Die Demethylierung von Dimethylselenid ist eine adaptive Antwort des Archaeons Methanococcus voltae

Im natürlichen Lebensraum von Methanococcus voltae kommt Selen in unterschiedlichen Verbindungen und Konzentration vor. So variiert der Selengehalt im Mündungswasser verschiedener Flüsse zwischen 0,1 und 63 nM. Aufgrund der guten Löslichkeit sind die Oxianionen des Selens biologisch am interessantesten. Sie sind daher aber auch in hohen Konzentrationen toxisch. Selen in geringen Mengen ist dagegen essentiell, da es als Selenomethionin oder -cystein in Proteinen vorkommen kann. Eine häufig anzutreffende organische Selenverbindungen ist das Dimethylselenid (DMSe). Diese flüchtige Substanz wird von einer Vielzahl Organismen zur Detoxifizierung gebildet. Aus M. voltae sind insgesamt 4 Hydrogenasen bekannt, wovon zwei ein Selenocystein aufweisen und konstitutiv exprimiert werden. Die Induktion der Transkription der selenfreien Isoenzyme erfolgt dagegen bei Selenmangel. In Expressionsanalysen zeigte sich, dass 5 weitere Proteine ebenfalls nur unter Selenlimitierung synthetisiert werden. Von zweien wurde jeweils die N-terminale Peptidsequenz und von einem zusätzlich interne Peptidsequenzen bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst das Gen eines dieser Proteine identifiziert. In einer Datenbanksuche stellte sich dann heraus, dass es Sequenzidentitäten mit Corrinoid-Proteinen aus Methanosarcina aufwies. Es wurde als SdmA bezeichnet (für Dimethylselenid Demethylierung). Das Gen sdmA liegt zusammen mit sdmB und sdmC auf einem gemeinsamen polycistronischen Messenger, der nur bei Selenmangel nachweisbar war. SdmB und SdmC haben gemeinsame Sequenzmotive mit Methyltransferasen, die in einigen Methanoarchaeen an der methylotrophen Methanogenese beteiligt sind. Dabei übertragen diese die Methylgruppe von Corrinoid-Proteinen auf den Akzeptor Coenzym M. Die Methylgruppe stammt dabei beispielsweise aus methylierten Aminen bzw. Thiolen oder aus Methanol. Normalerweise werden von M. voltae für die Methanogenese nur Formiat oder H2/CO2 erschlossen, so bestätigte sich die Vermutung nicht, dass bei Selenmangel SdmA, SdmB und SdmC die Erschließung der oben genannten methylierten Substrate erlauben könnten. Versetzt man das Selenmangelmedium jedoch mit DMSe, dann führt dies zur Repression des Promotors der Gene einer selenfreien Hydrogenase, der normalerweise nur unter Selenlimitierung aktiv wäre. Eine Deletion von sdmA oder sdmC führte zur Aktivität des Promotors trotz der Anwesenheit von DMSe. Der Austausch von sdmB hatte dagegen keinen Effekt. Zudem waren die Wachstumsraten der Mutanten delta sdmA und delta sdmB im Vergleich zum Wildtyp trotz DMSe-Zugabe reduziert. In M. voltae scheint es daher zwei verschiedene Anpassungsmechanismen an Selenmangel zu geben. Zum einen werden unter Selenlimitierung die selenfreien Isoenzyme der selenhaltigen Hydrogenasen exprimiert und zum anderen lässt sich unter diesen Bedingungen ein alternatives Selensubstrat, wie das DMSe, von M. voltae zur Biosynthese der Selenoproteine erschließen. Daran ist vermutlich das Corrinoid-Proteine SdmA und die Methyltransferase SdmC beteiligt

Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen stressinduzierter Proteine im Apoplasten der Gerste

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Die Funktion des Transkriptionsfaktors AP-1 in der Apoptoseregulation

Für einen adulten höheren Organismus ist es wichtig unnötige oder durch angehäufte Mutationen entartete Zellen entfernen zukönnen. Dies geschieht über den Vorgang des programmierten Zelltodes, Apoptose, bei dessen Regulation Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle spielen. Einer dieser Transkriptionsfaktoren ist AP-1, der in Antwort auf Wachstumsfaktoren, Zytokine, Hormone, alkylierende Agenzien und andere Stressfaktoren Genexpression reguliert. AP-1 beschreibt ein Sammlung von Dimeren, die sich aus Proteinen der Jun-, Fos-, und ATF-Familie zusammensetzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass einige AP-1 Mitglieder abhängig von den Stimuli und dem Zelltyp eine wichtige Rolle in der Regulation der Apoptose spielen. Während es über die Rolle von c-Fos in der Apoptose kontroverse Aussagen gibt, ist die Funktion von c-Jun in der Stressantwort durch Apoptose in Fibroblasten bisher gut untersucht. Dort ist c-Jun für die Aktivierung des CD95-Liganden verantwortlich. Über die Rolle des Antagonisten von c-Jun nämlich JunB bei der Apoptose-Regulation war bisher noch nichts bekannt. Im ersten Teil der Arbeit habe ich die Funktion von c-Fos in der T-Zellapoptose untersucht Dafür wurden reife T-Zellen aus dem Thymus und der Milz sowie Thymozyten von c-Fos-defizienten Mäusen isoliert, kultiviert und die Apoptoseantwort nach verschiedenen Stimuli untersucht. Es konnte kein Defekt in der T-Zellentwicklung oder Aktivierung in c-Fos-defizienten T-Zellen und Thymozyten festgestellt werden. Auch die Untersuchung des AICD (activation induced cell death) in isolierten reifen T-Zellen der Milz zeigte, dass der AICD unabhägig von c-Fos reguliert wird. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte ich erstmals, unter Verwendung von JunB defizienten Fibroblasten die Rolle von JunB bei der Apoptoseregulation funktionell aufklären. Dabei nimmt JunB abhängig von dem auslösenden Signalweg sowohl pro- als auch antiapoptotische Funktionen ein. Die Überexpression von CD95 und CD95-Liganden führt, in den hier verwendeten JunB defizienten Fibroblasten, zu einer sehr deutlichen Hypersensitivität gegenüber einer Behandlung mit dem CD95-Liganden. Durch die Reprimierung der Expression von CD95 und CD95-Ligand ist JunB maßgeblich an der Regulation des CD95-Signalweges beteiligt und übt dadurch eine antiapoptotische Funktion aus. Im Gegensatz dazu wirkt bei stressinduzierenden Stimuli JunB proapoptotisch, indem es die Regulation der MKP-1 Expression negativ kontrolliert. Als Folge der erhöhten MKP-1 Menge tritt in den JunB-defizienten Zellen eine reduzierte Aktivierung von JNK auf. JunB wirkt auf alle drei neu identifizierten Zielgene (CD95, CD95-L, MKP1) reprimierend. Ob dies über eine direkte Bindung an die Promotoren oder indirekt über andere Zielgene reguliert wird, ist nicht geklärt. Für eine Aktivierung der Mitochondrien nach Stressinduktion wird die aktivierte Form der JNK benötigt. Die Befunde dieser Arbeit zeigen, dass JunB und c-Jun in der Regulation des CD95-Signalweges in Fibroblasten antagonistisch, und in der stressinduzierten Apoptose protagonistisch

Biosynthese der Luteolin-Glucuronide im Roggenprimärblatt-Mesophyll: Charakterisierung der Glucuronosyltransferasen

Pflanzen sind in der Lage, sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe (z.B. Flavonoide) sowie pflanzenfremde Substanzen (z.B. Xenobiotika) zu "entgiften". Dies geschieht über eine Reaktionsabfolge, in der die toxische Substanz aktiviert (Phase I), dann z.B. durch die Konjugation mit einem Zucker (Phase II) in eine hydrophilere Verbindung überführt und schließlich - um das Cytosol vor toxischen Effekten zu schützen - in der Vakuole gespeichert wird (Phase III). Die bisher beschriebenen pflanzlichen Sekundärstoff-Zuckertransferasen verwenden zumeist UDP-Glucose als Cosubstrat. Im Gegensatz hierzu sind an Vertebraten-Entgiftungsprozessen vorwiegend UDP-Glucuronosyltransferasen (UGTs) beteiligt. In den Vakuolen photosynthetisch aktiver Mesophyllzellen von Roggenprimärblättern akkumulieren Luteolin-Di- bzw. Tri-Glucuronide. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Enzyme, die die sequenzielle Synthese der Luteolin-Glucuronide katalysieren molekularbiologisch und biochemisch charakterisiert werden. Durch die Durchmusterung einer genomischen Roggenphagenbank mit heterologen Zuckertransferase-Sonden konnten zwei neue Zuckertransferase-Gene mit hoher Sequenz-Homologie zu Vertebraten-UGTs isoliert werden (scUGTa-c). Die Transkription dieser Gene im 5 Tage alten Roggenprimärblatt wurde mittels NORTHERN-blot-Analyse bzw. Durchmusterung einer cDNA-Bank nachgewiesen. Die biochemische Charakterisierung der Roggen-Flavonoid-Zuckertransferasen beinhaltete die Etablierung des in vitro Enzymtests für die sequenzielle Glucuronidierung von Luteolin bzw. für die Glucosylierung (3-Flavonol-Glucosyltransferase-Enzymtests) von Cyanidinen und Flavonolen. Die Reaktionsprodukte wurden mittels HPLC analysiert. Das Molekulargewicht von 53 kDa wurde durch eine Immunblotanalyse und eine Protein-G-vermittelte Coimmunpräzipitation bzw. einen Lectinbindungsassay auf dem Proteinchip mit heterologen UGT-Antikörpern bestimmt. Die Lokalisation der Luteolin-Glucuronosyltransferasen im Cytosol wurde durch eine Differenzialzentrifugation ermittelt. Durch die transiente Expression fluoreszierenden Fusionsproteine in Gersteprimärblättern (particle bombardment) konnte die "cytosolische Lokalisation" eingegrenzt werden: die Roggenenzyme befinden sich offensichtlich mit dem ER bzw. dem Tonoplasten assoziiert. Um die Anzahl der für die Biosynthese des Luteolin-Triglucuronids verantwortlichen Enzyme zu ermitteln, wurde eine 2D-Gelelektrophorese durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass nur zwei (nicht wie erwartet drei) Proteine mittels Immunblot detektiert werden konnten. Die bei tierischen Enzymen beschriebene Homodimerisierung der UGTs konnte anhand einer FRET-Analyse durch acceptor-photo-bleaching bei den Roggen-UGTs bestätigt werden. Der Enzymassay mit heterolog exprimierter scUGT (in E.coli bzw. N.tabacum / A.thaliana) führte jedoch weder zu einer Akkumulation von Cyanidin-3-O-Glucosid (3FGT-Reaktion), noch zu einer von Luteolin-Mono- / -Di- bzw. -Tri-Glucuroniden (UGT-Reaktion)