Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing

Microbial ecology as a scientific field is fundamentally driven by technological advance. The past decade's revolution in DNA sequencing cost and throughput has made it possible for most research groups to map microbial community composition in environments of interest. However, the computational and statistical methodology required to analyse this kind of data is often not part of the biologist training. In this review, we give a historical perspective on the use of sequencing data in microbial ecology and restate the current need for this method; but also highlight the major caveats with standard practices for handling these data, from sample collection and library preparation to statistical analysis. Further, we outline the main new analytical tools that have been developed in the past few years to bypass these caveats, as well as highlight the major requirements of common statistical practices and the extent to which they are applicable to microbial data. Besides delving into the meaning of select alpha- and beta-diversity measures, we give special consideration to techniques for finding the main drivers of community dissimilarity and for interaction network construction. While every project design has specific needs, this review should serve as a starting point for considering what options are available

Metagenomic and genomic analysis of the skin microbiota

Following birth the skin is rapidly colonised by microorganisms that, over time, delineate into niche-specific microbial communities that often exhibit specific host-associated functions. Due to local physiological conditions, the axilla boasts a unique microbial community that has been implicated in malodour generation via the biotransformation of odourless host-secreted substrates. To more comprehensively understand the role of the axillary microbiome in malodour generation, axillary samples of subjects exhibiting high and low malodour profiles were subject to metagenomic sequencing. Metagenomics is a relatively novel whole-genome shotgun technique that utilises high-throughput sequencing to taxonomically and functionally characterise microbial communities. Prior to the axillary analysis, an in vitro synthetic microbial community of known composition was created and subject to metagenomic sequencing and analysis to determine which methods most accurately represent the taxonomic and functional composition of a microbial community. Additionally, to allow a more thorough understanding of the intraspecies diversity of the most abundant skin genus Staphylococcus, the commensal resident Staphylococcus epidermidis and the closely related pathogen Staphylococcus aureus were both subject to comparative pan-genome analysis. Utilising a direct whole-genome sequencing approach revealed that Corynebacterium might not dominate the axillary microbiota as predominantly as previously thought. A wide range of microbial clades were associated with high levels of axillary malodour, however only the four following species-level groups were enriched: Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium kroppenstedtii, Finegoldia magna and Kocuria rhizophila. The characterised ability of certain corynebacterial species to generate malodorous compounds indicates that C. amycolatum and C. kroppenstedtii may play a major role towards the generation of axillary malodour. Pan-genome analysis of the most abundant skin isolate S. epidermidis and its relative S. aureus resulted in the complete description of the core genome of both species, and revealed that S. epidermidis exhibits a much higher degree of intra-species variability than S. aureus. Also, although both species occupy distinctly divergent life-styles, a large proportion of the conserved function was present in the core-genomes of both species, indicating a high degree of shared conservation. Utilisation of high-throughput sequencing technologies allowed a more in-depth analysis of the axillary microbiota and the intraspecies variability of S. epidermidis and S. aureus

Sequence data mining and characterisation of unclassified microbial diversity

In the last two decades, sequencing has become increasingly affordable and a routine tool to study the microbial community of a given environment. Metagenomics has revolutionised the way microbes are identified and studied in this age of biological data science because it provides a relatively unbiased view of the composition of microbial communities we interact with every day, which are integral to our ecosystem. These technological advances have led to an exponential growth of raw data repositories that save, distribute and archive these metagenomic datasets. Since metagenomics presents the ultimate opportunity to capture, explore and identify uncultivated microbial genomic sequences, these metagenomic datasets harbour a large proportion of unknown sequences that do not bear any similarity to known sequences readily available in the standard sequence data repositories. The aim of this thesis was to systematically catalogue, quantify and potentially characterise the unknown sequences embedded within the metagenomic datasets. To this end, a comprehensive, portable, modular framework called UnXplore was developed to determine the proportion of unknown sequences included in human microbiome datasets. UnXplore was applied to a range of different human microbiomes and showed that on average 2% of assembled sequences were categorised as unknown meaning that they did not bear any sequence similarity to known sequences. A third of the unknown sequences were shown to contain large open reading frames indicating the coding potential and biological origin of the unknowns. Furthermore, a small proportion of these potentially coding sequences were shown to have functional similarities as they were deemed to contain known protein domain signatures. These results indicated that unknown sequences captured through the UnXplore framework were not artefacts and were indeed of biological origin. To test this formally, supervised kmer-based machine learning models were devised, tested and validated. These models are currently distributed in a package called TetraPredX that can accurately predict whether a sequence originated from bacteria, archaea, virus or plasmid. TetraPredX models were applied to the unknown sequence dataset and revealed that the majority of unknown sequences are of biological origin. Furthermore, TetraPredX results demonstrated that >70% of all long unknown sequences (i.e. >1kb) are likely to be of virus origin indicating an unexplored diversity of viruses that is yet to be fully characterised and classified. In order to catalogue the diversity of virus sequences in human microbiome samples analysed here, an extensive virus discovery analysis was carried out on the contigs assembled through UnXplore. This helped to characterise a vast diversity of prokaryotic, eukaryotic and unclassified virus sequences captured in a range of human microbiomes. The results obtained here demonstrate the need to systematically interrogate metagenomic datasets to fully comprehend and compile the presence of both known and unknown uncultivated microbes within them. A comprehensive survey of metagenomic datasets carried out in this manner would provide a more complete picture of the known and unknown organisms that surround us

Genomic Detection Using Sparsity-inspired Tools

Genome-based detection methods provide the most conclusive means for establishing the presence of microbial species. A prime example of their use is in the detection of bacterial species, many of which are naturally vital or dangerous to human health, or can be genetically engineered to be so. However, current genomic detection methods are cost-prohibitive and inevitably use unique sensors that are specific to each species to be detected. In this thesis we advocate the use of combinatorial and non-specific identifiers for detection, made possible by exploiting the sparsity inherent in the species detection problem in a clinical or environmental sample. By modifying the sensor design process, we have developed new molecular biology tools with advantages that were not possible in their previous incarnations. Chief among these advantages are a universal species detection platform, the ability to discover unknown species, and the elimination of PCR, an expensive and laborious amplification step prerequisite in every molecular biology detection technique. Finally, we introduce a sparsity-based model for analyzing the millions of raw sequencing reads generated during whole genome sequencing for species detection, and achieve significant reductions in computational speed and high accuracy

Metabolic profiling for biomarker discovery in biochemical genetics

Functional characterization of the phenotypic consequences of genetic variants increasingly constitutes the rate-limiting step in the study of biochemical genetics. This thesis presents the application of metabolic profiling technologies, including Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and Mass Spectrometry (MS), to identify metabolic perturbations resulting from inborn errors of metabolism, congenital diseases affecting the kidney, and animal models of both genetic mutations and renal pathology. In the case of newborn screening for enzyme deficiencies, two mass spectrometric assays, traditional tandem mass spectrometry (MS/MS) with multiple reaction monitoring and direct injection nanospray high resolution mass spectrometry (ns-HR-MS), were applied to profile dried blood spot (DBS) samples of over 6,000 newborns and identify the metabolic perturbations resulting from 24 congenital disorders of metabolism. To study genetic mutations with more complex phenotypic consequences affecting the kidney, urinary metabolic profiles were evaluated for four congenital kidney diseases. The natural history of cystinosis, showing changes in the urinary profile of cystinosis patients over time and with age, glomerular filtration rate, drug therapy, and transplantation, and a comparison of urinary perturbations seen in these human Mendelian disorders to the perturbations induced by region specific nephrotoxins characterize the urinary metabolic associations with these renal phenotypes. Finally, new computational approaches for analyzing metabolic profiling data are presented and evaluated, including for improving biomarker identification with two-dimensional NMR and increasing metabolomic coverage with high resolution mass spectrometry.Integrating metabolic and genetic diagnostics should enhance understanding of the relationship between genes and health and mechanisms by which genetic variations manifest as inherited disease.Open Acces

Chemical profiling and biotechnological potential of marine microalgae in response to light and abiotic stress

Microalgae form the base of the aquatic food chain and have important ecological functions, including nutrient cycling and carbon capturing. These microscopic eukaryotes are incredibly diverse, with an estimated 72,000 extant species. They have been investigated for their biotechnological potential in industries such as nutraceutical, cosmetic, and biofuel. Most research has focused on specific high-value metabolites such as astaxanthin or β-carotene for human health, or classes of natural products such as polyunsaturated fatty acids for biofuels. However, a systematic untargeted approach to exploring the chemical diversity of microalgal metabolites has yet to be performed. Unlocking this chemical potential could provide further applications and incentives to the microalgal biotechnology sector. This thesis aims to fill this gap by exploring the chemical space of microalgae and the elicitation of further chemistry using abiotic stress. A comparative metabolomics study of 36 microalgal strains from both freshwater and marine environments showed that Haptophytes were a rich source of chemistry compared to the well-studied Chlorophytes. It also explored chemical diversity across strains of the same species, providing evidence that isolation environment rather than phylogenetic relationships could be used to group microalgae based on chemical profiles. To investigate the chemistry produced by three strains of marine microalgae, Dunaliella primolecta, Nannochloropsis oculata, and Phaeodactylum tricornutum were cultured under varying conditions of salinity, sodium chloride, nitrate, and pH and Global Natural Products Social (GNPS) molecular networking was used to gain insights into the effect of these stresses on metabolite production. A total of 2284 metabolites were detected across all strains and conditions, with 49% of those metabolites specific to cultures grown under stress conditions (i.e., not in the control). Salinity had the greatest effect with 22.8% of metabolites only produced under salinity stress. From comparison with over 33 libraries of mass spectral data, only five metabolites were identified, stressing the need for more open-access natural product -and specifically algal natural product - databases. Finally, we partnered with Xanthella Ltd., a marine biotechnology company in Scotland, to study the effect of 405 nm light on growth of four strains of microalgae and the production of antimicrobial metabolites. This wavelength has been shown to reduce bacterial contamination in cultures but is an expensive regimen to apply at a large scale. The production of high-value metabolites under this light regimen could enable culturing under 405 nm illumination to be economically viable. Although no bioactivity was observed from extracts or fractions, molecular networking did show that 16-25% of metabolites were either exclusively produced under 405 nm illumination or absent from the white light control condition. This thesis offers a starting point for fundamental and comparative research into microalgal growth and metabolite production and their applications in human health.Microalgae form the base of the aquatic food chain and have important ecological functions, including nutrient cycling and carbon capturing. These microscopic eukaryotes are incredibly diverse, with an estimated 72,000 extant species. They have been investigated for their biotechnological potential in industries such as nutraceutical, cosmetic, and biofuel. Most research has focused on specific high-value metabolites such as astaxanthin or β-carotene for human health, or classes of natural products such as polyunsaturated fatty acids for biofuels. However, a systematic untargeted approach to exploring the chemical diversity of microalgal metabolites has yet to be performed. Unlocking this chemical potential could provide further applications and incentives to the microalgal biotechnology sector. This thesis aims to fill this gap by exploring the chemical space of microalgae and the elicitation of further chemistry using abiotic stress. A comparative metabolomics study of 36 microalgal strains from both freshwater and marine environments showed that Haptophytes were a rich source of chemistry compared to the well-studied Chlorophytes. It also explored chemical diversity across strains of the same species, providing evidence that isolation environment rather than phylogenetic relationships could be used to group microalgae based on chemical profiles. To investigate the chemistry produced by three strains of marine microalgae, Dunaliella primolecta, Nannochloropsis oculata, and Phaeodactylum tricornutum were cultured under varying conditions of salinity, sodium chloride, nitrate, and pH and Global Natural Products Social (GNPS) molecular networking was used to gain insights into the effect of these stresses on metabolite production. A total of 2284 metabolites were detected across all strains and conditions, with 49% of those metabolites specific to cultures grown under stress conditions (i.e., not in the control). Salinity had the greatest effect with 22.8% of metabolites only produced under salinity stress. From comparison with over 33 libraries of mass spectral data, only five metabolites were identified, stressing the need for more open-access natural product -and specifically algal natural product - databases. Finally, we partnered with Xanthella Ltd., a marine biotechnology company in Scotland, to study the effect of 405 nm light on growth of four strains of microalgae and the production of antimicrobial metabolites. This wavelength has been shown to reduce bacterial contamination in cultures but is an expensive regimen to apply at a large scale. The production of high-value metabolites under this light regimen could enable culturing under 405 nm illumination to be economically viable. Although no bioactivity was observed from extracts or fractions, molecular networking did show that 16-25% of metabolites were either exclusively produced under 405 nm illumination or absent from the white light control condition. This thesis offers a starting point for fundamental and comparative research into microalgal growth and metabolite production and their applications in human health

Omics approaches to study the oral microbiome

Introducción La visión clásica de los microorganismos como agentes infecciosos ha propiciado que se consideren como meros agentes causales de enfermedades. Sin embargo, la larga historia de coexistencia entre microorganismos y los seres humanos, ha hecho que ambos se hayan adaptado mutuamente y coevolucionen (Dubos et al. 1965, McFall-Ngai 2002)⁠. De hecho, en el cuerpo humano habitan 1014 células bacterianas, un orden de magnitud más que células humanas (Savage 1977)⁠. Entre los beneficios que la microbiota aporta, están su contribución a digerir alimentos y a aportar nutrientes, regulación del metabolismo, maduración del sistema inmune, etc. Por ello, hoy en día las enfermedades de origen bacteriano no solo se consideran aquellas en las que un único agente causal produce una infección o produce toxinas, sino también aquellas enfermedades causadas por la pérdida de sus efectos beneficiosos. Entre las enfermedades que transcurren con una alteración de la microbiota están la obesidad (Turnbaugh & Gordon 2009, Turnbaugh et al. 2009, Ferrer et al. 2013)⁠, enfermedad inflamatoria intestinal (Seksik 2010)⁠, vaginosis bacteriana (Ravel et al. 2013)⁠, caries dental (Marsh 2010)⁠, periodontitis (Kumar et al. 2006)⁠, etc, y por tanto su abordaje terapéutico no puede realizarse de una manera clásica, como por ejemplo mediante el uso de antibióticos o vacunas dirigidas al agente causal. Por ello, el estudio de la microbiota en su conjunto y no limitado a ciertas especies patógenas, es fundamental para entender este nuevo tipo de enfermedades. Las técnicas tradicionales basadas en cultivo, tienen la gran limitación de no ser capaces de aislar a la gran mayoría de microorganismos, tal y como ya observó en 1932 Razumov, quien definió la “gran anomalía del recuento en placa” el hecho de que al cultivar en una placa petri una muestra, tan solo crecían un pequeño número de las bacterias observadas al microscopio (Razumov 1932)⁠. El desarrollo a finales de los años 90 de técnicas moleculares, permitieron salvar parcialmente las limitaciones del cultivo. Así se observó que prácticamente todas las superficies y cavidades del cuerpo humano están colonizadas por bacterias. Se han encontrado bacterias incluso partes del cuerpo que se creían estériles, tales como el hígado, leche materna, placas de ateroma, placenta, tejido adiposo o en la sangre bajo ciertas condiciones (Burcelin et al. 2013)⁠. Debido a esta ubicuidad de las bacterias incluso en ausencia de enfermedad, es necesario poder distinguir entre un microbioma sano y uno enfermo, para así poder diagnosticar aquellas enfermedades que transcurren junto con una disbiosis de la comunidad bacteriana, incluso antes de que los síntomas clínicos aparezcan. Grandes consorcios internacionales están llevando a cabo estudios de la microbiota de un gran número de individuos sanos, como por ejemplo el Proyecto del Microbioma Humano estadounidense (HMP 2012)⁠ o el Proyecto META-HIT europeo (Qin et al. 2010)⁠. Cavidad oral Uno de los nichos del microbioma humano más complejo es la cavidad oral, la cual alberga una gran variedad de subnichos y en consecuencia una enorme diversidad microbiana. Está delimitada por los labios, las mejillas, el paladar (dividido en paladar duro y blando), la lengua y el suelo de la boca. Los dientes son estructuras mineralizadas, que están anatómicamente divididas en dos partes, la corona, la parte visible del diente, y la raíz, que es la parte que se inserta en los alveolos dentales. El diente está compuesto por 3 capas diferenciadas, esmalte (cemento en las raíces), dentina y pulpa. El esmalte es la capa más externa de la corona y es el material más duro del cuerpo humano. Está compuesto en un 96% de material inorgánico, principalmente hidroxiapatita. El cemento es la capa más externa de la raíz y su contenido inorgánico es menor (45%), ya que en él se insertan los ligamentos periodontales, haciendo que un 33% sea material orgánico y un 22% de agua. La dentina tiene un 70% de hidroxiapatita y contiene túbulos dentinarios que albergan una matriz de proteínas colágenas y prolongaciones celulares de los odontoblastos (Goldberg et al. 2011)⁠. Aunque no está vascularizada, debido a su estructura tubular y contenido celular hace que sea un tejido vivo, capaz de reaccionar frente a estímulos externos. La pulpa es la parte central del diente, y es la única parte del diente que está vascularizada e inervada. Está compuesta principalmente de tejido conectivo y de los cuerpos celulares de los odontoblastos, los cuales se prolongan a través de los túbulos dentinarios. Las glándulas salivares juegan un importante papel en la cavidad oral, que continuamente secretan saliva. La saliva es un fluido acuoso con una pequeña proporción de compuestos disueltos, como moco, glicoproteínas, electrolitos, enzimas y compuestos antibacterianos (Amerongen & Veerman 2002)⁠. Sus principales funciones son participar en la digestión de grasas y almidón, lubricación de las superficies mucosas y comida para facilitar su deglución, regulación de temperatura y humedad, defensa frente a infecciones, tampón variaciones de pH y control del balance de mineralización-desmineralización del diente. La saliva, al entrar en contacto con las diferentes superficies de la boca, forma una fina capa de unos 8-40 μm llamada película adquirida. Las glicoproteínas presentes en esta película son utilizadas por las bacterias como anclaje para poder adherirse a la superficie del diente, evitando ser arrastradas por la saliva y ser deglutidas (Jenkinson & Lamont 2005)⁠. Comunidades microbianas orales Todas las bacterias que viven en la cavidad oral han de ser capaces de adherirse a alguna superficie, para así evitar ser arrastradas junto con la saliva hacia el estómago. Por ello, prácticamente todas las superficies de la boca son susceptibles de ser colonizadas por biofilms bacterianos. La microbiota presente en la saliva, no es considerada como habitante oral, sin embargo su composición es fruto de la descamación de los biofilms de diversas partes de la boca. Además, debida a la gran variedad de condiciones presentes, la composición microbiana varía entre los diferentes micronichos orales (Zaura et al. 2009, Segata et al. 2012, Simón-Soro et al. 2013a)⁠. Entre las enfermedades orales, caries, gingivitis y periodontitis son las más comunes causadas por microorganismos. Estas enfermedades requieren la formación y acumulación de placa dental, que es un biofilm bacteriano que crece sobre la superficie del diente. Está formado por células bacterianas, fúngicas y epiteliales descamadas, así como glicoproteínas salivares y polisacáridos y proteínas secretadas por microorganismos (Tinanoff & Gross 1976, Mosby 2013)⁠. La placa supragingival se acumula sobre la superficie visible del diente y favorece el crecimiento de bacterias acidogénicas y acidófilas, y es la causante de la caries dental. La placa subgingival se acumula en el surco subgingival, ente la encía y el diente, es un ambiente neutro o ligeramente alcalino y está principalmente compuesto de bacterias Gram negativas. La placa subgingival se caracteriza por desarrollarse en un ambiente típicamente anaeróbico, con un pH neutro o alcalino, y cuya principal fuente de nutrientes es el líquido crevicular y las células descamadas epiteliales. La acumulación de placa subgingival provoca inflamación en las encías, que puede progresar a periodontitis, inflamándose los tejidos de soporte del diente, perdida de hueso alveolar y potencialmente, la pérdida de la pieza dental (Kawar et al. 2011)⁠. Las especies bacterianas asociadas tradicionalmente a gingivitis y periodontitis son las que componen el complejo rojo, Tannerella forsythia, Treponema denticola y Porphyromonas gingivalis (Socransky et al. 1998)⁠. Sin embargo, estudios más recientes también sugieren la implicación de un mayor número de especies en esta patología (Kumar et al. 2006, Fritschi et al. 2008, Colombo et al. 2009, Griffen et al. 2012)⁠. Esto hace que el origen de la gingivitis/periodontitis sea polimicrobiano. La placa supragingival crece sobre las superficies del diente no cubiertas por encía. Las bacterias que viven en este nicho, han de ser capaces de soportar las fuerzas mecánicas de los movimientos de la lengua, saliva, mejillas y masticación, mediante su adhesión. Prácticamente todos los habitantes de la placa supragingival son capaces de adherirse a la película adquirida o a otro de los miembros de la placa (Kolenbrander et al. 2006)⁠. Aunque en principio es un ambiente aeróbico, si el biofilm adquiere cierto grosor, el oxígeno puede ser consumido por las bacterias aeróbicas, creando zonas de microaerofilia dentro del biofilm, favoreciéndose el crecimiento de anaerobios. Las principales fuentes de nutrientes son las glicoproteínas salivares, restos de comida y los componentes celulares desprendidos del epitelio. La actividad metábolica de este biofilm es responsable de la acidificación que causa la desmineralización del esmalte, iniciándose las lesiones de caries. Caries dental La caries dental es la patología derivada de la disolución de la superficie orgánica y mineral del diente, causada esta última por los ácidos producidos por los microorganismos de la placa dental supragingival (Fejerskov et al. 2008)⁠. En condiciones de pH neutro, hay un equilibrio entre mineralización y desmineralización del esmalte, ya que la película adquirida sobre éste está saturada de hidroxiapatita. Cuando el pH baja fruto del metabolismo microbiano de azúcares fermentables, la solubilidad de la hidroxiapatita aumenta y se favorece la desmineralización del esmalte. Una vez los azúcares dejan de estar disponibles, la capacidad de tampón de la saliva hace aumentar de nuevo el pH, reestableciéndose de nuevo el equilibrio. Además, la película adquirida, sobresaturada de iones fosfato y calcio, favorece su precipitación y la remineralización del esmalte. La caries dental se inicia cuando estos ciclos de desmineralización-remineralización se descompensan y aumenta la desmineralización, dándose una pérdida neta de mineral. Gracias a todo el conocimiento acumulado, diferentes teorías se han ido planteando sobre la contribución microbiana a la caries dental. Una de las primeras fue la hipótesis de la placa no específica planteada por Miller (Miller 1890)⁠. En ella sugería que los ácidos producidos por el conjunto de las bacterias presentes en la placa dental al proporcionarles azúcar o almidón eran los responsables de la degradación del esmalte, y no eran fruto de una única especie. También propuso que la caries era una enfermedad con dos etapas, la primera caracterizada por la disolución ácida del esmalte, y la segunda caracterizada por la descomposición de las “sustancias albuminosas” de la dentina, una vez esta queda expuesta. Más tarde, se propuso la hipótesis específica de la placa (Loesche 1986)⁠, coincidiendo con el descubrimiento de Streptococcus mutans. Fitzgerald y Keyes demostraron que esta especie acidogénica era capaz de producir lesiones de caries por sí sola en hamsters albinos (Fitzgerald & Keyes 1960)⁠. Otras especies propuestas como patógenas siguiendo esta hipótesis específica son Streptococcus sobrinus, Lactobacillus casei y Actinomyces odontolyticus (Loesche 1986)⁠. La hipótesis de la placa ecológica propuesta por Marsh (Marsh 1994b)⁠, plantea que la caries tiene lugar cuando una fuente de estrés para el ecosistema de la placa dental, como por ejemplo un mayor aporte de azúcares en la dieta, produce un cambio ambiental en el nicho, una bajada de pH, fruto de la fermentación de éstos. Esta bajada de pH, además de aumentar el riesgo de caries, favorece un cambio en la comunidad bacteriana en la placa dental, debido a la selección de especies acidófilas y acidogénicas. Esto termina por retroalimentar una mayor producción de ácido y por tanto aumentar el riesgo de caries. Por tanto, se considera que la caries acontece junto con una disbiosis de la microbiota, causante última de la caries. Problemas para estudiar la caries dental Aunque la caries dental ha estado presente en el ser humano durante miles de años, no se ha podido encontrar niguna cura efectiva. Entre los múltiples motivos que dificultan el estudio de esta patología se encuentran la falta de consenso sobre la etiología de la enfermedad, a la vista de las múltiples teorías que se han ido planteando a lo largo del tiempo (Rosier et al. 2014)⁠. El hecho de ser una enfermedad polimicrobiana, no cumplir los postulados de Koch clásicos (Koch 1870)⁠, tener un largo período de desarrollo hasta que las lesiones son detectables, ha dificultado su abordaje. Esto unido al gran número factores que influyen en la aparición de la enfermedad, ha hecho que los esfuerzos realizados no hayan sido capaces de encontrar un tratamiento para evitar la caries dental. Por otro lado, las técnicas clásicas de microbiología basadas en el cultivo de cepas ha dificultado el conocimiento exhaustivo del microbioma oral. Aún siendo éste uno de los ecosistemas con más miembros cultivables, tan solo ha sido posible cultivar alrededor del 50% de todos sus habitantes (Paster et al. 2001, Wade 2002, Donachie et al. 2007, Marsh et al. 2011)⁠. Esto ha proporcionado una visión sesgada de este ecosistema, estudiándose únicamente aquellas especies cultivables. La introducción de técnicas moleculares como la clonación, DGGE, microarrays de DNA y RNA y secuenciación del gen 16S rRNA, han mejorado el conocimiento acerca de la diversidad taxonómica en la placa dental, pero presentan un gran número de sesgos y limitaciones (Nyvad et al. 2013)⁠. Las técnicas clásicas moleculares no permiten conocer por ejemplo el conjunto de funciones que una comunidad bacteriana puede llevar a cabo, los genes que se están transcribiendo en determinadas circunstancias o el contenido proteico en su conjunto. Nuevas técnicas para estudiar la caries dental Como consecuencia de estos factores que influyen en la aparición de caries, se necesitan nuevas herramientas que permitan superar las limitaciones existentes. En la última década se han introducido técnicas de alto rendimiento que permiten superar las limitaciones del cultivo, mediante el estudio de moléculas informativas de las comunidades microbianas, como el DNA, RNA, proteínas y metabolitos (Zoetendal et al. 2008, Nyvad et al. 2013)⁠. El análisis de los ácidos nucleicos ha vivido una revolución con la introducción de las técnicas de secuenciación de segunda generación, que han permitido aumentar la cantidad de bases secuenciadas por carrera. A la vez se ha disminuido el tiempo necesario y el coste de obtener la misma cantidad de secuencias. Esto ha permitido el uso de la secuenciación directa tanto de DNA y RNA, obviando la necesidad de cultivo y otras limitaciones asociadas a las técnicas moleculares clásicas como el DGGE, amplificación y secuenciación del gen 16S rRNA, etc. La metagenómica se desarrolló para poder estudiar los genomas presentes en el conjunto de una comunidad bacteriana, y así poder obtener mayor información que con las técnicas basadas en un solo gen marcador filogenético (16S rRNA). De esta manera se puede obtener información sobre la composición taxonómica de la comunidad analizada, así como del total de funciones que potencialmente pueden ser llevadas a cabo. La metatranscriptómica, mediante el análisis de las moléculas de RNA, da a conocer qué especies y genes están transcripcionalmente activos en un momento determinado, lo cual permite conocer las adaptaciones del conjunto de la comunidad bacteriana ante diferentes condiciones ambientales. Por último, la metaproteómica permite conocer las proteínas presentes en la comunidad, reflejando de forma más cercana la actividad funcional que se lleva a cabo. Objetivos El estudio de las comunidades microbianas asociadas al cuerpo humano han experimentado un gran auge desde el inicio del siglo XXI, debido a la introducción de nuevas técnicas de alto rendimiento y eficiencia. Por lo tanto ha permitido estudiar la relación existente entre muchas enfermedades y las comunidades microbianas que poseen los pacientes. A lo largo de esta tesis, algunas de estas nuevas técnicas se han aplicado al estudio de la microbiota de la placa dental humana, para responder a múltiples cuestiones biológicas relativas a la caries dental. Técnicas de secuenciación de alto rendimiento y de metagenómica se han utilizado para salvar las limitaciones inherentes a las técnicas tradicionales basadas en el cultivo de cepas, en un único gen como el 16S rRNA o técnicas de clonación, con el objetivo de descifrar la composición microbiana en estados de salud y enfermedad. El hilo conductor de esta tesis ha sido profundizar en el conocimiento disponible sobre el microbioma en su conjunto y en la porción transcripcionalmente activa, bajo diferentes estados de salud y enfermedad, con el objetivo profundizar en la etiología de la caries dental y proponer estrategias de prevención y diagnóstico. Este objetivo global se subdivide en los siguientes objetivos específicos: Caracterización taxonómica de la comunidad microbiana presente en la placa dental de individuos sanos y con caries, mediante el uso de técnicas no limitadas de antemano ni sesgadas por metodologías como el cultivo, la amplificación mediante PCR o la clonación. Caracterización del potencial genético de los microorganismos habitantes de la placa dental supragingival. Esto debe determinar si las diferencias taxonómicas entre individuos sanos y con caries también se corresponden con diferencias funcionales. Detección de bacterias potencialmente protectoras frente a la caries procedentes de individuos sanos, que puedan ser susceptibles de desarrollo como probióticos anticaries. Proponer posibles genes de virulencia en los genomas de bacterias patógenas, mediante su comparación con muestras metagenómicas de voluntarios sanos, obtenidas del mismo ecosistema de donde se aisló al patógeno en cuestión. Comparar la comunidad microbiana encontrada mediante metagenómica en los biofilms dentales con la fracción transcripcionalmente activa, para poder diferenciar entre las bacterias de paso de las activas en este nicho. Caracterizar las especies transcripcionalmente activas durante la bajada de pH que tiene lugar sobre la superficie del diente después de la ingesta de comidas ricas en carbohidratos, para descubrir las bacterias activas durante la metabolización de azúcares y producción de ácido, potencialmente responsables de la caries dental. Comparar la composición del microbioma oral mediante técnicas metagenómicas, metatranscriptómicas y metaproteómicas. Describir por primera vez el catálogo de proteínas humanas y bacterianas presentes en la placa dental supragingival. Buscar posibles biomarcadores de salud y enfermedad en caries dental que puedan ser potencialmente utilizados en un test diagnóstico. Resultados y conclusiones En el capítulo 3.1 de la presente tesis, investigamos las diferencias a nivel taxonómico y funcional de muestras de placa dental de voluntarios sanos, con caries y muestras obtenidas de lesiones avanzadas de caries, mediante la secuenciación directa del DNA extraído (Alcaraz et al. 2012, Belda-Ferre et al. 2012)⁠. El uso de la metagenómica nos permitió observar que la composición taxonómica, aún siendo similar a otros estudios previos basados en técnicas diferentes, presentaban ciertas diferencias, como un mayor número de géneros minoritarios no detectados por técnicas de PCR del gen 16S rRNA. Al comparar las muestras de individuos sanos con muestras de pacientes con caries, observamos diferencias en la composición taxonómica, corroborando que la caries dental está asociada a un cambio en la microbiota a nivel taxonómico, de acuerdo con la hipótesis ecológica de la placa. Además, al disponer de secuencias procedentes del conjunto de genomas presentes en las muestras, pudimos observar que las diferencias no se debían únicamente a la presencia de diferentes géneros o especies, sino también a diferentes cepas de la misma especie. Tras observar que las personas sanas eran portadoras de cepas de Streptococcus diferentes a las presentes en personas con caries, aislamos 192 cepas. De éstas, se seleccionaron varios aislados debido a su potencial como probiótico protector frente a caries dental, dos de las cuales se describieron como la nueva especie Streptococcus dentisani (Camelo-Castillo et al. 2014)⁠, y en la actualidad están siendo desarrolladas para su comercialización. Este capítulo muestra por tanto cómo la metagenómica puede ayudar a identificar microorganismos con potencial probiótico. En cuanto a la composición funcional, se pudo comprobar que la microbiota intestinal y de la placa dental, no solo se diferencian a nivel taxonómico, sino que también el repertorio funcional de la microbiota de estos dos ecosistemas es diferente. Al poder asignar a cada lectura de DNA tanto una afiliación taxonómica como funcional, se pudo relacionar qué funciones eran llevadas a cabo por cada grupo taxonómico. Se encontraron diferencias entre sujetos sanos y con caries, que incluían funciones sobrerrepresentadas en sujetos sanos, en concreto funciones relacionadas con péptidos antibacterianos, genes de respuesta a estrés periplásmico y polisacáridos extracelulares. En los individuos con caries activas, se encontró que estaban sobrerrepresentadas las funciones relacionadas con fermentación ácida, incorporación de DNA y competencia. Por último, este trabajo fue el primero en secuenciar de forma directa DNA bacteriano procedente de lesiones de caries. Esto permitió observar que son ecosistemas complejos en el que habita una gran diversidad de esp

The role of Clostridium perfringens in intestinal diseases

Clostridium perfringens, a spore-forming bacterium that produces >20 toxins, is known to cause both human and animal intestinal diseases including; foodborne diarrhoea, preterm necrotising enterocolitis (NEC) and necrotic enteritis (NE) in chickens. Currently, there is very limited information on genomic virulence determinants, and the phylogenic and epidemiology landscape of this enteric pathogen, thus in this thesis I sought to comprehensively explore intestinal-associated C. perfringens strains using both genomic and phenotypic methodologies. Whole Genome Sequencing (WGS) and bioinformatic approaches was used to examine a novel collection of C. perfringens isolates and publically available genomes (n=552, including 109 public genomes) from a diverse range of hosts and disease states including; NEC-associated preterm infants, foodborne diarrhoea patients, NEassociated broilers, and healthy humans and animals. These genomes were analysed in combination or as discreet disease subsets to determine infection-linked virulence features, genomic epidemiology and hyper-virulent genotypes, and indicated a highly diverse pangenome (7.4% core genome), toxin-specific and novel virulence factors, widespread distribution of conjugative plasmids, long-term persistence, and interregional transmission events during disease outbreaks. This work represents the largest WGS-based phylogenetic and comparative genomics on C. perfringens to date. Furthermore, a sub-set of C. perfringens isolates were characterised phenotypically using microbiological assays to determine hyper-virulent phenotypes, which linked to genomic analysis. These hyper-virulent strains were then used to establish a novel C. perfringens oral-challenge mouse model. This enteric infection model will allow further mechanistic work in understanding the role of C. perfringens in relevant intestinal diseases and may be used to facilitate therapy or vaccine development. Overall, this multidisciplinary work provides important novel insights into the intestinal pathogen C. perfringens at both a genomic and phenotypic level and provides a platform for subsequent translational studies into efforts to reduce C. perfringens-associated disease burden in both humans and animals

Automatically exploiting genomic and metabolic contexts to aid the functional annotation of prokaryote genomes

Cette thèse porte sur le développement d'approches bioinformatiques exploitant de l'information de contextes génomiques et métaboliques afin de générer des annotations fonctionnelles de gènes prokaryotes, et comporte deux projets principaux. Le premier projet focalise sur les activités enzymatiques orphelines de séquence. Environ 27% des activités définies par le International Union of Biochemistry and Molecular Biology sont encore aujourd'hui orphelines. Pour celles-ci, les méthodes bioinformatiques traditionnelles ne peuvent proposer de gènes candidats; il est donc impératif d'utiliser des méthodes exploitant des informations contextuelles dans ces cas. La stratégie CanOE (fishingCandidate genes for Orphan Enzymes) a été développée et rajoutée à la plateforme MicroScope dans ce but, intégrant des informations génomiques et métaboliques sur des milliers d'organismes prokaryotes afin de localiser des gènes probants pour des activités orphelines. Le projet miroir au précédent est celui des protéines de fonction inconnue. Un projet collaboratif a été initié au Genoscope afin de formaliser les stratégies d'exploration des fonctions de familles protéiques prokaryotes. Une version pilote du projet a été mise en place sur la famille DUF849 dont une fonction enzymatique avait été récemment découverte. Des stratégies de proposition d'activités enzymatiques alternatives et d'établissement de sous familles isofonctionnelles ont été mises en place dans le cadre de cette thèse, afin de guider les expérimentations de paillasse et d'analyser leurs résultats.The subject of this thesis concerns the development of bioinformatic strategies exploiting genomic and metabolic contextual information in order to generate functional annotations for prokaryote genes. Two main projects were involved during this work: the first focuses on sequence-orphan enzymatic activities. Today, roughly 27% of activities defined by International Union of Biochemistry and Molecular Biology are sequence-orphans. For these, traditional bioinformatic approaches cannot propose candidate genes. It is thus imperative to use alternative, context-based approaches in such cases. The CanOE strategy fishing Candidate genes for Orphan Enzymes) was developed and added to the MicroScope bioinformatics platform in this aim. It integrates genomic and metabolic information across thousands of prokaryote genomes in order to locate promising gene candidates for orphan activities. The mirror project focuses on protein families of unknown function. A collaborative project has been set up at the Genoscope in hope of formalising functional exploration strategies for prokaryote protein families. A pilot version was created on the DUF849 Pfam family, for which a single activity had recently been elucidated. Strategies for proposing novel functions and activities and creating isofunctional sub-families were researched, so as to guide biochemical experimentations and to analyse their results.EVRY-Bib. électronique (912289901) / SudocSudocFranceF