Genetic contribution to the aggregation of schizophrenia and bipolar disorder in multiplex consanguineous Pakistani pedigrees

La schizophrénie (SCZ) et le trouble bipolaire (TB) sont des troubles mentaux graves qui présentent tous deux des symptômes affectifs et psychotiques. La SCZ est un trouble psychotique primaire caractérisé par des symptômes d’idées délirantes et d’hallucinations. Le TB est principalement un trouble de l'humeur primaire défini des périodes de manie et de dépression. En 2010, ces troubles contribuaient respectivement à 7,4% et 7,0% de la charge mondiale de morbidité. La prévalence élevée (~ 0,4% pour la SCZ et ~ 2,4% pour le TB) et la forte héritabilité estimée (~ 80%) suggèrent toutes deux une forte influence génétique. Les données disponibles démontrent qu'il existe des chevauchements génétiques entre les deux conditions, mais également des composantes génétiques spécifiques à chaque maladie. Au cours de la dernière décennie, des études d’association pan-génomiques ont identifié des centaines de loci génétiques associés à ces maladies. De plus, d’autres méthodes ont permis de mettre en relief la contribution d’autres types de variations génétiques comme les rares variations du nombre de copies (CNV), de rares polymorphismes de nucléotide simple (SNV) et des mutations de novo (MDN). Bien que notre connaissance de l'architecture génétique de ces conditions est en progression, une grande partie de l'héritabilité demeure toujours non résolue et inexpliquée. Une longue histoire de faible mélange génétique combiné à la pratique répandue de mariages consanguins (50% des unions sont consanguines) rend les familles pakistanaises prometteuses pour des études génétiques médicales basées sur la population. Des études épidémiologiques ont démontré que la consanguinité est associée à un risque accru de nombreux traits. L’étude de familles a largement été appliquée dans la cartographie génétique des caractères mendéliens et complexes. Cependant, peu d’études ont eu recours à de grandes familles consanguines multiplexes pour étudier en profondeur le rôle de la consanguinité dans les troubles neuropsychiatriques tels que la SCZ et le TB. Les CNVs ont été impliquées dans la SCZ et le TB depuis la découverte des délétions 22q11.2. Malgré que ces derniers soient rares dans la population, ils contribuent de manière significative au risque. Des études d'association de CNV ont révélé un enrichissement de délétions et de duplications rares et un taux plus élevé de CNV de novo dans les cas relatifs aux témoins. De plus, le séquençage du génome de familles SCZ a révélé une charge accrue de rares CNVs exonics chez les sujets SCZ ainsi que de l'hétérogénéité génétique. L'utilisation de grandes familles de multiplexes pourrait être statistiquement puissante pour étudier le rôle des CNVs co-ségrégant avec la maladie et éventuellement pathogènes. Afin de mieux comprendre l'hétérogénéité génétique et résoudre l’héritabilité manquante de ces deux troubles mentaux, nous avons utilisé du génotypage et du séquençage de l'exome afin d’examiner le profil génétique de grandes généalogies consanguines multiplexes d’origine Parkistanaise. Chacune de ces familles comportait plus de dix membres affectés par la SCZ ou le TB. Dans cette thèse, nous caractérisons la population d’origine, ce qui comprend le mélange génétique et la consanguinité récente de notre cohorte. Nous avons testé si le niveau de consanguinité était associé au phénotype binaire et à ses dimensions sous-phénotypiques. Nous avons également inclus un grand ensemble de données de populations contrôles externes et appariées afin de calculer et comparer le coefficient de consanguinité. Notre approche, qui comprenait une analyse de liaison, une cartographie de l’auto-zygosité, la détection de cycles homozygotie et une analyse de ségrégation de variantes homozygotes délétères rares, nous a conduit à rejeter l’hypothèse d’un modèle de transmission récessif sur ces familles (malgré leur forte consanguinité). Par la suite, nous avons examiné si des CNVs co-ségrégaient avec le phénotype dans certaines familles. Cette étude comportait plusieurs étapes: 1 - une comparaison systématique entre différents algorithmes de détection de CNVs. 2 - une validation croisée de vrais CNVs ou de faux positifs par des approches in silico ou expérimentales, 3 - le développement d’un logiciel de ségrégation et d'annotation. Cette étude met de l’avant à la fois les avancées méthodologiques et les limites de l’exploration des CNVs. Au final, aucun des CNVs identifiés ne semblent contribuer à la variance génétique de la SCZ et du TB des familles examinées dans cette étude. Les résultats présentés dans cette thèse étayent une hypothèse alternative qui impliquerait des interactions polygéniques entre à la fois des variants rares et des variants communs.Schizophrenia (SCZ) and bipolar disorder (BP) are two major psychiatric disorders. SCZ is a primary psychotic disorder that typically involves symptoms of delusions and hallucinations, by comparison BP is a mood disorder engaging mania and depression but it can also involve psychosis. A 2010 estimation of these disorders highlighted that they respectively contributed to ~7.4% and ~7.0% of the global burden of disease. The high prevalence (~0.4% for SCZ and ~2.4% for BP) and estimated heritability (~80%) suggest a strong genetic influence. Evidence shows that there are some genetic overlaps between the two conditions but also disorder-independent genetic components. Over the past decade, genome-wide association studies (GWAS) identified hundreds of SCZ and BP loci, and other approaches identified various forms of potential genetic risk factors, for instance rare copy number variants (CNVs), rare single nucleotide variants (SNVs) and de novo mutations (DNMs). While our knowledge of the genetic architecture of these conditions grow, a large of portion of the genetic heritability of each disorder still remains unexplained. The combination of a long history of genetic admixture, and the tradition of consanguineous marriages (50% of unions are consanguineous), makes Pakistani families promising for population based medical genetics studies. Consanguinity has previously been associated with an increased risk of numerous traits in epidemiological studies. Family-based designs have been widely applied in the genetic mapping of Mendelian and complex traits. However, few studies have used large multiplex consanguineous families to thoroughly investigate the role of consanguinity in neuropsychiatric disorders such as SCZ and BP. CNVs have been implicated in SCZ and BP since the discovery of 22q11.2 deletions, however, most of them are rare in the population but contribute significantly to the risk. Association studies of CNVs found enrichment of rare deletions and duplications, and a higher rate of de novo CNVs in cases relative to controls. Whole-genome sequencing of multiplex SCZ families reported increased burden of rare, exonic CNV in SCZ probands and genetic heterogeneity. Using large multiplex families could be statistically powerful to investigate the role of segregating, and possibly pathogenic, CNVs. In order to better understand the genetic heterogeneity and look for missing heritability of these two common disorders in Pakistani families, we used SNP genotyping and whole-exome sequencing to examine the genetic profile of ten large multiplex consanguineous pedigrees; each of these families involved more than ten members affected by SCZ or BP. In this thesis, we characterized the population background which includes admixture and recent inbreeding of our cohort. We tested if the inbreeding level was associated with the binary phenotype and its subphenotype dimensions. We also included large external dataset of matched population control individuals to compute and compare the inbreeding coefficient. Our approach, which included linkage analysis, autozygosity mapping, runs of homozygosity (ROH) and rare deleterious homozygous variants segregation analysis, led us to reject the hypothesis of a recessive inheritance model across these families (despite of their high inbreeding). We subsequently looked if any CNV segregated across some of the families. This examination involved multiple steps: 1 - a systematic comparison of a range of CNV detection algorithms currently available through different platforms, 2 - a cross validation of true and false positive CNV calls through the use of in silico or experimental approaches, 3 - the development of our own segregation and annotation software. This effort both emphasized the methodological advances and limitations of CNV studies. In the end, none of the potentially pathogenic CNV identified appeared to account for the genetic variance of SCZ and BP observed in the families examined here. The results presented in this thesis provide support for an alternate hypothesis that would involve a polygenic pattern where both rare variants and common variants would be at play

Genetic Heterogeneity in Autism Spectrum Disorders in a Population Isolate

Positional cloning has enabled hypothesis-free, genome-wide scans for genetic factors contributing to disorders or traits. Traditionally linkage analysis has been used to identify regions of interest, followed by meticulous fine mapping and candidate gene screening using association methods and finally sequencing of regions of interest. More recently, genome-wide association analysis has enabled a more direct approach to identify specific genetic variants explaining a part of the variance of the phenotype of interest. Autism spectrum disorders (ASDs) are a group of childhood onset neuropsychiatric disorders with shared core symptoms but varying severity. Although a strong genetic component has been established in ASDs, genetic susceptibility factors have largely eluded characterization. Here, we have utilized modern molecular genetic methods combined with the advantages provided by the special population structure in Finland to identify genetic risk factors for ASDs. The results of this study show that numerous genetic risk factors exist for ASDs even within a population isolate. Stratification based on clinical phenotype resulted in encouraging results, as previously identified linkage to 3p14-p24 was replicated in an independent family set of families with Asperger syndrome, but no other ASDs. Fine-mapping of the previously identified linkage peak for ASDs at 3q25-q27 revealed association between autism and a subunit of the 5-hydroxytryptamine receptor 3C (HTR3C). We also used dense, genome-wide single nucleotide polymorphism (SNP) data to characterize the population structure of Finns. We observed significant population substructure which correlates with the known history of multiple consecutive bottle-necks experienced by the Finnish population. We used this information to ascertain a genetically homogenous subset of autism families to identify possible rare, enriched risk variants using genome-wide SNP data. No rare enriched genetic risk factors were identified in this dataset, although a subset of families could be genealogically linked to form two extended pedigrees. The lack of founder mutations in this isolated population suggests that the majority of genetic risk factors are rare, de novo mutations unique to individual nuclear families. The results of this study are consistent with others in the field. The underlying genetic architecture for this group of disorders appears highly heterogeneous, with common variants accounting for only a subset of genetic risk. The majority of identified risk factors have turned out to be exceedingly rare, and only explain a subset of the genetic risk in the general population in spite of their high penetrance within individual families. The results of this study, together with other results obtained in this field, indicate that family specific linkage, homozygosity mapping and resequencing efforts are needed to identify these rare genetic risk factors.Paikkaan perustuva geenitunnistus eli positionaalinen kloonaus on mahdollistanut hypoteesittomat, koko perimän kattavat tutkimukset joilla voidaan kartoittaa tauteihin ja ominaisuuksiin vaikuttavia perinnöllisiä tekijöitä vaikka tautia aiheuttavia biologisia prosesseja ei tunneta. Modernit molekyyligenetiikan menetelmät ovat mahdollistaneet tiheät, jopa miljoonan geenimerkin kattavat tutkimukset, joilla voidaan tutkia perimän vaihtelua yksilötasolla tarkemmin kuin koskaan aikaisemmin. Suomalainen väestö on geneettisesti yhtenäinen, ja sitä ovat muokanneet perustajavaikutus, genettiset pullonkaulat ja sattuma. Suomalaisen väestön erityispiirteitä voidaan käyttää hyväksi tunnistettaessa riskigeenejä sairauksille. Verrattuna sekaväestöihin tautien riskigeenen kirjo on Suomessa mahdollisesti suppeampi, sillä maamme alkuperäiset asuttajat toivat mukanaan vain osan kaikista mahdollisista geneettisistä riskitekijöistä. Autismikirjon sairaudet ovat ryhmä vakavuudeltaan vaihtelevia, lapsuudessa alkavia neuropsykiatrisia sairauksia. Vaikka perintötekijöiden on todettu vaikuttavan vahvasti autismikirjon sairauksien syntyyn, aktiivisesta tutkimuksesta huolimatta ei sairauksille altistavia geenimuotoja vielä ole tunnistettu kuin kourallinen. Autismikirjon sairauksien tiedetään kuitenkin olevan ns. monitekijäisiä tauteja, eli niille altistavat sekä lukuisat geenivirheet että vielä tuntemattomat ympäristötekijät. Tässä tutkimuksessa olemme käyttääneet molekyyligenetiikan uusimpia menetelmiä hyödyntäen samalla suomalaisen väestön erityispiirteitä tunnistaaksemme näille sairauksille altistavia perinnöllisiä tekijöitä. Tämän väitöskirjatutkimuksen tulokset osoittavat, että autismikirjon sairauksille altistavat useat eri geenimuodot jopa Suomen kaltaisessa väestöisolaatissa. Vaikka tutkimuksessa löydettiin viitteitä myös yleisten geenimuotojen, kuten serotoniinreseptorin alayksikön HTR3C:n roolista autismin synnyssä, perustajamutaatioiden puute väestössämme osoittaa vahvasti, että autismikirjon perinnöllisistä riskitekijöistä suurin osa on uusia mutaatioita. Nämä harvinaiset mutaatiot selittävät vain pienen osan riskiä väestötasolla, mutta vaikuttavat merkittävästi yksittäisten perheiden riskiin. Autismin geneettisten riskitekijöiden tutkimuksissa tulisi jatkossa pääasiallisesti hyödyntää kytkentä-, homozygotiakartoitus- ja sekvenssianalyysiin perustuvia menetelmiä, joilla voidaan tutkia yksittäisten perheiden alttiusgeenejä, eikä pyrkiä tutkimaan väestössä yleisesti esiintyviä geenimuotoja

Autismikirjon häiriöiden geneettiset mekanismit

Autism is a childhood-onset developmental disorder characterized by deficits in reciprocal social interaction, verbal and non-verbal communication, and dependence on routines and rituals. It belongs to a spectrum of disorders (autism spectrum disorders, ASDs) which share core symptoms but show considerable variation in severity. The whole spectrum affects 0.6-0.7% of children worldwide, inducing a substantial public health burden and causing suffering to the affected families. Despite having a very high heritability, ASDs have shown exceptional genetic heterogeneity, which has complicated the identification of risk variants and left the etiology largely unknown. However, recent studies suggest that rare, family-specific factors contribute significantly to the genetic basis of ASDs. In this study, we investigated the role of DISC1 (Disrupted-in-schizophrenia-1) in ASDs, and identified association with markers and haplotypes previously associated with psychiatric phenotypes. We identified four polymorphic micro-RNA target sites in the 3 UTR of DISC1, and showed that hsa-miR-559 regulates DISC1 expression in vitro in an allele-specific manner. We also analyzed an extended autism pedigree with genealogical roots in Central Finland reaching back to the 17th century. To take advantage of the beneficial characteristics of population isolates to gene mapping and reduced genetic heterogeneity observed in distantly related individuals, we performed a microsatellite-based genome-wide screen for linkage and linkage disequilibrium in this pedigree. We identified a putative autism susceptibility locus on chromosome 19p13.3 and obtained further support for previously reported loci at 1q23 and 15q11-q13. To follow-up these findings, we extended our study sample from the same sub-isolate and initiated a genome-wide analysis of homozygosity and allelic sharing using high-density SNP markers. We identified a small number of haplotypes shared by different subsets of the genealogically connected cases, along with convergent biological pathways from SNP and gene expression data, which highlighted axon guidance molecules in the pathogenesis of ASDs. In conclusion, the results obtained in this thesis show that multiple distinct genetic variants are responsible for the ASD phenotype even within single pedigrees from an isolated population. We suggest that targeted resequencing of the shared haplotypes, linkage regions, and other susceptibility loci is essential to identify the causal variants. We also report a possible micro-RNA mediated regulatory mechanism, which might partially explain the wide-range neurobiological effects of the DISC1 gene.Autismi on lapsuusiän kehityksellinen häiriö, jonka tyypillisiä oireita ovat ongelmat vastavuoroisessa sosiaalisessa vuorovaikutuksessa, sanallisessa ja sanattomassa kommunikaatiossa, sekä riippuvuus erilaisista rutiineista ja rituaaleista. Se kuuluu laajempaan autismikirjon häiriöiden ryhmään, jotka kaikki ovat perusoireiltaan samankaltaisia, mutta joiden vakavuusaste vaihtelee huomattavasti. Autismikirjon häiriöitä tavataan maailmanlaajuisesti 0.6-0.7%:lla lapsista, ja ne aiheuttavat inhimillisen kärsimyksen lisäksi merkittäviä kuluja terveydenhuollolle. Vaikka autismikirjon häiriöt ovat vahvasti perinnöllisiä, niiden geneettinen tausta on osoittautunut erittäin heterogeeniseksi, mikä on vaikeuttanut altistavien geneettisten tekijöiden tunnistamista. Viimeaikaisten tutkimusten perusteella kuitenkin tiedetään, että harvinaiset, perhespesifiset geneettiset muutokset selittävät merkittävän osan autismin periytyvyydestä. Tässä väitöskirjassa tutkittiin DISC1-geenin (Disrupted-in-schizophrenia-1) merkitystä autismikirjon häiriöissä. Havaitsimme, että samat geenimerkit ja haplotyypit, joiden on aikaisemmin osoitettu assosioituvan muihin psykiatrisiin fenotyyppeihin, altistavat myös autismikirjon häiriöille. Tunnistimme geenin 3 UTR alueelta neljä polymorfista mikro-RNA:n sitoutumiskohtaa, ja osoitimme, että hsa-miR-559 säätelee DISC1:n ilmentymistä alleelispesifisesti in vitro. Lisäksi tutkimme suurta keskisuomalaista autismisukua, joka polveutuu yhteisistä esivanhemmista 1600-luvulta. Teimme genominlaajuisen kytkentäanalyysin mikrosatelliittimarkkereilla tässä suvussa, jonka kaukaisen sukulaisuuden voidaan olettaa vähentävän geneettistä heterogeenisyyttä. Tunnistimme mahdollisen autismille altistavan lokuksen kromosomissa 19p13.3, ja havaitsimme kaksi jo aiemmin autismiin yhdistettyä lokusta kromosomeissa 1q23 ja 15q11-q13. Tutkiaksemme näitä tuloksia tarkemmin, laajensimme käyttämäämme keskisuomalaistaustaista aineistoa ja teimme genominlaajuisen analyysin käyttämällä tiheästi sijoittuvia SNP-markkereita. Tunnistimme pienen määrän haplotyyppejä, jotka osa suvun autismia sairastavista henkilöistä jakoi keskenään, sekä yhteneviä reaktioreittejä SNP- ja geeniekspressiodatasta, joiden perusteella aksoniohjaukseen osallistuvat molekyylit näyttäisivät liittyvän autismikirjon häiriöiden patogeneesiin. Tutkimuksemme osoittaa, että autismin genettinen tausta on monitekijäinen jopa populaatioisolaateissa ja yksittäisissä perheissä. Saamiemme tulosten perusteella voidaan sanoa, että altistavien genomisten alueiden sekvensointi on välttämätöntä, jos halutaan tunnistaa varsinaiset mutaatiot ja variantit, jotka aiheuttavat autismikirjon häiriöitä. Tunnistimme myös mahdollisen mikro-RNA-välitteisen säätelymekanismin, joka saattaa osittain selittää DISC1-geenin laaja-alaisia neurobiologisia vaikutuksia

The characterization of genetic risk factors associated with autism

Autism is a severe neurodevelopmental disorder. Development of a molecular diagnostic screen is an imperative step towards personalized treatments. Gene expression profiling using buccal samples was employed to identify susceptibility genes and dysregulated signaling pathways. Analyses of differentially regulated genes revealed numerous genes that were associated with development and function of the nervous and immune systems, circadian rhythm, and ERBB signaling. Amongst the affected participants there was a patient with a 3p14.1-p13 deletion, where FOXP1 is located. FOXP2 mutations are responsible for human speech and language disorders. Since FOXP1, FOXP2, and FOXP4 require dimerization for transcriptional activity, investigating the FOXP1/2/4 molecular network provides insight into the neural mechanisms behind language impairments in autism. HEK293 cells were transfected with FOXP1/2/4 constructs. QRT-PCR was used to evaluate mRNA expression of FOXP2 target genes. Results suggest that specific combinations of FOXP1/2/4 dimers may influence the transcription of target genes involved in language acquisition