Probing entry inhibitors' activity on HIV and development of new fusion inhibitors : integrating evolutionary biology with virology

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011The general aims of this thesis were: 1) to examine the C2, V3 and C3 envelope regions ofHIV-1 and HIV-2 at the molecular, evolutionary and structural levels; 2) to compare HIV-1and HIV-2 susceptibility to entry inhibitors and assess their potential value in HIV-2therapy; 3) to produce a new fusion inhibitor peptide using evolutionary biology basedstrategies.In the first study (Chapter 2), HIV-1 and HIV-2 were compared at the molecular,evolutionary and structural levels in the C2, V3 and C3 envelope regions. We identifiedsignificant structural and functional constrains to the diversification and evolution of C2,V3 and C3 in the HIV-2 envelope but not in HIV-1. In particular, we found that V3 in HIV-2is less exposed and more conserved than in HIV-1, suggesting fundamental differences inthe biology and infection of these viruses as well as in their susceptibility to entryinhibitors.In the second study (Chapter 3) we measured the baseline susceptibility of HIV-1 and HIV-2primary isolates to different fusion inhibitors and coreceptor antagonists, includingenfuvirtide (T-20) and maraviroc (MVC). MVC inhibited HIV-2 R5 variants at significantlyhigher IC90 concentrations than HIV-1 variants. Moreover, as previously found in HIV-1,susceptibility of HIV-2 R5 variants to MVC was inversely related with CD4+ T cell counts attime of virus isolation. These results suggest that the structure of the envelope complex ofR5 variants changes along the course of infection. More importantly, the results call fornew clinical studies to evaluate the efficacy of MVC in HIV-2 infection and to determine itsbest therapeutic dosage in early and late stage disease. We also provide definitiveevidence demonstrating that T-20 is not useful for HIV-2 therapy.In the final study (Chapter 4), we designed a new HIV fusion inhibitor peptide (P3) basedon the ancestral sequences of the HIV-2 and SIV envelope genes. P3 has an a-helixstructure as demonstrated by circular dichroism. It has broad antiviral activity at thenanomolar range against HIV-1 and HIV-2 primary isolates, including HIV-1 variantsresistant to T-20. Binding ELISA assays and selection of resistant mutants suggest that P3prevents viral fusion by binding to the transmembrane protein in the HR1 region. Thesestudies provide proof of concept that viable antiviral peptides can be constructed usingevolutionary biology strategies. Such strategies should be explored to enhance theproduction of peptide drugs and vaccines.O Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1 e do tipo 2 (VIH-1 e VIH-2) são os agentes etiológicos do Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Embora sejam semelhantes na sua organização estrutural e genómica, estes lentivírus humanos apresentam características antigénicas distintas e partilham uma semelhança genética de apenas 50%. Enquanto o VIH-1 é responsável pela pandemia mundial, a infecção pelo VIH-2 localiza-se sobretudo na África Ocidental, em alguns países europeus como Portugal e França, e na Índia. A infecção pelo VIH-2 tem melhor prognóstico, a progressão para a doença é mais lenta e há melhor controlo imunológico do que na infecção pelo VIH-1. Ao contrário do VIH-1, o arsenal terapêutico actualmente disponível para tratar a infecção por VIH-2 é reduzido. Os fármacos antiretrovirais em uso foram especificamente desenvolvidos para o VIH-1 e, consequentemente, a sua actividade pode ser reduzida ou nula no VIH-2. Este é o caso concreto dos inibidores não nucleosídicos da transcriptase reversa e de alguns inibidores da protease. Neste contexto, os inibidores de entrada poderão ser úteis para tratar a infecção por VIH-2. Contudo, a susceptibilidade dos isolados primários de VIH-2 aos inibidores de entrada é actualmente desconhecida. A susceptibilidade do VIH aos inibidores de entrada é determinada pela qualidade da interacção do vírus com os receptores celulares. O VIH-1 e VIH-2 são substancialmente diferentes a este nível. Por exemplo, o VIH-2 pode ligar-se ao co-receptor CCR5 independentemente do receptor CD4 e da região V3 do invólucro. Por outro lado, as regiões C2, V3 e C3 do VIH-2 são substancialmente diferentes do VIH-1 a nível antigénico. Colectivamente, estes dados indicam que a estrutura e conformação das glicoproteínas de superfície do VIH-1 e VIH-2 são substancialmente diferentes e sugerem que a susceptibilidade e resistência dos dois tipos de vírus aos inibidores de entrada podem também ser diferentes. Os principais objectivos desta tese foram: 1) analisar as características moleculares, estruturais e evolutivas das regiões C2, V3 e C3 no VIH-1 e VIH-2; 2) comparar a susceptibilidade do VIH-1 e VIH-2 aos inibidores de entrada e avaliar o seu potencial terapêutico na infecção por VIH-2; 3) produzir um novo inibidor de fusão para o VIH-2. Para melhor compreender as potenciais diferenças destes dois vírus na resposta aos inibidores de entrada começámos por analisar as características moleculares, estruturais e evolutivas da região V3 e as regiões circundantes C2 e C3, num número significativo de vírus VIH-1 e VIH-2 isolados em Portugal e noutras regiões do globo, com recurso a diferentes metodologias de biologia evolutiva e computacional (Capitulo 2). Apesar da menor variabilidade das 3 regiões no VIH-2, verificámos que a região C3 está sob forte selecção positiva e encontra-se exposta à superfície sugerindo que, tal como no VIH-1, esta região poderá constituir um domínio neutralizante. No entanto, ao contrário do VIH-1, a maioria das mutações adaptativas no VIH-2 são prejudiciais e levam à extinção das linhagens virais pelo que o efeito final é um forte constrangimento à variabilidade das regiões analisadas. Ao contrário do VIH-1, verificámos que a ansa V3 do VIH-2 se encontra oclusa no complexo glicoproteico do invólucro, numa conformação que parece ser estabilizada por interacções que mantém com alguns resíduos da regiões C2 e C3. Estes resultados são consistentes com o facto de a V3 não ser imunodominante no VIH-2, ficando assim mais protegida da resposta imunitária e das eventuais mutações que dela resultam. A forte conservação da V3, da C2 e da C3 também é consistente com a sua potencialmente importante actividade imunosupressora. Em conclusão, este primeiro estudo permitiu caracterizar algumas das características estruturais e funcionais que distinguem as glicoproteínas do invólucro do VIH-1 e do VIH-2 e que estão associadas às diferentes características biológicas e fenotípicas destes dois vírus. Estes dados podem ter impacto na resposta dos dois vírus aos inibidores de entrada (analisado no Capítulo 3) e no desenvolvimento de novas vacinas. No segundo estudo (Capítulo 3) comparámos a actividade antiviral dos antagonistas dos coreceptores (AMD3100, TAK-779 e maraviroc) e dos inibidores de fusão (T-20 e T-1249) entre um grupo de 20 isolados de VIH-2 (19 isolados primários + um isolado laboratorial) e nove isolados de VIH-1 (sete isolados primários + dois isolados laboratoriais). Verificámos que a sensibilidade ao AMD3100 e ao TAK-779 é semelhante no VIH-1 e o VIH-2. No entanto, o perfil da curva dose-resposta do maraviroc (MVC) obtido para os isolados R5 foi diferente nos dois tipos de vírus. No VIH-2 os valores de IC90 foram significativamente mais elevados do que no VIH-1; por outro lado, os declives da curva dose-resposta foram mais baixos no VIH-2 do que no VIH-1. Colectivamente, estes resultados sugerem que poderão ser necessárias concentrações mais elevadas de MVC para tratar os doentes infectados pelo VIH-2. Adicionalmente, encontrámos uma correlação forte e de sentido inverso entre as susceptibilidade do VIH-2 ao MVC e o número de células T CD4+ dos doentes quando os vírus foram isolados. Vírus isolados em doentes em fase de SIDA foram menos susceptíveis ao MVC do que os vírus isolados em doentes com uma contagem de células T CD4+ superior a 200 células/ul. Ao contrário do VIH-1 não encontrámos qualquer correlação entre a carga da V3 e a susceptibilidade dos isolados R5 de VIH-2 ao MVC. De um modo geral, os nossos resultados sugerem que são necessários ensaios clínicos para avaliar a efectividade do MVC na infecção pelo VIH-2, determinar a dose terapêutica mais adequada e esclarecer se é necessário fazer um ajuste de dose de acordo com a fase da doença. Adicionalmente, e uma vez que isolados VIH-2 X4 e populações duplas/mistas são totalmente ou parcialmente resistentes ao MVC, é de extrema importância o desenvolvimento de um ensaio de tropismo (genotípico e/ou fenotípico) para o VIH-2 de modo a determinar o tropismo antes do início da terapia com MVC. Sem o conhecimento prévio do tropismo viral, o tratamento com MVC poderá seleccionar espécies X4 minoritárias que estão associadas a maior resistência à neutralização e uma progressão mais rápida da doença. No que diz respeito aos inibidores de fusão, verificámos que o T-20 tem actividade reduzida no VIH-2, confirmando estudos anteriores realizados com dois isolados laboratoriais. Por outro lado, observámos uma elevada susceptibilidade deste vírus ao T- 1249, indicando que os inibidores de fusão são potencialmente eficazes na infecção pelo VIH-2. Assim, o desenvolvimento de um novo inibidor de fusão do VIH-2 foi o objectivo do último estudo desta tese (Capítulo 4). No Capítulo 4, desenvolvemos novos péptidos inibidores de fusão a partir da reconstrução de sequências ancestrais da glicoproteína gp36 do invólucro de VIH-2 e de Vírus de Imunodeficiência dos Símios (VIS). Com esta abordagem inovadora pretendemos incorporar a história evolutiva dos vírus na sequência dos péptidos e desta forma melhorar a tolerância destas moléculas aos polimorfismos naturais da sua região alvo bem como às mutações de resistência seleccionadas na sua presença. Obteve-se um péptido ancestral (P3) constituído por 34 aminoácidos, cuja sequência corresponde às posições homólogas 628 – 661 da proteína Env do isolado VIH-1 HXB2 (ou 623 – 656 do isolado VIH-2 ROD). A sequência do P3 difere em 21 aminoácidos da sequência consenso de VIH-1, 14 aminoácidos da sequência do T-20 e 6 aminoácidos da sequência consenso de VIH-2. Ao contrário da natureza não-estruturada do T-20, o P3 tem uma conformação típica em hélice-a, o que lhe poderá conferir maior a estabilidade contra a degradação proteolítica, bem como maior afinidade para a região alvo. Por outro lado, o P3 foi facilmente solúvel em soluções aquosas o que é uma vantagem num futuro desenvolvimento de uma fórmula farmacêutica. O P3 demonstrou ter uma forte actividade antiviral contra isolados primários e laboratoriais de VIH-1 e VIH-2 (IC50 médio, 11 nM para o HIV-1 e 63.8 nM para o HIV-2), incluindo variantes resistentes ao T-20 (IC50, 0.15 – 11.8 nM). Através da passagem consecutiva de vírus em cultura na presença do péptido, foi seleccionada uma mutação de resistência na região HR1 da gp41 (VIH-1), a qual é responsável pela redução da susceptibilidade do VIH-1 ao P3 em 120x. Nas mesmas condições, e após 60 dias em cultura, não foi possível seleccionar mutações de resistência ao P3 no VIH-2. Estes resultado, em conjugação com a sua forte ligação à glicoproteína transmembranar de um isolado de VIH-2, indicam que, tal como outros péptidos baseados na região HR2 (T-20, T- 1249), o P3 inibe a entrada do VIH pela interacção com a região HR1 da gp41 e sugerem que a barreira genética para a resistência ao P3 é significativamente superior no VIH-2 do que no VIH-1. Neste estudo demonstrámos ainda que o P3 é significativamente menos antigénico do que o T-20 nos doentes infectados pelo VIH-1 o que poderá traduzir-se numa maior duração da eficácia clínica do P3 em comparação com o T-20. Os resultados obtidos com o P3 demonstram pela primeira vez que é possível desenvolver péptidos com actividade antiviral significativa utilizando metodologias de biologia evolutiva, pelo que esta abordagem poderá ser explorada no futuro para a produção de medicamentos peptídicos e, eventualmente, de vacinas

Proteomics computational analyses suggest that the bornavirus glycoprotein is a class III viral fusion protein (γ penetrene)

Abstract Background Borna disease virus (BDV) is the type member of the Bornaviridae, a family of viruses that induce often fatal neurological diseases in horses, sheep and other animals, and have been proposed to have roles in certain psychiatric diseases of humans. The BDV glycoprotein (G) is an extensively glycosylated protein that migrates with an apparent molecular mass of 84,000 to 94,000 kilodaltons (kDa). BDV G is post-translationally cleaved by the cellular subtilisin-like protease furin into two subunits, a 41 kDa amino terminal protein GP1 and a 43 kDa carboxyl terminal protein GP2. Results Class III viral fusion proteins (VFP) encoded by members of the Rhabdoviridae, Herpesviridae and Baculoviridae have an internal fusion domain comprised of beta sheets, other beta sheet domains, an extended alpha helical domain, a membrane proximal stem domain and a carboxyl terminal anchor. Proteomics computational analyses suggest that the structural/functional motifs that characterize class III VFP are located collinearly in BDV G. Structural models were established for BDV G based on the post-fusion structure of a prototypic class III VFP, vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV G). Conclusion These results suggest that G encoded by members of the Bornavirdae are class III VFPs (gamma-penetrenes).</p

ADAPTIVE IMMUNITY AND THE TUMOR IMMUNE MICROENVIRONMENT

The adaptive immune system is essential for production of anti-tumor immune responses, with the majority of current immunotherapeutics designed to modulate the interaction between adaptive immunity and tumor cells within the tumor-immune microenvironment. This dissertation addresses three translational goals regarding our understanding and modulation of anti-tumor adaptive immunity: 1) Improvement of understanding for existing immunotherapies such as checkpoint inhibitor therapy (Chapter 2.1); 2) Improvement of efficacy for novel immunotherapeutics currently in development including tumor neoantigen vaccines (Chapter 4); and 3) Development of next-generation immunotherapies through identification of novel anti-tumor vaccine targets (Chapter 3), as well as development of diagnostic tools including biomarkers of immunotherapy response (Chapter 3) and immune-imaging modalities (Chapter 2.1).Doctor of Philosoph

Structural Descriptors of gp120 V3 Loop for the Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage

HIV-1 cell entry commonly uses, in addition to CD4, one of the chemokine receptors CCR5 or CXCR4 as coreceptor. Knowledge of coreceptor usage is critical for monitoring disease progression as well as for supporting therapy with the novel drug class of coreceptor antagonists. Predictive methods for inferring coreceptor usage based on the third hypervariable (V3) loop region of the viral gene coding for the envelope protein gp120 can provide us with these monitoring facilities while avoiding expensive phenotypic tests. All simple heuristics (such as the 11/25 rule) as well as statistical learning methods proposed to date predict coreceptor usage based on sequence features of the V3 loop exclusively. Here, we show, based on a recently resolved structure of gp120 with an untruncated V3 loop, that using structural information on the V3 loop in combination with sequence features of V3 variants improves prediction of coreceptor usage. In particular, we propose a distance-based descriptor of the spatial arrangement of physicochemical properties that increases discriminative performance. For a fixed specificity of 0.95, a sensitivity of 0.77 was achieved, improving further to 0.80 when combined with a sequence-based representation using amino acid indicators. This compares favorably with the sensitivities of 0.62 for the traditional 11/25 rule and 0.73 for a prediction based on sequence information as input to a support vector machine and constitutes a statistically significant improvement. A detailed analysis and interpretation of structural features important for classification shows the relevance of several specific hydrogen-bond donor sites and aliphatic side chains to coreceptor specificity towards CCR5 or CXCR4. Furthermore, an analysis of side chain orientation of the specificity-determining residues suggests a major role of one side of the V3 loop in the selection of the coreceptor. The proposed method constitutes the first approach to an improved prediction of coreceptor usage based on an original integration of structural bioinformatics methods with statistical learning

Uncovering the Tumor Antigen Landscape : What to Know about the Discovery Process

According to the latest available data, cancer is the second leading cause of death, highlighting the need for novel cancer therapeutic approaches. In this context, immunotherapy is emerging as a reliable first-line treatment for many cancers, particularly metastatic melanoma. Indeed, cancer immunotherapy has attracted great interest following the recent clinical approval of antibodies targeting immune checkpoint molecules, such as PD-1, PD-L1, and CTLA-4, that release the brakes of the immune system, thus reviving a field otherwise poorly explored. Cancer immunotherapy mainly relies on the generation and stimulation of cytotoxic CD8 T lymphocytes (CTLs) within the tumor microenvironment (TME), priming T cells and establishing efficient and durable anti-tumor immunity. Therefore, there is a clear need to define and identify immunogenic T cell epitopes to use in therapeutic cancer vaccines. Naturally presented antigens in the human leucocyte antigen-1 (HLA-I) complex on the tumor surface are the main protagonists in evocating a specific anti-tumor CD8+ T cell response. However, the methodologies for their identification have been a major bottleneck for their reliable characterization. Consequently, the field of antigen discovery has yet to improve. The current review is intended to define what are today known as tumor antigens, with a main focus on CTL antigenic peptides. We also review the techniques developed and employed to date for antigen discovery, exploring both the direct elution of HLA-I peptides and the in silico prediction of epitopes. Finally, the last part of the review analyses the future challenges and direction of the antigen discovery field.Peer reviewe

An HIV-1 encoded peptide mimics the DNA binding loop of NF-?B and binds thioredoxin with high affinity

Pro-fs is a human immunodeficiency virus type 1 (HIV-l)-encoded putative selenoprotein, predicted by a theoretical analysis of the viral genome; it is potentially expressed by a -1 frameshift from the protease coding region. Pro-fs has significant sequence similarity to the DNA binding loop of nuclear factor kappa B (NF-kappaB), which is known to bind thioredoxin (Trx). We hypothesize that the putative HIV-1 pro-fs gene product functions by mimicry of NF-kappaB via binding to Trx. The hypothesis was tested in vitro by co-immunoprecipitation and GST-pull down assays, using a purified mutant pro-fs protein, in which the two potential selenocysteine residues were mutated to cysteines, in order to permit expression in bacteria. Both experiments showed that pro-fs binds to human wild type Trx (Trx-wt) with high affinity. Mutation of the two conserved cysteine residues in the Trx active site redox center to serine (Ser) (Trx-CS) weakened but failed to abolish the interaction. In pro-fs-transfected 293T cells, using confocal microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET), we have observed that pro-fs localizes in cell nuclei and forms oligomers. Upon stimulation by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), Trx translocates into cell nuclei. Significant FRET efficiency was detected in the nuclei of PMA-stimulated 293T cells co-expressing fluorescence-tagged pro-fs and Trx-wt or Trx-CS. These results indicate that in living cells the double cysteine mutant of pro-fs binds to both Trx and Trx-CS with high affinity, suggesting that Trx-pro-fs binding is a structurally-specific interaction, involving more of the Trx molecule than just its active site cysteine residues. These results establish the capacity for functional mimicry of the Trx binding ability of the NF-kappaB/Rel family of transcription factors by the putative HIV-1 pro-fs protein

Structural Optimization and De Novo Design of Dengue Virus Entry Inhibitory Peptides

Viral fusogenic envelope proteins are important targets for the development of inhibitors of viral entry. We report an approach for the computational design of peptide inhibitors of the dengue 2 virus (DENV-2) envelope (E) protein using high-resolution structural data from a pre-entry dimeric form of the protein. By using predictive strategies together with computational optimization of binding “pseudoenergies”, we were able to design multiple peptide sequences that showed low micromolar viral entry inhibitory activity. The two most active peptides, DN57opt and 1OAN1, were designed to displace regions in the domain II hinge, and the first domain I/domain II beta sheet connection, respectively, and show fifty percent inhibitory concentrations of 8 and 7 µM respectively in a focus forming unit assay. The antiviral peptides were shown to interfere with virus:cell binding, interact directly with the E proteins and also cause changes to the viral surface using biolayer interferometry and cryo-electron microscopy, respectively. These peptides may be useful for characterization of intermediate states in the membrane fusion process, investigation of DENV receptor molecules, and as lead compounds for drug discovery