High Resolution X-ray and Neutron Crystallographic Studies of \u3cem\u3eEscherichia coli\u3c/em\u3e Dihydrofolate Reductase

Dihydrofolate Reductases (DHFRs) have been identified in nearly every proteome and are essential for most biosynthetic pathways involving one-carbon transfer reactions due to their recycling of tetrahydrofolate (THF). They catalyze the NADPH-dependent reduction of dihydrofolate (DHF), producing THF. Inhibition of DHFR ultimately depletes cellular pools of THF; causing a reduced supply of thymine nucleotides for DNA synthesis, resulting in genomic instability and cell death. Therefore, DHFRs remain important drug targets in antimicrobial and chemotherapeutic treatments. Despite exhaustive investigation of E. coli chromosomal DHFR, controversy persists over the dynamics of regulatory loops (the Met20, the βF-βG, and the βG-βH) and the nature of the interaction between methotrexate (MTX), a tight-binding anti-cancer drug, and Asp 27, the only ionizable residue in the active site. Also of importance is the ionization state of Asp 27 in the apoenzyme and other complexes. Hydrogen atoms (H) likely play a critical role in DHFR ligand binding and catalysis, yet are difficult to directly visualize. High resolution X-ray and neutron crystallography have been utilized in this dissertation to provide accurate positions of H within the DHFR active site and to probe dynamics of the enzyme. The ultrahigh resolution X-ray structures of DHFR/MTX (1.0Å; chapter 4), apo DHFR (1.05Å), and DHFR/MTX/NADPH (1.4Å; both chapter 5) have been solved. Novel features were observed in the electron density maps, including the ability to model the Met20 loop in the apoenzyme as closed (reported disordered previously) and alternate side chain conformations in all the structures. The high data-to-parameter ratio of the apoenzyme and the MTX data sets allowed anisotropic B-factor refinement and full-matrix refinement to calculate carboxylate bond lengths and estimates of their deviations. The apoenzyme has highly different bond lengths for its Asp 27 carboxylate, thus, it is neutral at physiological pH. The carboxylate bond lengths of the Asp 27 in both the monomers of the asymmetric unit of the DHFR/MTX crystal are nearly equal, suggesting it is charged at physiological pH. If H is substituted for deuterium (D), neutrons are especially powerful probes due to D’s strong positive scattering length. To assign protonation states to the MTX and the Asp 27 by the direct identification of D, a neutron structure has been solved to 2.2Å resolution from nearly 80% complete data collected on a 0.3mm3 crystal (chapter 4). Prerequisite to the neutron experiment was the growth and D2O-soaking of large-volume crystals (chapter 3). The DHFR/MTX cocrystal possesses the largest primitive unit cell and is the smallest D2O-soaked crystal used successfully in a neutron diffraction experiment. This is the 11th novel protein ever to be solved by neutron crystallography (the 16th total structure). Nearly 2/3 of the amide backbone has undergone H/D exchange, an indicator of protein dynamics. However, monomer B, where the Met20 loop is closed, is ~10% more exchanged than monomer A, where the Met20 loop is partially occluded. Based on results from D occupancy refinement and analysis of the neutron maps, it is concluded that the MTX N1 is protonated when bound to DHFR. Paired with the X-ray data, this is new strong evidence that the Asp 27·MTX interaction is ionic in nature. To increase the signal-to-noise ratio in future neutron experiments, perdeuterated protein has been produced and its D enrichment measured by mass spectrometry. X-ray data (to 1.2Å) has now been collected on a perdeuterated DHFR/MTX cocrystal and it is isomorphous to the native cocrystals (chapter 3)

Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography.

This article describes the implementation of real-space refinement in the phenix.real_space_refine program from the PHENIX suite. The use of a simplified refinement target function enables very fast calculation, which in turn makes it possible to identify optimal data-restraint weights as part of routine refinements with little runtime cost. Refinement of atomic models against low-resolution data benefits from the inclusion of as much additional information as is available. In addition to standard restraints on covalent geometry, phenix.real_space_refine makes use of extra information such as secondary-structure and rotamer-specific restraints, as well as restraints or constraints on internal molecular symmetry. The re-refinement of 385 cryo-EM-derived models available in the Protein Data Bank at resolutions of 6 Å or better shows significant improvement of the models and of the fit of these models to the target maps

Crystal structures of Aldose Reductase, C2A domain of Rabphilin3A and tests of new restraints.

In dieser Arbeit wird die hochaufgelöste (0.82 Å) Struktur der Aldose-Reduktase (ein Enzym, welches am polyol Stoffwechselweg beteiligt ist) vorgestellt. Das Ziel der Arbeit war eine sorgfältige Überprüfung des Modells mit Schwerpunkt auf Merkmale, die nur bei hoher Auflösung erkennbar sind. Daten von atomarer Auflösung erlaubten die Modellierung mehrerer verschiedener Konformationen als in früher bestimmten Strukturen, sowie eine Verbesserung der Übereinstimmung von Modell und Daten. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Liste der disagreeable restraints gewidmet: einige kamen wahrscheinlich durch falsche restraints zustande, während andere reale Merkmale der Struktur sind, die nur bei hoher Auflösung sichtbar werden. Diese Beobachtungen könnten verwendet werden, um sowohl eine neue restraints library zu erstellen, als auch um die Molekülstruktur und funktion im Detail zu erklären. Das interessanteste Merkmal des Modells ist die Sicherheitsgurtschleife , die in zwei eigenständigen Konformationen sichtbar ist, der allgemeinen geschlossenen und einer zum Teil geöffneten Konformation (welche möglich ist, weil sich das Enzym in ein post-reaktivem Zustand befindet). Die Aufhebung einer Wechselwirkung genügt, um die Freisetzung des Kofaktors zu bewirken und die Sicherheitsgurtschleife zu öffnen. Die sorgfältige Untersuchung verschiedener hochaufgelöster Aldose-Reduktase Strukturen ergab eine Domänenbewegung die "Zangenbewegung" genannt wurde: die oberen und unteren Schleifen nähern sich dabei an oder entfernen sich voneinander, während das β-barrel starr bleibt. Diese Bewegung könnte mit dem post-reaktiven Zustand des Enzyms und der Freisetzung des Kofaktors zusammenhängen.Weiterhin wird die Kristallstruktur der Ca2+-freien C2A-Domäne von Rabphilin3A (einem neuronalen Protein, das am synaptischen Vesikelzyklus beteiligt ist und dessen genaue biologische Funktion noch ungeklärt ist) bei einer Auflösung von 1.92 Å vorgestellt. Die Struktur besitzt eine Typ1-Topologie und ist durch ein achtsträngiges antiparalleles β-Sandwich charakerisiert. Die elektrostatische Oberfläche ist sehr basisch und weist große Ähnlichkeiten zur C2B-Domäne des Rabphilin3A auf. In der C2A-Domäne des Rabphilin3A wurden zwei strukturelle Merkmale, die durch Unterschiede zur Konsensussequenz zustande kommen, gefunden: eine abweichende Position der Kalziumbindungsschleife 1 (CBL1), wodurch eine deutliche räumliche Verlagerung des konservierten, an der Ca2+-Bindung beteiligten Restes Asp413 verursacht wird, und die Anwesenheit des Restes Glu475 (im DED-Motiv), durch welchen eine lokale negative Ladung nahe der Ca2+-Bindungstelle entsteht. Im Vergleich zu anderen C2 Domänen weist die Struktur andere Merkmale auf, was ein Hinweis auf eine neue Funktion dieser Domäne sein könnte.Im letzten Kapitel werden Überprüfungen mittels einer neuen SHELXL Version, in der ein restraint an ADP gelegt wurde, gezeigt. Der neue restraint imitiert eine TLS Verfeinerung und sollte für Daten mittlerer Auflösung (1.5 - 2.0 Å) nützlich sein. Es wurden Vergleiche zwischen Strukturen, welche sowohl mit TLS in REFMAC als auch mit zwei SHELXL Versionen bei verschiedenen Auflösungen verfeinert wurden, angestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die beiden Programme bei mittlerer Auflösung vergleichbare Daten liefen. Der neue restraint ist allerdings eine gute Verbesserung im Vergleich zu der alten SHELXL Version

Improved Biomolecular Crystallography at Low Resolution with the Deformable Complex Network Approach

It is often a challenge to atomically determine the structure of large macromolecular assemblies, even if successfully crystallized, due to their weak diffraction of X-rays. Refinement algorithms that work with low-resolution diffraction data are necessary for researchers to obtain a picture of the structure from limited experimental information. Relationship between the structure and function of proteins implies that a refinement approach delivering accurate structures could considerably facilitate further research on their function and other related applications such as drug design. Here a refinement algorithm called the Deformable Complex Network is presented. Computation results revealed that, significant improvement was observed over the conventional refinement and DEN refinement, across a wide range of test systems from the Protein Data Bank, indicated by multiple criteria, including the free R value, the Ramachandran Statistics, the GDT (<1Å) score, TM-score as well as associated electron density map

Computational protein crystallography : How to get the most out of your data

It is important to obtain accurate three dimensional structures of molecules and proteins to understand and predict their function and behaviour. X-ray crystallography is the major technique to determine three dimensional structures of proteins. Although there have been major improvements on the experimental side in determining crystallographic data, only small progress has been made on the computational side to get a correct model andinterpretation of this data.In small-molecule crystallography, some of the shortcomings in the model have already been overcome, but in protein crystallography they still remain. Therefore, we have adapted the Hirshfeld atom refinement from small-molecule crystallography to make it available also to protein crystallography. This enables improved modelling of high-resolution protein data. To achieve this goal, we combined the molecular fractionation with conjugate caps approach with the Hirshfeld atom refinement. We call this combined method fragHAR. With fragHAR, we could perform the first Hirshfeld atom refinement of a metalloprotein.Furthermore, we improved and applied the quantum refinement method, which employs quantum mechanics calculations to obtain a chemically and physically correct model for all parts of the protein, especially the active site. With quantum refinement, it is possible to distinguish between different interpretations of the structure, e.g. the elemental composition or the protonation state, even from medium-resolution crystallographic data. In this thesis, quantum refinement was improved for highly-charged systems by applying a continuum-solvent description of the surroundings in the quantum mechanics calculation. Furthermore, quantum refinement was applied to settle the nature of the unusual bidentate ligand in V-nitrogenase and the protonation state of the MoFe cluster in Mo-nitrogenase when inhibited by CO. For a recent structure of Mo-nitrogenase, we showed that there is no experimental support for the suggestion that N 2 is bound to the MoFe-cluster and presented a more likely model. We have also identified the most probable protonation states of the active site in acetylcholinesterase before and after inhibition by nerve agents. Finally, for triosephosphate isomerase we used a joint X-ray and neutron quantum refinement to investigate the hydrogen bond between an inhibitor and Lys-13

Crystallographic Analysis of Pathological Crystals, Periplasmic Domain of Ligand-free CitA Sensor Kinase and PDI-related Chaperones

Die vorliegende Arbeit berichtet über die Erarbeitung von Verfahren, um nicht-merohedrisch verzwillingte Proteinkristalle zu erklären. Aüserdem wird die Strukturanalyse verschiedener Proteine behandelt, die Signaltransfer vermitteln.Nicht-merohedrische Verzwilligung tritt bei der Kristallstrukturanalyse äüserst selten auf. Für nicht-merohedrisch verzwillingte Kleinmolekülkristalle ist die Auswertung der Daten ihrer Röntgenanalyse schon seit einigen Jahren Routine. Bestehende Methoden für Kleinmoleküle wurden dahingehend erweitert, dass zwei verzwillingte Testproteinstrukturen, nämlich Rinder-Insulin (BI-Zwilling) und Glukoseisomerase (GI-Drilling), gelöst werden konnten. Bei der Auswertung wurde das Verfahren anomaler Streuung bei Einfrequenzstrahlung auf Daten angewandt, die an einer Drehanode gemessen wurden.Die bakterielle Antwort auf externe Stimulation wird durch mehrere lebensnotwendige Signaltransfersysteme vermittelt. In Prokaryoten werden diese Systeme Zweikomponentensysteme oder Histidin-Protein-Kinasen genannt. Zweikomponentensysteme bieten sich als Ziele zur Entwicklung neuer Medikamente an, da sie in Säugetiersystemen und/oder im Tierreich noch nicht identifiziert wurden. In der vorliegenden Studie wurde die Kristallstruktur der merohedrisch verzwillingten, ligandenfreien, periplasmischen Domäne des Zitratsensors, CitA, von Klebsiella pneumoniae, bestimmt. Klebsiella pneumoniae ist die Hauptursache von Lungenentzündungn, nosokomialer Infektionen, Blutvergiftungen und Infektionen der Harnröhre. Der Vergleich der Strukturen ligandenfreier und ligandengebundener CitA-Domänen warf ein Licht auf einige mechanistische Aspekte des Signaltransfersystemes des Zitratsensors.Wind, ein Produkt des Windbeutel-Genes und Mitglied der Familie der PDI-verwandten Chaperone, ist eines von mehreren Genen, die notwendig für die dorso--ventrale Polarisierung in der Entwicklung des Embryos von Drosophila melanogaster sind. Dorso-ventrale Polarisierung erfordert die Kommunikation zwischen somatischen Zellen, die aus Folikelzellen abgeleitet sind, und Eizellen, die aus der Keimbahn abgeleitet sind. Sie erfolgt durch eine Kaskade an Signaltransferschritten, die Gurken-EGFR-Signalweg genannt wird. Eine zuvor bestimmte Struktur von Wind schlägt einen Homodimer vor, der eine Dimerisierungsschnittstelle entlang der N-terminalen b-Domäne aufweist. Diese hat die charakteristische Faltung von Thioredoxin. Pipe, ein Produkt von pipe, wurde als potentieller Wechselwirkungspartner des Wind-Dimers identifiziert. Eine mögliche Substratbindungsstelle auf Wind wurde beschrieben. Kristallstrukturen mehrerer nicht-funktioneller Mutationen von Wind sowie ein Wind-Peptide-Komplex deuten an, dass die Wind-Pipe-Wechselwirkung vorwiegend auf aromatischem und/oder hydrophobem Verhalten der Substratbindestelle und Erhaltung der Dimerisierungsschnittstelle basiert. Die Kristallstruktur von ERp29, einem engen Verwandten von Wind, offenbart eine ähnliche dreidimensionale Architektur und Erhaltung der Dimerisierungsschnittstelle