Modulation of glutamat AMPA receptors by adenosine, in physiological and hypoxic/ischemic conditions

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011Most of the fast excitatory transmission in the brain is conveyed by ionotropic glutamate a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, formed by tetrameric assemblies of different subunit (GluR1-GluR4) composition. Modulation of AMPA receptors enables profound changes in synaptic efficiency, underlying the maturation of neuronal networks throughout development and plasticity, but also glutamate-mediated excitotoxicity. Accurate tuning of AMPA function can be attained by subunit phosphorylation, affecting channel properties and receptor trafficking rates. Accordingly, activation of noradrenergic and dopaminergic metabotropic receptors positively modulates AMPA receptor function through increased PKA activity and GluR1 phosphorylation, an effect restricted to brain areas targeted by pathways relying on these neurotransmitters. In contrast, adenosine is ubiquitously present throughout the nervous system, being released by glia and neurons or derived from the extracellular catabolism of adenine nucleotides. The present work thus aimed at evaluating the modulation of postsynaptic AMPA receptors by high-affinity, G-coupled A1 and A2A adenosine receptors and its implications for long term potentiation (LTP), widely perceived as the cellular correlate for memory formation (chapter 5.1). The involvement of A2A (chapter 5.2) and A1 (chapter 5.3) receptormediated tuning of glutamatergic transmission was further addressed in excitotoxicity conditions. Exogenous activation of A2A receptors by 2- [4-(2-p-carboxyethyl)phenylamino]-50-N-ethylcarboxamidoadenosine (CGS21680) was found to significantly facilitate AMPA-evoked currents in CA1 pyramidal neurons, by a postsynaptic PKA-dependent mechanism leading to increased GluR1 membrane expression. The functional impact of this modulation was evidenced by LTP facilitation at the CA3-CA1 synapse, following brief CGS21680 application. Moreover, endogenous A2A receptor activation was required for ischemia-induced facilitation of glutamatergic transmission, revealing a conserved regulatory mechanism between both forms of plasticity, which may be of interest for functional recovery (through circuit rewiring) from stroke. Additionally, results suggests that some (OSM), but not all (LIF) immunoregulatory cytokines of the IL-6 family can exert neuroprotection from hypoxia through upregulation of A1 receptors, to tone down synaptic transmission and consequently, energy expenditure.Os receptores ionotrópicos para o glutamato do tipo AMPA são responsáveis por mediar grande parte da transmissão excitatória rápida que tem lugar no sistema nervoso central. Estes receptores são constituídos por tetrâmeros, contendo diferentes combinações de subunidades (GluR1-GluR4) e a sua regulação é responsável por consideráveis alterações na eficiência da transmissão sináptica, inerentes à maturação de redes neuronais ao longo do desenvolvimento bem como a fenómenos de plasticidade. Contudo, os receptores AMPA são também moléculas-chave em situações de excitotoxicidade mediada por glutamato. Tanto a alteração da composição do tetrâmero, como variações no estado de fosforilação das suas subunidades, constituem mecanismos que permitem uma regulação eficaz da função destes receptores. De facto, há evidência de que à activação de receptores metabotrópicos para a dopamina ou noradrenalina se associa um aumento de função AMPA, através de um aumento na actividade da PKA e consequente exarcebamento do estado de fosforilação de subunidades GluR1. No entanto, este tipo de regulação da função AMPA encontra-se necessariamente restrito às áreas cerebrais que recebem inervação dopaminérgica ou noradrenérgica. O mesmo não acontece com a modulação pela adenosina, cuja presença é ubíqua no sistema nervoso, uma vez que pode ser libertada por células da glia e neurónios, através de locus pré-, pós- e não- sinápticos. Além disso, o catabolismo de nucleótidos de adenina, co-libertados com diferentes neurotransmissores, representa uma fonte de adenosina extracelular adicional. O trabalho experimental de que trata a presente tese teve assim como objectivo investigar uma possível modulação da componente AMPA pós-sináptica, através da activação dos receptores de alta afinidade para a adenosina, do tipo A1 e A2A. Foram ainda abordadas as implicações deste mecanismo de regulação para o estabelecimento de potenciação a longo prazo (LTP) da eficiência sináptica, a qual é encarada como o substrato celular para a formação de novas memórias (capítulo 5.1). A ocorrência de uma possível modulação da transmissão glutamatérgica pelos receptores A2A (capítulo 5.2) e A1 (capítulo 5.3) em situações de excitotoxicidade foi estudada através da aplicação de modelos de isquémia e hipóxia. A grande maioria do trabalho experimental foi realizado em células piramidais da área CA1 do hipocampo, que representa uma população neuronal particularmente propensa a expressar alterações de eficiência sináptica de acordo com os níveis de actividade, mas que é também especialmente susceptível a morte por excitotoxicidade, após isquémia. As observações mais relevantes descritas na presente tese dizem respeito à facilitação significativa de correntes evocadas por ejecção de AMPA (correntes AMPA), observada após activação dos receptores A2A com um agonista selectivo (CGS 21680). Esta facilitação teve expressão por meio de um mecanismo dependente de PKA, mas não de síntese proteica, tendo sido reproduzida pela perfusão de um activador da adenilato ciclase (forskolina). Além disso, as acções do agonista A2A não foram afectadas aquando do bloqueio simultâneo dos receptores GABAA, NMDA e canais de sódio dependentes da voltagem, pelo que nenhum dos últimos parece desempenhar um papel na mesma. É ainda possível concluir que o efeito do agonista A2A terá um locus de expressão pós-sináptico, na medida em que se manteve, mesmo em condições de bloqueio do disparo de potenciais de acção. Efectivamente, observou-se que a perfusão de CGS 21680 conduziu a um aumento na amplitude de correntes pós-sinápticas excitatórias espontâneas, o que sugere um acréscimo na capacidade de resposta (pós-sináptica) ao glutamato libertado. É sabido que a fosforilação pela PKA de subunidades GluR1 aumenta a probabilidade de abertura de receptores AMPA, além do que leva a um aumento do seu tráfego (em receptores que contenham subunidades GluR1) para porções extrasinápticas da membrana. Desta forma, quando se avaliou a expressão destas subunidades ao nível da membrana, verificou-se que tanto a expressão total, como a de subunidades fosforiladas se encontrava aumentada após tratamento com o agonista A2A. A relevância deste acréscimo na expressão membranar de receptores AMPA traduziu-se numa facilitação da LTP entre neurónios das zonas CA3 e CA1, após um curto tratamento com CGS 21680. Além disso, a modulação endógena da componente AMPA pós-sináptica revelou-se necessária à expressão de LTP, já que a última se encontrou francamente diminuída em situações de bloqueio dos receptores A2A. Face aos resultados obtidos na primeira parte deste trabalho, é pois possível inferir que, em condições de aumento súbito da adenosina extracelular proporcionadas por um exarcebamento da actividade neuronal, a activação de receptores A2A, facilita a fosforilação pela PKA de subunidades GluR1 – aumentando a disponibilidade de receptores nas reservas membranares a partir das quais estes são recrutados para a sinapse, permitindo reforçar a transmissão sináptica. A exposição a períodos transitórios de hipóxia ou isquémia é suficiente para induzir um aumento mantido na eficiência sináptica que partilha muitos dos mecanismos inerentes à expressão de LTP, incluindo um ganho de função pela componente AMPA pós-sináptica. Com o objectivo de investigar a contribuição por uma possível modulação pelos receptores A2A da transmissão glutamatérgica para esta forma de plasticidade, compararam-se os efeitos de breves insultos isquémicos, na presença e na ausência (controlo) de um antagonista selectivo dos receptores A2A da adenosina (SCH 58261). A sujeição ao episódio isquémico transitório começou por anular a transmissão sináptica, a qual recuperou após reoxigenação, progressivamente, até valores acima dos valores iniciais de referência. Estas observações validam portanto o recurso a este tipo de insulto isquémico transitório para o estudo de formas de plasticidade induzidas por isquémia. Para além disso, observou-se que esta facilitação da transmissão glutamatérgica era completamente perdida, aquando da inclusão de espermina na solução intracelular (com acesso ao compartimento citosólico), o que sugere que requererá a activação de receptores AMPA permeáveis ao cálcio (bloqueados por espermina intracelular). Estes resultados revelam assim mais um mecanismo comum à chamada “LTP induzida por isquémia” e à sua correspondente fisiológica (LTP), a qual depende também da inserção sináptica, transitória, de receptores AMPA permeáveis ao cálcio. Quando o insulto isquémico foi realizado na presença de um antagonista A2A, tão pouco se observou uma facilitação da transmissão glutamatérgica após isquémia. Estes dados são consistentes com um envolvimento endógeno dos receptores A2A nesta forma de plasticidade, à semelhança da contribuição que têm para a expressão de LTP. A recuperação da transmissão sináptica em condições de bloqueio dos receptores A2A manteve-se inalterada na presença de espermina intracelular, sugerindo o recrutamento de um mecanismo comum, em ambos os casos (bloqueio dos receptores AMPA permeáveis ao cálcio e bloqueio dos receptores A2A). Para uma melhor compreensão dos mecanismos inerentes a este tipo de plasticidade, será necessária uma avaliação do intervalo de tempo pelo qual os receptores AMPA permeáveis ao cálcio permanecem na sinapse, bem como testar directamente a hipótese de que os receptores A2A modulem a inserção de receptores AMPA permeáveis ao cálcio. Ainda assim, esta segunda parte do presente trabalho tem o mérito de revelar um (novo) mecanismo comum a duas formas de plasticidade consideradas completamente distintas até recentemente, colocando em evidência um envolvimento relevante dos receptores A2A nas alterações da eficiência sináptica desencadeadas por isquémia. É desde há muito reconhecido o potencial neuroprotector que a activação de receptores A1 da adenosina oferece contra insultos de hipóxia e/ou isquémia, ainda que a aplicação terapêutica de agonistas A1 se encontre muito dificultada pela ocorrência de graves efeitos secundários. É plausível que a administração de moléculas capazes de modular a função destes receptores possa oferecer uma alternativa viável ao uso de agonistas A1. De facto, esta aplicação foi recentemente sugerida para a interleucina 6 (IL-6), capaz de proteger neurónios de dano por excitotoxicidade, através de um aumento nos níveis de receptores A1 e um consequente aumento da sua sensibilidade ao tónus adenosinérgico. Com o objectivo de avaliar se esta acção seria extensível a outros membros da mesma família de interleucinas, analisaram-se os efeitos do tratamento com oncostatina (OSM) e factor inibidor de leucemia (LIF) sobre a modulação da transmissão glutamatérgica dependente de receptores A1. Após tratamento com OSM, mas não com LIF, observou-se uma potenciação da inbição das respostas sinápticas glutamatérgicas induzida por perfusão de um agonista selectivo de receptores A1 (CPA), o que é consistente com um ganho de função destes receptores. A relevância desta interacção para uma situação de modulação da transmissão sináptica aquando de um insulto excitotóxico, reflectiu-se numa maior inibição da transmissão glutamatérgica, dependente da activação de receptores A1, após sujeição a um episódio hipóxico transitório. Estes dados funcionais corroboram os resultados de colaboradores, que mostram que apenas o tratamento com OSM consegue aumentar os níveis de proteína e mRNA correspondentes ao receptor A1. No seu conjunto, os resultados sugerem que o acréscimo de função dos receptores A1 da adenosina é necessário à neuroprotecção exercida pelas citocinas IL-6 e OSM, mas não para a protecção mediada por LIF. No entanto, a pleiotropia de efeitos conhecida para esta família de interleucinas, bem como o tipo de protocolo usado para testar o seu envolvimento na neuroprotecção contra hipóxia (pré-tratamento), tornam prematura qualquer sugestão do seu uso como potenciais agentes terapêuticos. Do presente trabalho emerge desta forma a noção da modulação de receptores A1 como mecanismo redundante capaz de conferir propriedades de neuroprotecção a citocinas imunorreguladoras. Por outro lado e através da activação de receptors A2A, com consequente ganho de função AMPA, este trabalho mostrou como a adenosina é capaz de modular a plasticidade sináptica, o que se poderá revelar de particular interesse no estabelecimento de novos contactos sinápticos que ocorre em resposta a insultos isquémicos.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/27761/2006

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