Untersuchungen zu Wechselwirkungen von VE-Cadherin-Molekülen untereinander und mit TRPC4

Blutgefäße sind innen mit einem einschichtigen Verband aus Endothelzellen ausgekleidet, die die Barriere zwischen Blut und Interstitium bilden. Die parazelluläre Endothelbarriere besteht aus Occludens- und Adhärenskontakten. Occludenskontakte sorgen für eine Diffusionsbarriere, Adhärenskontakte sorgen für die nötige Adhäsionsstärke, damit Occludenskontakte gebildet und aufrechterhalten werden können. Die starke Adhäsion der Endothelzellen in Adhärenskontakten wird durch das Endothel-spezifische Cadherin (VE-Cadherin) vermittelt, das mit der Extrazellulärdomäne eine homophile Bindung eingeht und intrazellulär über Adaptermoleküle am Aktinzytoskelett verankert ist. Diese intrazelluläre Immobilisierung verstärkt die extrazelluläre Bindung. Die Regulation der VE-Cadherin-Adhäsion wirkt sich direkt auf die Endothelpermeabilität aus. Über den Mechanismus der Regulation ist allerdings noch wenig bekannt. Neben der Abhängigkeit von der durch die intrazelluläre Ca2+-Konzentration beeinflussten Verankerung des VE-Cadherins am Zytoskelett wird diskutiert, dass die Stärke der Adhäsion durch Dimerisierung oder Aggregat-Bildung der Cadherin-Moleküle beeinflusst wird. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Di- bzw. Oligomerisierung von Cadherinen unabhängig von deren Verbindung zum Zytoskelett auf die Stärke der Zelladhäsion untersucht. Dazu wurden zwei permanente CHO-Zelllinien hergestellt, die VE-Cadherin-Fusionsproteine exprimierten, bei denen die zytoplasmatische Domäne durch eine bzw. zwei FKBP-Domänen ersetzt worden war. Diese intrazellulären Domänen bewirkten nach Zugabe von FKBP-Dimerisierer eine Di- bzw. Oligomerisierung der Fusionsproteine. Die Ergebnisse der anschließenden Bindungsstudien deuten darauf hin, dass die extrazelluläre Cadherindomäne unabhängig von der zytoplasmatischen Domäne eine intrinsische homophile Bindungsaktivität besitzt. Diese scheint von einer Cis-Dimerisierung abhängig zu sein, denn die Bildung von VE-Cadherin-Cis-Dimeren war für eine Transinteraktion sowohl mit löslichen als auch mit perlengebundenen VE-Cadherin-Fc-Dimeren notwendig. Allerdings führte eine gezielte Bildung von Aggregaten der VE-Cadherin-Moleküle zu keiner weiteren Verstärkung der Bindungsaktivität. Eine feste Bindung war nur möglich, wenn Cadherine in der Plasmamembran primär beweglich waren, sich also den unbeweglichen VE-Cadherin-Proteinen der Perlen anlagern und mit diesen verzahnen konnten. Eine spontane Cis-Dimerisierung ist in Zellen mit hoher Fusionsprotein-Expression wahrscheinlich. Allerdings reichte die vermutliche spontane Cis-Dimerisierung nicht für eine durch Einzelmolekülfluoreszenz-Mikroskopie nachweisbare Bindung an lösliche VE-Cadherin-Fc-Dimere aus. Die Einzelmolekülfluoreszenz-Messungen lassen darauf schließen, dass VE-Cadherin-Fusionsproteine als Monomere in die Membran eingebaut wurden und erst dort durch den FKBP-Dimerisierer Dimere bildeten. Demnach könnte es bei der adhäsiven Aktivität von VE-Cadherin von einer durch die Extrazellulärdomänen vermittelten mäßig starken Bindung zu einer wesentlich stärkeren Bindung durch eine feste Verankerung am Zytoskelett kommen. Das Bindungspotential der Cadherine könnte also sowohl durch die Membrankonzentration und die Zahl der funktionell aktiven Dimere als auch durch die Verankerung der Cadherine am Zytoskelett kontrolliert werden. Um die Kräfte, die VE-Cadherin-Monomere im Vergleich zu Dimeren bei Transinteraktionen aufeinander ausüben, direkt messen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit die cDNA für ein sekretorisches monomeres VE-Cadherin-Fusionsprotein, bestehend aus der extrazellulären VE-Cadherin-Domäne, einer Dimerisierungsdomäne und einem Hexahistidin-Rest, hergestellt. Nach stabiler Expression in CHO-Zellen wurde das Fusionsprotein aus dem Kulturmedium über eine Ni-NTA-Agarose-Säule gereinigt. Mit Gelfiltration ließ sich die Dimerisierung dieses VE-Cadherin-Monomers durch den in der Arbeit verwendeten Dimerisierer nachweisen. Da die durch VE-Cadherin vermittelte Adhäsion auch von der intrazellulären und extrazellulären Ca2+-Konzentration abhängt, an der bei der entzündungsbedingten Kontaktlösung der Plasmamembran-Ca2+-Kanal TRPC4 beteiligt zu sein scheint, wurde weiterhin eine mögliche Assoziation von VE-Cadherin und TRPC4 untersucht. Immunfluoreszenz-Untersuchungen ergaben, dass beide Proteine in Endothelzellen zu verschiedenen Konfluenzstadien kontinuierlich in der Plasmamembran an Zell-Zell-Kontakten kolokalisieren. Außerdem führte eine Kotransfektion von TRPC4-exprimierenden HEK 293-Zellen mit einem VE-Cadherin-GFP-kodierenden Plasmid zu einer Rekrutierung von TRPC4 an VE-Cadherin-enthaltende Zell-Zell-Kontakte. Eine Assoziation beider Moleküle gäbe der Zelle die Möglichkeit, durch TRPC4 die Ca2+-Konzentration in direkter Nachbarschaft der VE-Cadherin-Moleküle zu regulieren, ohne andere Kompartimente der Zelle zu beeinflussen