lisänneet kiinnostusta tätä tutkimusalaa kohtaan. Lääkkeen keksimis- ja kehittämisprosessi on aikaa vievää ja kallista. Keskimäärin aikaa kuluu 13,5 vuotta ja koko prosessi maksaa noin 0,9 miljardia Yhdysvaltain dollaria. Lääkekandidaatin hylkääminen kesken kliinisten kokeiden on yleistä. Syitä hylkäämiseen on useita esim. huono biologinen hyötyosuus, mikä voi johtaa muun muassa heikkoon tehoon. Lääkkeenkeksimisprosessin alkuvaiheiden kehittäminen parantaa mahdollisuuksia löytää tehokkaita ja turvallisia lääkkeenkaltaisia yhdisteitä. Lääkkeenkaltaisten yhdisteiden etuna on se, että niiden käyttäytyminen on ennustettavissa siirryttäessä lääkkeenkeksimisvaiheesta eteenpäin lääkekehitykseen. Luonto on ollut hyvä lähde uusien lääkeaineiden etsimisessä. Noin puolet viimeisten kolmen vuosikymmenen aikana markkinoille hyväksytyistä lääkeaineista on peräisin luonnosta. Nämä yhdisteet on joko eristetty suoraan luonnosta, ne ovat luonnonaineiden synteettisiä johdoksia tai rakenne on muuten matkittu luonnosta peräisin olevista yhdisteistä. Toinen tapa tuottaa uusia molekyylejä lääkkeenkeksimisprosessia varten on synteettisen kemian hyödyntäminen. Näissä molemmissa lähestymistavoissa on omat hyvät ja huonot puolensa. Uusien lääkeainekandidaattien seulominen in vitro perustuu siihen, että kohde, joka tässä työssä oli proteiini, altistetaan kirjastoissa oleville näytteille ja mitataan muuttuuko kohteen toiminta. Koejärjestely täytyy validoida seulontaa varten, jotta seulonnan tulokset ovat laadukkaita ja luotettavia. Kun seulotaan tuhansia näytteitä, on kokeen miniatyrisoiminen ja automatisoiminen välttämätöntä liuosten ja tutkittavien yhdisteiden kulutuksen vähentämiseksi sekä prosessin nopeuttamiseksi. Tässä työssä tutkittiin näytekirjastoja, jotka sisälsivät luonnosta peräisin olevia uutteita ja puhdasaineita tai synteettisiä yhdisteitä. Näytekirjastoista seulottiin yhdisteitä, jotka estävät ensisijaisesti asetyylikoliiniesteraasia ja toissijaisesti butyryylikoliiniesteraasia. Työssä arvioitiin myös kahden kokeen toimivuutta ja käyttökelpoisuutta seulonnassa. Lisäksi kokeet muokattiin sopimaan monentyyppisten näytekirjastojen seulontaan, koska uutekirjastojen ja puhdasainekirjastojen ominaisuudet asettavat erilaisia haasteita koejärjestelyille. Kokeiden validoinnilla varmistettiin, että seulonnassa saatavista tuloksista tulee luotettavia. Työssä löydettiin useita koliiniesteraasien estäjiä, joiden estovaikutukset erosivat toisistaan selektiivisyyden ja tehon osalta. Uusia koliiniesteraasien estäjiä löytyi sekä luonnonkirjastoista että synteettisestä kirjastosta, mikä osoittaa näiden lähteiden täydentävän toisiaan lääkkeenkeksimisprosessissa. On yleisesti tiedossa, että luonnosta peräisin olevat yhdisteet eroavat rakenteellisesti synteettisten näytekirjastojen yhdisteistä. Molempia lähteitä kannattaa hyödyntää lääkkeenkeksimisprosessissa, erityisesti rakenteellisen monimuotoisuuden ollessa seulontaan valittavien yhdisteiden kriteeri

Use of neural networks to model molecular structure and function

This thesis is a study of some applications of neural networks - a recent computer algorithm - to modelling the structure and function of biologically important molecules. In Chapter 1, an introduction to neural networks is given. An overview of quantitative structure activity relationships (QSARs) is presented. The applications of neural networks to QSAR and to the prediction of structural and functional features of protein and nucleic acid sequences are reviewed. The neural network algorithms used are discussed in Chapter 2. In Chapter 3, a two-layer feed-forward neural network has been trained to recognise an ATP/GTP-binding local sequence motif. A comparably sophisticated statistical method was developed, which performed marginally better than the neural network. In a second study, described in Chapters 4 and 5, one of the largest data sets available for developing a quantitative structure activity relationship - the inhibition of dihydrofolate reductase by 2,4-diamino-6,6-dimethyl-5-phenyldihydrotriazine derivatives has been used to benchmark several computational methods. A hidden-layer neural network, a decision tree and inductive logic programming have been compared with the more established methods of linear regression and nearest neighbour. The data were represented in two ways: by the traditional Hansch parameters and by a new set of descriptors designed to allow the formulation of rules relating the activity of the inhibitors to their chemical structure. The performance of neural networks has been assessed rigourously in two distinct areas of biomolecular modelling; sequence analysis and drug design. The conclusions of these studies are presented in Chapter 6

Computational approaches in supramolecular chemistry with a special focus on virtual screening

Within this thesis novel computational tools for the rational design of synthetic host-guest complexes (SHGC) were developed and applied that employ the concepts of efficient virtual screening (VS) approaches. The first part describes the development of a fast structure prediction tool for flexible SHGC. The tool was validated on a test dataset comprising crystallographically determined SHGC. In nine of ten cases near-native solutions were generated. The tool can be applied for VS. In the second part of the thesis computational techniques were applied for designing SHGC based on ß-cyclodextrins (ß-CD). We performed a structure-based inverse virtual screening for identifying modified ß-CDs as receptors for the anticancer drug camptothecin (CPT). Six of the proposed receptors exhibited binding affinities which were significantly higher than for any other CPT-receptor. Furthermore, we applied a combination of a similarity-based virtual screening technique with a regression model (RM) for identifying novel high affinity guest molecules of ß-CD. Ten of the proposed guest molecules exhibited a binding free energy of lower than -20 kJ/mol. The last chapter describes a comparison of regression methods regarding their ability to generate predictive RM for thermodynamical parameters (dG, dH and dS) of ß-CD-guest complexes. dG could be predicted in good agreement with experimental values, none of the methods led to comparably good predictive models for dH. dS appears almost unpredictable.Im Rahmen dieser Arbeit wurden rechnergestützte Verfahren (RGV) zum gezielten Entwurf von synthetischen Wirt-Gast Komplexen (SWGK) entwickelt und eingesetzt. Dabei wurde ein Fokus auf schnelle virtuelle Screening (VS) Verfahren gelegt. Der erste Teil beschreibt die Entwicklung eines Programms zur schnellen Strukturvorhersage von flexiblen SWGK. Das Programm wurde auf einem Testdatensatz an kristallographisch vermessenen SWGK validiert. Für neun von zehn SWGK wurden nativ-ähnliche Lösungen gefunden. Das Programm kann für VS eingesetzt werden. Der zweite Teil der Arbeit behandelt RGV zum gezielten Entwurf von ß-Cyclodextrin (ß-CD) Komplexen. Mit Hilfe eines strukturbasierten inversen VS wurden sechs modifizierte ß-CD-Rezeptoren für den Krebsarzneistoff Camptothecin (CPT) gefunden, die deutlich höhere Bindungsaffinitäten zu CPT aufwiesen als alle bislang bekannten CPT-Rezeptoren. Zur Identifizierung neuer hochaffiner Gäste von ß-CD wurde ein ähnlichkeitsbasiertes VS Verfahren in Kombination mit einem Regressionsmodell (RM) eingesetzt. Zehn der mit Hilfe dieses Verfahrens vorgeschlagenen Moleküle wiesen eine Bindungsenergie von unter -20 kJ/mol auf. Das letzte Kapitel beschreibt einen Vergleich von drei Regressionsverfahren. Es wurde die Fähigkeit untersucht, vorhersagekräftige RM für thermodynamische Parameter (dG, dH und dS) von ß-CD-Gast-Komplexen zu generieren. dG konnte mit allen Methoden sehr gut vorhergesagt werden, während dH nur begrenzt und dS unzureichend vorhersagbar war

The use of computer-aided drug design in small molecule drug discovery

Drug discovery is one of the most challenging research fields that contributes to the birth of novel drugs for therapeutic use. Due to the complexity and intricate nature of the research, lengthy processes are involved in identifying potential hit molecules for a therapeutic target. To shorten the time required to reach the hit-to-lead stage, computer-aided drug design (CADD) has been used to expedite the process and reduce laboratory expenses. Common strategies used within CADD involve structure-based drug design (SBDD) and ligand-based drug design (LBDD). Both strategies were used extensively in two projects showing the complementarity of each strategy throughout the process. In this work, two separate drug discovery projects are detailed: Design, synthesis and molecular docking study of novel tetrahydrocurcumin analogues as potential sarcoplasmic-endoplasmic reticulum calcium ATPases (SERCA) inhibitors – details the identification, synthesis and testing of potential hit candidate(s) targeting SERCA by using SBDD Filamenting temperature-sensitive mutant Z (FtsZ) as therapeutic target in ligand-based drug design – details the identification, synthesis and testing of potential hit molecule(s) targeting FtsZ In the first project, homology modelling and virtual compound library screening were utilised as the SBDD methods to identify potential hit molecules for testing in P-type calcium ATPases such as SERCA. Preliminary results have found compound 20, an analogue of tetrahydrocurcumin, to show some SERCA inhibitory effect at 300µM based on a SERCA-specific calcium signalling assay performed via fluorometric imaging plate reader. Molecular docking study has also reflected this outcome with desirable ligand-protein binding energies found for 20 when compared with other tested ligands. Pharmacophore screening was used as the main LBDD method in the second project to identify probable hit candidates targeting FtsZ. Potential ligands were synthesised, and tested for antibacterial effect in Bacillus Subtilis strain 168 (Bs168) and Streptococcus pneumoniae strain R6 (SpnR6) cells. One of the tetrahydrocurcumin analogues, compound 4, was found to have minimum inhibitory concentration (MIC) ≤ 10 µM in Bs168 cells and ≤ 2 µM in spnR6 cells. The IC50 values for 4 were 9.1 ± 0.01 µM and 1 ± 0.01 µM in Bs168 and SpnR6 cells respectively. The MIC of 4 was found to be very similar to the MIC of compound 1, a known hit compound targeting against Bs168 cells. On the other hand, the MIC of 4 was lower than the MIC (> 64 µg/mL) of a well-known FtsZ inhibitor, PC190723, against S. pneumoniae. Subsequent molecular docking analyses were completed to evaluate the ligand-protein binding energies to correlate against the testing results. Both compounds 20 and 4 possess some structural similarities and differences that may confer their different effects in these protein targets, which render both with potentials to become the next lead molecules for future development