Probes, hardware and software for next-generation super-resolution microscopy

Super-resolution microscopy enables optical imaging using fluorescence probes below the diffraction limit. In stochastic super-resolution microscopy, molecules are „switched“ between non-fluorescent dark-state (OFF-state) and fluorescent bright-state (ON-state) in order to pinpoint their position with sub-diffraction precision. The most prominent techniques of localization-based super-resolution microscopy are photo-activated localization microscopy (PALM) and stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Here, the switching between dark- and bright-state is accomplished using photophysical or photochemical processes. A recently introduced super-resolution microscopy method called DNA-PAINT (deoxyribonucleic acid - point accumulation for imaging in nanoscale topography) is based on DNA-DNA interaction. In contrast to STORM or PALM, the fluorescence molecules do not switch between dark and bright states. The so-called „blinking“ in DNA-PAINT is created by transient hybridization of short fluorescent DNA strands (imagers) to their targets. The work in this dissertation focuses on three different advancements in the technological aspect of super-resolution microscopy. Probes In the first project of this thesis, I demonstrate the combination of single-molecule Förster resonance energy transfer (FRET) with DNA-PAINT imaging to overcome some current limitations of the DNA-based super-resolution microscopy. I evaluate the novel probe design with in vitro experiments using DNA nanostructures and prove the performance of the FRET-based probes in a cellular context. Hardware In the second project, I describe a cost-efficient single-molecule microscope platform, which is an order of magnitude more affordable, while still yielding high-performance imaging capacity. Using two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) super-resolution in vitro experiments using DNA nanostructures, I asses the performance of the microscopy platform. Finally, I present exemplary experiments for multiplexed cellular imaging. Software In the last project, I present a software package that is developed to assist during super-resolution data analysis. It is based on the deep learning concept of the artificial neural network (ANN) and designed to automate the classification of nano-scaled patterns found in super-resolution images. I evaluate the performance of the software package using super-resolution in vitro experiments of DNA nanostructures as well as targets in cellular samples.Die superauflösende Mikroskopie ermöglicht die optische Abbildung mittels Fluoreszenzsonden unterhalb der Beugungsgrenze. In stochastischen Superauflösungsmikroskopie werden Moleküle zwischen dem nicht-fluoreszierenden Zustand (OFF-Zustand) und dem fluoreszierenden Zustand (ON-Zusstand) “geschaltet“, um ihre Position präziser als die Beugungsgrenze zu bestimmen. Die bekanntesten Mikroskopietechniken der lokalisationsbasierten Superauflösungsmikroskopie sind photo-activated localization microscopy (PALM) und stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Hier wird die Umschaltung zwischen Dunkel- und Hellzustand mithilfe photophysikalischer oder photochemischer Prozesse durchgeführt. Eine kürzlich eingeführte Methode der Superauflösungsmikroskopie namens DNA-PAINT (deoxyribonucleic acid - point accumulation for imaging in nanoscale topography) basiert auf der DNA-DNA Wechselwirkung. Im Vergleich zu STORM oder PALM wechseln die Fluoreszenzmoleküle nicht zwischen dem dunklen und dem hellen Zustand. Das sogenannte “Blinken“ in DNA-PAINT wird durch transiente Hybridisierung kurzer fluoreszierender DNA Stränge (Imager) an ihre Ziele erzeugt. Die Arbeiten in dieser Dissertation konzentriert sich auf drei unterschiedliche Fortschritte im technologischen Aspekt der Superauflösungsmikroskopie. Sonden Im ersten Projekt dieser Arbeit zeige ich die Kombination von Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer (englisch Förster resonance energy transfer (FRET)) mit DNA-PAINT Mikroskopie, um einige aktuelle Einschränkungen der DNA basierten Superauflösungsmikroskopie zu überwinden. Ich evaluiere das neuartige Sondendesign mithilfe von in vitro Experimenten mit DNA nanostructure und zeige die Leistungsfähigkeit der FRET-basierten Sonden im zellulären Kontext. Hardware Im zweiten Projekt beschreibe ich eine kosteneffiziente Mikroskop-Plattform für Einzelmolekülstudien, die um eine Größenordnung erschwinglicher ist und dennoch eine leistungsstarke Abbildungsfähigkeit bietet. Unter Verwendung von zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen (3D) in vitro Superauflösungsexperimenten von DNA Nanostrukturen bewerte ich die Leistung der Mikroskopie-Plattform. Schließlich zeige ich exemplarische Experimente für die zelluläre Bildgebung in mehreren Farben. Software Im letzten Projekt stelle ich ein Softwarepaket vor, das zur Unterstützung der Analyse von Daten in Superauflösungsmikroskopie entwickelt wurde. Es basiert auf dem Konzept des tiefen Lernens (englisch deep learning) mithilfe von künstlichen neuronalen Netzen und wurde entwickelt, um die Klassifikation von nanoskaligen Mustern zu automatisieren, die in superaufgelösten Bildern zu finden sind. Ich evaluiere die Leistung des Softwarepakets anhand von in vitro Superauflösungsexperimenten von DNA Nanostrukturen sowie von in Zellproben

Probes, hardware and software for next-generation super-resolution microscopy

Super-resolution microscopy enables optical imaging using fluorescence probes below the diffraction limit. In stochastic super-resolution microscopy, molecules are „switched“ between non-fluorescent dark-state (OFF-state) and fluorescent bright-state (ON-state) in order to pinpoint their position with sub-diffraction precision. The most prominent techniques of localization-based super-resolution microscopy are photo-activated localization microscopy (PALM) and stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Here, the switching between dark- and bright-state is accomplished using photophysical or photochemical processes. A recently introduced super-resolution microscopy method called DNA-PAINT (deoxyribonucleic acid - point accumulation for imaging in nanoscale topography) is based on DNA-DNA interaction. In contrast to STORM or PALM, the fluorescence molecules do not switch between dark and bright states. The so-called „blinking“ in DNA-PAINT is created by transient hybridization of short fluorescent DNA strands (imagers) to their targets. The work in this dissertation focuses on three different advancements in the technological aspect of super-resolution microscopy. Probes In the first project of this thesis, I demonstrate the combination of single-molecule Förster resonance energy transfer (FRET) with DNA-PAINT imaging to overcome some current limitations of the DNA-based super-resolution microscopy. I evaluate the novel probe design with in vitro experiments using DNA nanostructures and prove the performance of the FRET-based probes in a cellular context. Hardware In the second project, I describe a cost-efficient single-molecule microscope platform, which is an order of magnitude more affordable, while still yielding high-performance imaging capacity. Using two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) super-resolution in vitro experiments using DNA nanostructures, I asses the performance of the microscopy platform. Finally, I present exemplary experiments for multiplexed cellular imaging. Software In the last project, I present a software package that is developed to assist during super-resolution data analysis. It is based on the deep learning concept of the artificial neural network (ANN) and designed to automate the classification of nano-scaled patterns found in super-resolution images. I evaluate the performance of the software package using super-resolution in vitro experiments of DNA nanostructures as well as targets in cellular samples.Die superauflösende Mikroskopie ermöglicht die optische Abbildung mittels Fluoreszenzsonden unterhalb der Beugungsgrenze. In stochastischen Superauflösungsmikroskopie werden Moleküle zwischen dem nicht-fluoreszierenden Zustand (OFF-Zustand) und dem fluoreszierenden Zustand (ON-Zusstand) “geschaltet“, um ihre Position präziser als die Beugungsgrenze zu bestimmen. Die bekanntesten Mikroskopietechniken der lokalisationsbasierten Superauflösungsmikroskopie sind photo-activated localization microscopy (PALM) und stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Hier wird die Umschaltung zwischen Dunkel- und Hellzustand mithilfe photophysikalischer oder photochemischer Prozesse durchgeführt. Eine kürzlich eingeführte Methode der Superauflösungsmikroskopie namens DNA-PAINT (deoxyribonucleic acid - point accumulation for imaging in nanoscale topography) basiert auf der DNA-DNA Wechselwirkung. Im Vergleich zu STORM oder PALM wechseln die Fluoreszenzmoleküle nicht zwischen dem dunklen und dem hellen Zustand. Das sogenannte “Blinken“ in DNA-PAINT wird durch transiente Hybridisierung kurzer fluoreszierender DNA Stränge (Imager) an ihre Ziele erzeugt. Die Arbeiten in dieser Dissertation konzentriert sich auf drei unterschiedliche Fortschritte im technologischen Aspekt der Superauflösungsmikroskopie. Sonden Im ersten Projekt dieser Arbeit zeige ich die Kombination von Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer (englisch Förster resonance energy transfer (FRET)) mit DNA-PAINT Mikroskopie, um einige aktuelle Einschränkungen der DNA basierten Superauflösungsmikroskopie zu überwinden. Ich evaluiere das neuartige Sondendesign mithilfe von in vitro Experimenten mit DNA nanostructure und zeige die Leistungsfähigkeit der FRET-basierten Sonden im zellulären Kontext. Hardware Im zweiten Projekt beschreibe ich eine kosteneffiziente Mikroskop-Plattform für Einzelmolekülstudien, die um eine Größenordnung erschwinglicher ist und dennoch eine leistungsstarke Abbildungsfähigkeit bietet. Unter Verwendung von zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen (3D) in vitro Superauflösungsexperimenten von DNA Nanostrukturen bewerte ich die Leistung der Mikroskopie-Plattform. Schließlich zeige ich exemplarische Experimente für die zelluläre Bildgebung in mehreren Farben. Software Im letzten Projekt stelle ich ein Softwarepaket vor, das zur Unterstützung der Analyse von Daten in Superauflösungsmikroskopie entwickelt wurde. Es basiert auf dem Konzept des tiefen Lernens (englisch deep learning) mithilfe von künstlichen neuronalen Netzen und wurde entwickelt, um die Klassifikation von nanoskaligen Mustern zu automatisieren, die in superaufgelösten Bildern zu finden sind. Ich evaluiere die Leistung des Softwarepakets anhand von in vitro Superauflösungsexperimenten von DNA Nanostrukturen sowie von in Zellproben

Quantification of biomolecular binding dynamics by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Diffusion and molecular binding processes are indispensable for biological systems. A vital step towards the understanding of such dynamics and their interplay is a thorough quantification of all parameters involved. This work addresses the characterization of biomolecular diffusion and binding dynamics using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). To quantify the reversible surface attachment of fluorescently labeled molecules, a novel method termed surface-integrated FCS (SI-FCS) is developed. Using this technique, the association and dissociation rates of receptor-ligand pairs can be determined over a wide range of time scales, ranging from hundreds of milliseconds to tens of seconds. The surface of interest is exposed to a widefield illumination and a highly sensitive electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera is used for detection, not only providing single-molecule sensitivity, but also enabling a parallel detection of the signal, which facilitates multiplexed SI-FCS measurements across the field of view. To validate this approach, we quantify the reversible hybridization of single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA) using a standard total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope. The nucleotide overlap was systematically varied to demonstrate the sensitivity of SI-FCS. Furthermore, this work extensively employs FCS in its more conventional form using a confocal microscope. The effect of refractive index mismatches on single-focus FCS measurements is thoroughly characterized and a regime in which unbiased experiments are possible is identified. Confocal FCS is used to monitor the filament formation of FtsZ proteins (filamenting temperature-sensitive mutant Z) and their breakage by the protein MipZ in vitro. Potential artifacts are identified and a novel model to analyze diffusing filaments in FCS experiments is derived, applied, and validated. These findings not only demonstrate that filament formation can be efficiently studied using confocal FCS, but also indicate that FtsZ from Caulobacter crescentus may intrinsically form small oligomers. Finally, this work characterizes the diffusion of biomolecules in lipid monolayers at the air-water interface using confocal FCS. A miniaturized fixed area-chamber, which requires only minute amounts of protein, is presented and validated. Using this design, monolayer experiments become accessible to studies where biomolecules can only be purified in small amounts. Moreover, the quantification of diffusion in monolayers using FCS is a major step towards the routine characterization of binding of biomolecules to lipid monolayers.Diffusion und molekulare Bindungsreaktionen sind elementare Prozesse in biologischen Systemen. Für das Verständnis solcher Dynamiken und deren Wechselwirkungen ist es letztlich unabdingbar die beteiligten Parameter exakt zu quantifizieren. Diesem Ziel folgend setzt sich diese Arbeit mit der Quantifizierung von Diffusions- und Bindungsdynamiken unter Nutzung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) auseinander. Um die Assoziations- und Dissoziationsraten von reversiblen Bindungsreaktionen an Oberflächen zu messen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neuartige Methode namens "surface-integrated FCS" (SI-FCS) entwickelt. Mittels dieser Methode können Bindungsraten zwischen Rezeptoren und fluoreszierenden Liganden in Zeitbereichen von Millisekunden bis über einer Minute gemessen werden. Die zu untersuchende Oberfläche, an der die Bindungsreaktionen stattfinden, wird mit einer Weitfeldausleuchtung beschienen und die daraufhin emittierte Fluoreszenz von den Liganden wird mit einer sehr empfindlichen Kamera (electron-multiplying charge-coupled device) detektiert. Diese Flächendetektion verfügt nicht nur über ausreichende Empfindlichkeit um einzelne Moleküle zu detektieren, sondern ermöglicht auch die parallele Messung mehrerer Autokorrelationskurven im Sichtfeld. Zur Validierung dieses neuartigen Ansatzes wird die reversible Hybridisierung von Desoxyribonukleinsäuren (DNS) mit einem im Rahmen dieser Arbeit konstruierten totalreflexionsbasiertem Fluoreszenzmikroskop (TIRF Mikroskop) quantifiziert. Die Anzahl der hybridisierenden Basenpaare wird in dieser Studie systematisch variiert und drückt sich in klaren Änderungen der gemessenen Bindungsraten aus. Damit wird die Sensitivität der Methode unterstrichen. Darüber hinaus bedient sich diese Arbeit der konventionellen konfokalen FCS. Das Problem von Proben, die einen anderen Brechungsindex als den von Wasser aufweisen, wird intensiv im Kontext von FCS Messungen beleuchtet. Abschließend werden Messbedingungen aufgezeigt unter denen systematische Messfehler und Artefakte, die auf den Brechungsindex zurückzuführen sind, vermieden werden können. In einem Teil dieser Arbeit wird die konfokale FCS genutzt um die Polymerisation von FtsZ Proteinen (Filamenting Temperature-Sensitive Z), sowie deren Zerlegung durch das Protein MipZ, zu untersuchen. Potentielle Fehlerquellen solcher Messungen werden beleuchtet und ein neues Modell für die Analyse von konfokalen FCS Messungen an Filamenten wird hergeleitet. Die präsentierten Ergebnisse zeigen nicht nur, dass FCS eine geeignete Methode ist umWachstum und Zerfall von Filamenten im Allgemeinen zu charakterisieren, sondern liefern auch deutliche Hinweise, dass FtsZ aus dem Bakterium Caulobacter crescentus auch in Abwesenheit von Guanosintriphosphat (GTP) kurze Oligomere bildet. Letzteres ist insbesondere interessant, da typischerweise angenommen wird, dass FtsZ als monomeres Protein vorliegt und erst in Anwesenheit von GTP zu Filamenten polymerisiert. Abschließend quantifiziert diese Arbeit die Diffusion von Biomolekülen in Lipidmonoschichten an der Grenzfläche zwischen Luft und Wasser. Unter Verwendung der konfokalen FCS werden Messungen in Miniaturkammern durchgeführt und validiert. Mithilfe dieser Methode werden Messungen an Biomolekülen ermöglicht, die nur in sehr geringen Mengen aufgereinigt werden können. Die hier präsentierten Diffusionsmessungen stellen einen wichtigen Schritt hin zur FCS basierten Charakterisierung der Bindungskinetiken von Biomolekülen zu Lipidmonoschichten dar

Quantification of biomolecular binding dynamics by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Diffusion and molecular binding processes are indispensable for biological systems. A vital step towards the understanding of such dynamics and their interplay is a thorough quantification of all parameters involved. This work addresses the characterization of biomolecular diffusion and binding dynamics using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). To quantify the reversible surface attachment of fluorescently labeled molecules, a novel method termed surface-integrated FCS (SI-FCS) is developed. Using this technique, the association and dissociation rates of receptor-ligand pairs can be determined over a wide range of time scales, ranging from hundreds of milliseconds to tens of seconds. The surface of interest is exposed to a widefield illumination and a highly sensitive electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera is used for detection, not only providing single-molecule sensitivity, but also enabling a parallel detection of the signal, which facilitates multiplexed SI-FCS measurements across the field of view. To validate this approach, we quantify the reversible hybridization of single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA) using a standard total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope. The nucleotide overlap was systematically varied to demonstrate the sensitivity of SI-FCS. Furthermore, this work extensively employs FCS in its more conventional form using a confocal microscope. The effect of refractive index mismatches on single-focus FCS measurements is thoroughly characterized and a regime in which unbiased experiments are possible is identified. Confocal FCS is used to monitor the filament formation of FtsZ proteins (filamenting temperature-sensitive mutant Z) and their breakage by the protein MipZ in vitro. Potential artifacts are identified and a novel model to analyze diffusing filaments in FCS experiments is derived, applied, and validated. These findings not only demonstrate that filament formation can be efficiently studied using confocal FCS, but also indicate that FtsZ from Caulobacter crescentus may intrinsically form small oligomers. Finally, this work characterizes the diffusion of biomolecules in lipid monolayers at the air-water interface using confocal FCS. A miniaturized fixed area-chamber, which requires only minute amounts of protein, is presented and validated. Using this design, monolayer experiments become accessible to studies where biomolecules can only be purified in small amounts. Moreover, the quantification of diffusion in monolayers using FCS is a major step towards the routine characterization of binding of biomolecules to lipid monolayers.Diffusion und molekulare Bindungsreaktionen sind elementare Prozesse in biologischen Systemen. Für das Verständnis solcher Dynamiken und deren Wechselwirkungen ist es letztlich unabdingbar die beteiligten Parameter exakt zu quantifizieren. Diesem Ziel folgend setzt sich diese Arbeit mit der Quantifizierung von Diffusions- und Bindungsdynamiken unter Nutzung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) auseinander. Um die Assoziations- und Dissoziationsraten von reversiblen Bindungsreaktionen an Oberflächen zu messen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neuartige Methode namens "surface-integrated FCS" (SI-FCS) entwickelt. Mittels dieser Methode können Bindungsraten zwischen Rezeptoren und fluoreszierenden Liganden in Zeitbereichen von Millisekunden bis über einer Minute gemessen werden. Die zu untersuchende Oberfläche, an der die Bindungsreaktionen stattfinden, wird mit einer Weitfeldausleuchtung beschienen und die daraufhin emittierte Fluoreszenz von den Liganden wird mit einer sehr empfindlichen Kamera (electron-multiplying charge-coupled device) detektiert. Diese Flächendetektion verfügt nicht nur über ausreichende Empfindlichkeit um einzelne Moleküle zu detektieren, sondern ermöglicht auch die parallele Messung mehrerer Autokorrelationskurven im Sichtfeld. Zur Validierung dieses neuartigen Ansatzes wird die reversible Hybridisierung von Desoxyribonukleinsäuren (DNS) mit einem im Rahmen dieser Arbeit konstruierten totalreflexionsbasiertem Fluoreszenzmikroskop (TIRF Mikroskop) quantifiziert. Die Anzahl der hybridisierenden Basenpaare wird in dieser Studie systematisch variiert und drückt sich in klaren Änderungen der gemessenen Bindungsraten aus. Damit wird die Sensitivität der Methode unterstrichen. Darüber hinaus bedient sich diese Arbeit der konventionellen konfokalen FCS. Das Problem von Proben, die einen anderen Brechungsindex als den von Wasser aufweisen, wird intensiv im Kontext von FCS Messungen beleuchtet. Abschließend werden Messbedingungen aufgezeigt unter denen systematische Messfehler und Artefakte, die auf den Brechungsindex zurückzuführen sind, vermieden werden können. In einem Teil dieser Arbeit wird die konfokale FCS genutzt um die Polymerisation von FtsZ Proteinen (Filamenting Temperature-Sensitive Z), sowie deren Zerlegung durch das Protein MipZ, zu untersuchen. Potentielle Fehlerquellen solcher Messungen werden beleuchtet und ein neues Modell für die Analyse von konfokalen FCS Messungen an Filamenten wird hergeleitet. Die präsentierten Ergebnisse zeigen nicht nur, dass FCS eine geeignete Methode ist umWachstum und Zerfall von Filamenten im Allgemeinen zu charakterisieren, sondern liefern auch deutliche Hinweise, dass FtsZ aus dem Bakterium Caulobacter crescentus auch in Abwesenheit von Guanosintriphosphat (GTP) kurze Oligomere bildet. Letzteres ist insbesondere interessant, da typischerweise angenommen wird, dass FtsZ als monomeres Protein vorliegt und erst in Anwesenheit von GTP zu Filamenten polymerisiert. Abschließend quantifiziert diese Arbeit die Diffusion von Biomolekülen in Lipidmonoschichten an der Grenzfläche zwischen Luft und Wasser. Unter Verwendung der konfokalen FCS werden Messungen in Miniaturkammern durchgeführt und validiert. Mithilfe dieser Methode werden Messungen an Biomolekülen ermöglicht, die nur in sehr geringen Mengen aufgereinigt werden können. Die hier präsentierten Diffusionsmessungen stellen einen wichtigen Schritt hin zur FCS basierten Charakterisierung der Bindungskinetiken von Biomolekülen zu Lipidmonoschichten dar