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Information Preserving Component Analysis: Data Projections for Flow Cytometry Analysis
Flow cytometry is often used to characterize the malignant cells in leukemia
and lymphoma patients, traced to the level of the individual cell. Typically,
flow cytometric data analysis is performed through a series of 2-dimensional
projections onto the axes of the data set. Through the years, clinicians have
determined combinations of different fluorescent markers which generate
relatively known expression patterns for specific subtypes of leukemia and
lymphoma -- cancers of the hematopoietic system. By only viewing a series of
2-dimensional projections, the high-dimensional nature of the data is rarely
exploited. In this paper we present a means of determining a low-dimensional
projection which maintains the high-dimensional relationships (i.e.
information) between differing oncological data sets. By using machine learning
techniques, we allow clinicians to visualize data in a low dimension defined by
a linear combination of all of the available markers, rather than just 2 at a
time. This provides an aid in diagnosing similar forms of cancer, as well as a
means for variable selection in exploratory flow cytometric research. We refer
to our method as Information Preserving Component Analysis (IPCA).Comment: 26 page
Discriminating lymphomas and reactive lymphadenopathy in lymph node biopsies by gene expression profiling
<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Diagnostic accuracy of lymphoma, a heterogeneous cancer, is essential for patient management. Several ancillary tests including immunophenotyping, and sometimes cytogenetics and PCR are required to aid histological diagnosis. In this proof of principle study, gene expression microarray was evaluated as a single platform test in the differential diagnosis of common lymphoma subtypes and reactive lymphadenopathy (RL) in lymph node biopsies.</p> <p>Methods</p> <p>116 lymph node biopsies diagnosed as RL, classical Hodgkin lymphoma (cHL), diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) or follicular lymphoma (FL) were assayed by mRNA microarray. Three supervised classification strategies (global multi-class, local binary-class and global binary-class classifications) using diagonal linear discriminant analysis was performed on training sets of array data and the classification error rates calculated by leave one out cross-validation. The independent error rate was then evaluated by testing the identified gene classifiers on an independent (test) set of array data.</p> <p>Results</p> <p>The binary classifications provided prediction accuracies, between a subtype of interest and the remaining samples, of 88.5%, 82.8%, 82.8% and 80.0% for FL, cHL, DLBCL, and RL respectively. Identified gene classifiers include LIM domain only-2 (<it>LMO2</it>), Chemokine (C-C motif) ligand 22 (<it>CCL22</it>) and Cyclin-dependent kinase inhibitor-3 (<it>CDK3</it>) specifically for FL, cHL and DLBCL subtypes respectively.</p> <p>Conclusions</p> <p>This study highlights the ability of gene expression profiling to distinguish lymphoma from reactive conditions and classify the major subtypes of lymphoma in a diagnostic setting. A cost-effective single platform "mini-chip" assay could, in principle, be developed to aid the quick diagnosis of lymph node biopsies with the potential to incorporate other pathological entities into such an assay.</p
Contribution to the evaluation of clinical prognostic factors in canine lymphoma
Non-Hodgkin Lymphoma (NHL) is the most common hematopoietic cancer in dogs, from
which up to 50% of the cases are diffuse large B-cell lymphomas (DLBCL). The etiology,
like in humans, is believed to be multifactorial. To the date, the best response rate and best
survival times are offered by a combination therapy including cyclophosphamide,
vincristine, doxorubicin and prednisolone, known by the acronym of CHOP.
Infectious agents, namely vector-borne agents (VBA), can induce chronic B cell stimulation
and immune deregulation permitting lymphomagenesis. Also, there are several reports in
literature associating NHL with VBA, namely from the genus Borrelia and Leishmania
mimicking or co-existing with hematopoietic malignancies either in humans or dogs.
Vector-borne agents can induce haematological and clinical changes in hosts that, when
existing in cancer patients, can either mislead the interpretation of clinical signs or
interfere with recognized prognostic markers, namely blood cell populations.
Prognosis, after quality of life, is determinant in veterinary oncology to further proceed
with a treatment. Short survival times and therapy response rates determine the option
for a non standard-of-care treatment or, lately, animal euthanasia without treatment.
Consequently, easy to perform, “bench-to-bedside” widely available and cost-effective
prognostic markers are fundamental to obtain client financial compliance and support
treatment planning and disease outcome.
Obtaining serological results on vector-borne agents or haematological information trough
a total blood cell count and biochemical parameters are widely available and cost effective
either by an “in-house” laboratory or trough commercial laboratories.
Having in mind the existing published literature on human medicine regarding
haematological parameters as prognostic indicators in lymphoma and the scarse
information on the veterinary field, we aimed to: 1) investigate the prevalence of infection
by four vector-borne agents (Leishmania infantum, Ehrlichia canis, Anaplasma
phagocytophilum and Bartonella henselae), its potential role in lymphomagenesis and its
possible association with the tumour subtype and with the haematological alterations
present in dogs with lymphoma and, 2) determine the prognostic value of dogs’ sex,
neutered status, clinical stage, presence of anaemia, presence of neutrophilia, presence of
thrombocytopenia and the ratios lymphocyte-to-monocyte (LMR), neutrophil-tolymphocyte
(NLR), platelet-to-lymphocyte (PLR) and platelet-to-neutrophil (PNR) in
canine DLBCL that were naïve for treatment, fully staged and received chemotherapy with
a 19 week-CHOP protocol. All dogs tested negative for B. henselae, A. phagocytophilum and E. canis by both serology
and molecular detection. Regarding L. infantum, 8,2% of the dogs had a positive serologic
result. Leishmania infantum DNA was detected in two samples of diffuse large B-cell
lymphoma (DLBCL). These results show an increased, but not significant, seropositivity
(8,2%, p=0,201) and molecular detection (3,3%, p=0,166), for L. infantum in dogs with
lymphoma, when compared to matched historic controls in the same geographical area.
In the second study, PNR showed to be an independent prognostic marker (p≤0,001) for
TTPR at 180 and 365 days. Dogs with a PNR above 0,032 were more likely to progress
before 180 days (sensitivity 46,5%, specificity 87,5%, p=0,004). On univariate analysis,
NLR showed a prognostic significance for LSSR at 180 (p=0,006) and 365 days (p=0,009).
A baseline NLR value below 7,45 was positively associated with survival at 180 days
(sensitivity of 52%, specificity of 85.3%, p=0.025). The presence of substage b, was
associated with early lymphoma progression and decreased survival at 180 days (p
=0.031). Anaemia significantly reduced LSSR at 365 days (p=0,028).
Although it was not possible to identify, in the first study, any significant association
between canine lymphoma and the studied VBA, it was of extreme importance for the
discussion of the second study on the possible effects on peripheral blood cell dynamics
caused by the CBVD studied. Further studies, following dogs trough their CVBD disease
evolution, are worthwhile and may help clarify a possible role of these agents in
lymphomagenesis.
This is the first study evaluating PLR and PNR in canine DLBCL and demonstrates that
PNR could be a predictor of early lymphoma progression. Since peripheral blood cell
composition can be affected by several non-oncological causes, the development of larger
multicenter studies with homogeneous inclusion criteria could help to better determine
the true predictive values of blood cell ratios in dogs suffering from DLBCL treated with
CHOP chemotherapy.O linfoma é o tumor hematopoiético mais frequente no cão com uma incidência estimada
entre 13 a 114 casos por 100.000 cães em risco. A poliquimioterapia, através da utilização
de um protocolo composto pelos fármacos Ciclofosfamida, Hydroxidaurorrubicina
(Doxorrubicina), Oncovin® (Vincristina) e Prednisolona, designado pelo acrónimo de
“CHOP”, permite obter uma taxa de remissão e tempo médio de sobrevida global de cerca
de 94% e 12 meses, respectivamente.
O linfoma difuso de células B grandes (LDCBG) pode constituir até cerca de 50% dos casos
totais de linfoma non-hodgkin (LNH) na espécie canina e é reconhecido como o modelo
natural para o mesmo tipo de neoplasia no Homem.
A aplicação do esquema de classificação da Organização Mundial da Saúde nas entidades
de linfoma canino (LC) é recente na medicina veterinária. A maioria dos estudos clínicos
realizados no LC para avaliação da resposta à terapêutica, assim como a determinação de
factores de prognóstico realizados nas últimas três décadas, sofrem de limitações
significativas. Os resultados desses estudos, foram obtidos através da inclusão de diversos
subtipos e graus histológicos de linfoma, assim como, da utilização de metodologias de
diagnóstico, estadiamento e terapêutica variáveis. Estas limitações comprometem, ainda
hoje, a avaliação da eficácia do tratamento e colocam em questão a fiabilidade de diversos
factores de prognóstico descritos para o LC.
Na medicina humana e veterinária existem estudos que demonstram que a localização
geográfica, a demografia, os fatores sócio-económicos dos doentes e as diferenças na
distribuição de subtipos de linfoma podem interferir na resposta à terapêutica e na
determinação do prognóstico.
Em Portugal, existe um número muito reduzido de estudos sobre o LNH no cão. Que seja
do conhecimento do autor, não existem trabalhos avaliando os aspectos clínicos,
nomeadamente, no que diz respeito à resposta à terapia ou prognóstico.
A infecção por agentes infecciosos transmitidos por vectores (AITV), nomeadamente dos
géneros Ehrlichia e Leishmania, aparece pontualmente na literatura associada a tumores
hematopoiéticos nos cães. Estes agentes infecciosos promovem uma resposta inflamatória
crónica do hospedeiro, que causa uma importante desregulação imunológica, contribuindo
para o processo de carcinogénese, nomeadamente, para a linfomagénese ou progressão
tumoral.
As manifestações clínicas das infecções AITV nos cães estão associadas a um amplo
espectro de anomalias clínicas e laboratoriais. A presença de adenomegalia, hepato-esplenomegalia, síndromes imunomediados (uveíte, glomerulonefrite, poliartrite, etc.),
anemia, alterações no número e tipo de leucócitos circulantes ou trombocitopénia estão
entre as mais frequentes.
Num cão que sofra de linfoma e que esteja, também, infectado por um ou mais destes
agentes infecciosos, a interpretação adequada dos sinais clínicos e das alterações dos
valores laboratoriais torna-se complexa, impedindo uma correcta diferenciação do que é
devido à infecção, ao linfoma ou a ambos. Qualquer inferência de uma possível ausência de
resposta à terapêutica oncológica instituída, assim como a determinação da presença de
indicadores prognósticos específicos do linfoma torna-se difícil ou, mesmo, impossível.
Tal como em medicina humana, na medicina veterinária a obtenção de informação
diagnóstica e/ou prognóstica num conceito “bench-to-bedside” é de extrema importância.
A confirmação serológica ou molecular de infecção por AITV é, actualmente, rápida e está
amplamente disponível. A presença de laboratórios comerciais de patologia clínica
veterinária ou a disponibilização nos hospitais e clínicas veterinárias de equipamentos de
hematologia com tecnologia avançada permitem, ainda, obter rapidamente um
hemograma com alto nível de fiabilidade nas contagens diferenciais das populações
celulares.
Na oncologia clínica humana e, posteriormente, na veterinária os valores obtidos no
momento do diagnóstico, através da contagem diferencial de alguns componentes
celulares do sangue periférico (neutrófilos, linfócitos, monócitos, e plaquetas), bem como
os rácios neutrófilos-linfócitos (NLR), linfócitos-monócitos (LMR), demonstraram ter valor
prognóstico ao reflectir as interfaces inflamatórias intra-neoplásica e doente-tumor no
LDCBG.
Tendo em consideração a literatura publicada em medicina humana sobre o valor
prognóstico da composição celular e dos rácios NLR e LMR, obtidos a partir do sangue
periférico no momento do diagnóstico do LDCBG, e a escassa ou contraditória informação
nesse domínio na área veterinária, foram objetivos do presente trabalho: 1) investigar a
prevalência de infecção por quatro agentes transmitidos por vectores (Leishmania
infantum, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum e Bartonella henselae), o seu
potencial papel na linfomagénese e a sua eventual associação com o subtipo do tumor e
com as alterações hematológicas presentes em cães diagnosticados com linfoma e 2)
determinar o valor prognóstico dos parâmetros sexo, estado fértil, estádio clínico do
linfoma, presença de anemia, presença de neutrofilia, presença de trombocitopénia, NLR,
LMR e dois rácios adicionais, nunca descritos- plaquetas-linfócitos e plaquetas-neutrófilosem
cães com LDCBG em estádio III/IV tratados com um protocolo CHOP de 19 semanas. Relativamente ao primeiro estudo, foi avaliada pela primeira vez (em Portugal e na
Europa) a associação entre a infecção por quatro agentes transmitidos por vectores
(Leishmania infantum, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum e Bartonella henselae)
em cães com linfoma.
A presença de anticorpos (IgG) assim como a detecção molecular de Bartonella henselae,
Ehrlichia canis e Anaplasma phagocytophilum foram negativas em todas as amostras de
cães com linfoma estudadas. Para Leishmania infantum a taxa de seropositividade e de
detecção molecular foi de, respectivamente, 8,2% e 3,3%. Estes valores não se mostraram
significativamente diferentes quando comparados com os controlos históricos de cães com
o mesmo estilo de vida e da mesma região geográfica: 7,9% (p = 0,201) e 1,2%, (p = 0,166),
respectivamente. Dos 8,2% de cães seropositivos para Leishmania infantum, 60% tinham
diagnóstico de LDCBG. Os 40% restantes desenvolveram formas de linfoma indolentes
(Manto e de Pequenas células).
Relativamente às alterações hematológicas nos cães seropositivos para Leishmania
infantum (n=5), apenas um cão, portador de linfoma de pequenas células B, não
apresentou qualquer alteração hematológica. A presença de anemia leve foi observada em
dois cães, um deles com trombocitopénia concomitante. Verificou-se, ainda, a presença de
monocitopénia e linfopénia moderadas em dois cães diferentes. Todas as alterações do
sangue periférico observadas nestes cães foram leves e não associadas ao tipo de linfoma,
título serológico ou positividade molecular para Leishmania infantum.
No presente estudo não foi possível diferenciar se essas alterações hematológicas estão
relacionadas com o linfoma e/ou com a infecção por Leishmania infantum. Provavelmente,
as alterações dos hemogramas dos cães com linfoma e com leishmaniose devem-se à ação
de ambas as doenças e resposta inflamatória associada, quer na produção, quer na cinética
dos elementos celulares sanguíneos, ao nível da medula óssea e do sangue periférico.
Os cães com leishmaniose, quando comparados com a população geral do estudo,
apresentaram um Tempo para a Progressão (TPP) e uma Sobrevivência Específica para o
Linfoma (SEL) mais curtos, 90 vs. 120 e 184 vs. 206 dias, respectivamente. Devido ao
número muito pequeno de cães positivos, não foi possível obter qualquer conclusão
significativa sobre a associação dos tipos específicos de linfoma e o impacto nas anomalias
das células do sangue periférico, assim como a sua possível implicação na linfomagénese.
Relativamente ao segundo objectivo, foram avaliados o valor prognóstico dos parâmetros
sexo, estado fértil, estádio clínico, presença de anemia, presença de neutrofilia, presença
de trombocitopénia, NLR, LMR e os rácios plaquetas-linfócitos (PLR) e plaquetasneutrófilos
(PNL) relativamente ao TPP e SEL. Foram, ainda, calculados para dois marcos
temporais específicos (6 e 12 meses) a Taxa do Tempo de Progressão (TTPP) e Taxa de Sobrevivência Especifica do Linfoma (TSEL). Estes segundos cálculos permitem uma
compreensão mais clara da evolução do TPP e do SEL.
O PNR revelou-se um marcador prognóstico independente (p ≤ 0,001) para a TTPP aos
180 e 365 dias. Os cães com PNR acima de 0,032 apresentaram maior probabilidade de
progressão do linfoma antes de 180 dias (sensibilidade 46,5%, especificidade 87,5%, p =
0,004). O NLR mostrou uma significância prognóstica para a TSEL aos 180 (p = 0,006) e
365 dias (p = 0,009). Um valor de NLR ao diagnóstico abaixo de 7,45 mostrou estar
associado positivamente a uma maior probabilidade de sobrevida aos 180 dias
(sensibilidade de 52%, especificidade de 85,3%, p = 0,025).
Relativamente à análise de outros factores de prognóstico anteriormente validados, no
presente estudo a presença do sub-estádio b, demonstrou contribuir para a progressão
precoce do linfoma e diminuição da sobrevida aos 180 dias (p = 0,031). Nos cães com
anemia, designadamente com concentrações de hemoglobina inferiores a 11 g/dL, a TSEL
aos 365 dias foi significativamente inferior aos cães com valores de concentração de
hemoglobina normais (p = 0,028).
No presente estudo, os cães com linfoma na região metropolitana de Lisboa apresentaram,
para os agentes infecciosos estudados, a mesma seroprevalência e taxa de detecção
molecular que os controlos históricos da mesma zona geográfica e com o mesmo estilo de
vida. Este primeiro estudo foi de extrema importância para permitir compreender a
magnitude da infecção pelos quatro AITV estudados nos cães com linfoma e o eventual
impacto no subtipo morfológico, alterações hematológicas e possível contribuição para a
linfomagénese.
Os presentes resultados não revalidaram factores de prognóstico anteriormente descritos
para o linfoma multicêntrico no cão, como o género, o estado fértil e, no caso particular do
LDCBG, o LMR, a neutrofilia e trombocitopénia ao diagnóstico. O rácio neutrófilo-linfócito
demostrou valor prognóstico na sobrevida total, como anteriormente descrito.
Este é o primeiro estudo a realizar a avaliação dos factores PLR e PNR em cães com LDCBG
e a demonstrar que o PNR ao diagnóstico, tem um valor predictivo da progressão precoce
do linfoma.
Uma vez que a composição celular do sangue periférico pode ser afetada por várias causas
não oncológicas, inflamatórias ou infecciosas, será importante continuar o
desenvolvimento de estudos prospectivos multicêntricos com critérios de inclusão
homogéneos e com um número significativo de doentes, de forma a determinar a
verdadeira associação entre os AITV e a dinâmica da composição celular periférica, nos
cães com LDCBG tratados com CHOP. O presente estudo adiciona dados inovadores e importantes para melhor compreender a
epidemiologia do linfoma canino e, particularmente, o espectro prognóstico do LDCBG.
Os indicadores de prognóstico aqui descritos estão amplamente acessíveis, são de rápida
obtenção e baixo custo, permitindo uma abordagem “bench-to-bedside” na estratificação
de risco dos pacientes e, consequentemente, o desenvolvimento de abordagens
terapêuticas personalizadas.
Uma janela para a suposta contribuição de Leishmania infantum para a linfomagénese
permanece aberta e constitui um ávido assunto de pesquisa que merece ser continuado
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