Porcine cytomegalovirus/porcine roseolovirus (PCMV/PRV): A threat for xenotransplantation?

The potential for a donor-derived transmission of porcine cytomegalovirus/porcine roseolovirus (PCMV/PRV) to the recipient has been recognized since pigs were considered candidate donors for xenotransplantation. This review gives a short description of the viral properties and summarizes the current evidence of the effects of PCMV/PRV transmission in preclinical xenotransplantation. Despite evidence that PCMV/PRV does not infect human and non-human primate cells, activation in the transplanted organ and detrimental systemic complications have been described. As PCMV/PRV is a herpesvirus able to establish latency, the importance of adequate screening of donor pigs is emphasized, as no efficient treatment is available. Furthermore, easy and successful ways of elimination of PCMV/PRV from pig herds are indicated

Detection of porcine cytomegalovirus, a roseolovirus, in pig ovaries and follicular fluid: implications for somatic cells nuclear transfer, cloning and xenotransplantation

Background Porcine cytomegalovirus (PCMV) is a porcine roseolovirus (PCMV/PRV) which is widely distributed in pigs. Transmission of PCMV/PRV in preclinical xenotransplantations was shown to significantly reduce the survival time of the pig transplants in non-human primates. PCMV/PRV was also transmitted in the first transplantation of a pig heart into a human patient. To analyze how PCMV/PRV could be introduced into pig breeds, especially considering cloned transgenic pigs, and subsequently spread in breeding facilities, we screened ovaries and derived materials which are used to perform somatic cell nuclear transfer (SCNT). Methods DNA was isolated from ovarian tissues, follicular fluids, oocytes with cumulus cells, denuded oocytes and parthenotes. A real-time PCR with PCMV/PRV-specific primers and a probe was performed to detect PCMV/PRV. Furthermore, a Western blot assay using a recombinant fragment of the gB protein of PCMV/PRV was performed to screen for virus-specific antibodies in the follicular fluids. Results PCMV/PRV was found by real-time PCR in ovarian tissues, in the follicular fluid and in oocytes. In parthenotes the virus could not be detected, most-likely due to the low amount of DNA used. By Western blot assay specific antibodies against PCMV/PRV were found in 19 of 20 analyzed follicular fluids. Conclusion PCMV/PRV was found in ovarian tissues, in the follicular fluids and also in denuded oocytes, indicating that the virus is present in the animals of which the oocytes were taken from. Despite several washing steps of the denuded oocytes, which are subsequently used for microinjection or SCNT, the virus could still be detected. Therefore, the virus could infect oocytes during genetic modifications or stay attached to the surface of the oocytes, potentially infecting SCNT recipient animals

Porcine cytomegalovirus/porcine roseolovirus (PCMV/PRV): A threat for xenotransplantation?

The potential for a donor-derived transmission of porcine cytomegalovirus/porcine roseolovirus (PCMV/PRV) to the recipient has been recognized since pigs were considered candidate donors for xenotransplantation. This review gives a short description of the viral properties and summarizes the current evidence of the effects of PCMV/PRV transmission in preclinical xenotransplantation. Despite evidence that PCMV/PRV does not infect human and non-human primate cells, activation in the transplanted organ and detrimental systemic complications have been described. As PCMV/PRV is a herpesvirus able to establish latency, the importance of adequate screening of donor pigs is emphasized, as no efficient treatment is available. Furthermore, easy and successful ways of elimination of PCMV/PRV from pig herds are indicated

Presence of porcine cytomegalovirus, a porcine roseolovirus, in wild boars in Italy and Germany

Porcine cytomegalovirus (PCMV), a porcine roseolovirus (PRV) that is closely related to human herpesviruses 6 and 7, is commonly found in commercial pigs. PCMV/PRV is important in xenotransplantation, because in preclinical trials in which pig organs were transplanted into non-human primates, transmission of PCMV/PRV was shown to be associated with significantly reduced survival of the xenotransplants. PCMV/PRV was also transmitted in the first transplantation of a pig heart into a human patient worldwide and apparently contributed to the death of the patient. The prevalence of PCMV/PRV in wild boars is largely unknown. In this study, we screened wild boars from several areas of northern Italy and Germany to test for the presence of PCMV/PRV using PCR-based and Western blot assays. By Western blot analysis, 54% and 82% of Italian and German wild boars, respectively, were found to be PCMV/PRV positive, while 36% and 60%, respectively, tested positive by real-time polymerase chain reaction (PCR). These data indicate that the virus is common in German and Italian wild boars and that the Western blot assay detected a PCMV/PRV infection more often than did real-time PCR. The data also indicate that pigs raised for xenotransplantation should be protected from contact with materials from wild boars and commercial pigs

Field-Based Assessment of the Role of Porcine Cytomegalovirus in Respiratory Disease of Nursery Pigs

Porcine cytomegalovirus (PCMV) is an ubiquitous infectious agent in swine population throughout the world. Field and some experimental observations have suggested that PCMV plays an important role in causing or enhancing respiratory and/or reproductive disease of swine. However, no actual measure of this has been documented. As the first step in assessing the economic significance of PCMV infection for swine herds in the United States, a field-based case-control study was conducted to evaluate the potential role of the virus in respiratory disease of young swine. The data in this study, thus far, suggest that there may be an association between PCMV infection and increased risk of respiratory disease development in nursery pig populations and that, as was expected, PCMV infection is a common finding among nursery pigs. In an era in which multifactorial respiratory disease and associated decrease in production efficiency is such a large concern, it may be prudent to consider PCMV when developing and implementing strategies for production management and pig flow

How, where and when to screen for porcine cytomegalovirus (PCMV) in donor pigs for xenotransplantation

Porcine cytomegalovirus (PCMV), that is actually a porcine roseolovirus (PRV), is a common herpesvirus in domestic pigs and wild boars. In xenotransplantation, PCMV/PRV has been shown to significantly reduce the survival time of pig kidneys and hearts in preclinical trials with different non-human primates. Furthermore, PCMV/PRV has been transmitted in the first pig to human heart xenotransplantation and contributed to the death of the patient. Although transmitted to the recipient, there is no evidence that PCMV/PRV can infect primate cells including human cells. PCMV/PRV is closely related to the human herpesviruses 6 and 7, and only distantly related to the human CMV (HCMV). Antiviral drugs used for the treatment of HCMV are less effective against PCMV/PRV. However, there are well described strategies to eliminate the virus from pig facilities. In order to detect the virus and to eliminate it, highly sensitive detection methods and the knowledge of how, where and when to screen the donor pigs is required. Here, a comparative testing of organs from pigs of different ages using polymerase chain reaction (PCR)-based and immunological methods was performed. Testing young piglets, PCMV/PRV was detected effectively by PCR in blood, bronchoalveolar lavage fluid, tonsils and heart. In adult animals, detection by PCR was not successful in most cases, because the virus load was below the detection limit or the virus was in its latent stage. Therefore, detection of antibodies against selected recombinant proteins corresponding to epitopes detected by nearly all infected animals in a Western blot assay is advantageous. By contrast, immunological testing is not beneficial in young animals as piglets might have PCMV/PRV-specific antibodies obtained from their infected mother via the colostrum. Using a thoughtful combination of PCR-based and immunological methods, detection of PCMV/PRV in donor pigs for xenotransplantation is feasible and a controlled elimination of the virus by early weaning or other methods is possible

Identification and characterization of FAM124B as a novel component of a CHD7 and CHD8 containing complex

BACKGROUND: Mutations in the chromodomain helicase DNA binding protein 7 gene (CHD7) lead to CHARGE syndrome, an autosomal dominant multiple malformation disorder. Proteins involved in chromatin remodeling typically act in multiprotein complexes. We previously demonstrated that a part of human CHD7 interacts with a part of human CHD8, another chromodomain helicase DNA binding protein presumably being involved in the pathogenesis of neurodevelopmental (NDD) and autism spectrum disorders (ASD). Because identification of novel CHD7 and CHD8 interacting partners will provide further insights into the pathogenesis of CHARGE syndrome and ASD/NDD, we searched for additional associated polypeptides using the method of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) in combination with mass spectrometry. PRINCIPLE FINDINGS: The hitherto uncharacterized FAM124B (Family with sequence similarity 124B) was identified as a potential interaction partner of both CHD7 and CHD8. We confirmed the result by co-immunoprecipitation studies and showed a direct binding to the CHD8 part by direct yeast two hybrid experiments. Furthermore, we characterized FAM124B as a mainly nuclear localized protein with a widespread expression in embryonic and adult mouse tissues. CONCLUSION: Our results demonstrate that FAM124B is a potential interacting partner of a CHD7 and CHD8 containing complex. From the overlapping expression pattern between Chd7 and Fam124B at murine embryonic day E12.5 and the high expression of Fam124B in the developing mouse brain, we conclude that Fam124B is a novel protein possibly involved in the pathogenesis of CHARGE syndrome and neurodevelopmental disorders

Notch2 controls hepatocyte-derived cholangiocarcinoma formation in mice.

Liver cancer comprises a group of malignant tumors, among which hepatocellular carcinoma (HCC) and intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) are the most common. ICC is especially pernicious and associated with poor clinical outcome. Studies have shown that a subset of human ICCs may originate from mature hepatocytes. However, the mechanisms driving the trans-differentiation of hepatocytes into malignant cholangiocytes remain poorly defined. We adopted lineage tracing techniques and an established murine hepatocyte-derived ICC model by hydrodynamic injection of activated forms of AKT (myr-AKT) and Yap (YapS127A) proto-oncogenes. Wild-type, Notch1 flox/flox , and Notch2 flox/flox mice were used to investigate the role of canonical Notch signaling and Notch receptors in AKT/Yap-driven ICC formation. Human ICC and HCC cell lines were transfected with siRNA against Notch2 to determine whether Notch2 regulates biliary marker expression in liver tumor cells. We found that AKT/Yap-induced ICC formation is hepatocyte derived and this process is strictly dependent on the canonical Notch signaling pathway in vivo. Deletion of Notch2 in AKT/Yap-induced tumors switched the phenotype from ICC to hepatocellular adenoma-like lesions, while inactivation of Notch1 in hepatocytes did not result in significant histomorphological changes. Finally, in vitro studies revealed that Notch2 silencing in ICC and HCC cell lines down-regulates the expression of Sox9 and EpCAM biliary markers. Notch2 is the major determinant of hepatocyte-derived ICC formation in mice

Gene delivery to neural stem cells using minicircles and plasmids without CpG motifs

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Neural Stem Cells (NSC) are multipotent stem cells, capable of proliferating and differentiating in vivo and in vitro into astrocytes, oligodendrocytes and neurons. For this reason they hold a great potential for the development of gene and regenerative therapies for the treatment of neurodegenerative diseases and brain cancer. However, transfection of NSCs has proven to be difficult through conventional methods, and the disadvantages associated with the use of viral vectors make non-viral vectors more suitable for the development of gene delivery assays to NSCs. Apart from the non-viral method, one of the most important factors in gene delivery is the type of used vector. One of the factors that mostly affect the vector efficiency is the presence of CpG motifs. These motifs are responsible for the triggering of innate and acquired immune responses contributing to episomal silencing of the transgene. In this study, gene delivery to NSCs was optimized for the use of microporation technology and transfection efficiency was compared for the use of different transfection vectors with low vs. high CpG content, namely, minicircles, pCMV-GFP and pVAX-eGFP. The optimization of microporation conditions revealed that depending on the electroporation buffer, high number of transfected cells (60 to 75%) and low cell mortality (15-10%) are obtained when using 1500V, 20 ms and 1 pulse or 1800V, 20 ms and 1 pulse as microporation conditions. When comparing the transfection efficiency using different vectors it was evident that Minicircle was the vector that allowed the obtainment of sustained and higher number of transfected cells (75%) without affecting their survival (80-90% of cell viability) and morphology. The quantification of vector copies in the nuclei revealed that the optimal dose to transfect NSCs is around 0.8 μg, and that, although a similar number of Minicircle and pCMV-GFP copies per nucleus is found, the first are the vectors that yield the highest expression levels. Long term analysis also showed Minicircles are less degraded, exhibiting higher number of copies and GFP expression than pCMV-GFP or pVAX-eGFP. Finally, microporation did not seem to affect NSCs differentiation potential. Taken together, these results offer the first insights in the use of microporation and minicircles in non-viral transfection of NSCs, suggesting that microporation is a promising tool for NSCs transfection and that minicircles offer a new model of efficient and safe non-viral gene delivery to NSCs and have unquestionably a potential use for clinical applications and genetic engineering.Células estaminais representam um grupo específico de células indiferenciadas que apresentam a capacidade de se auto-renovar e de se diferenciar, quando estimuladas por determinadas condições, em células várias linhagens distintas. Existem dois tipos distintos de células estaminais: embrionárias e adultas. As células embrionárias apresentam a capacidade de se especificarem em vários tipos celulares no entanto, os problemas éticos muitas vezes associados com o seu isolamento e potencial cancerígeno, limitam o seu uso. Por este motivo, o interesse em células estaminais adultas, que apresentam apenas a capacidade de se especificar em tipos celulares provenientes do seu tecido de origem, tem vindo a aumentar exponencialmente. Células estaminais neurais (Neural stem cells – NSC) representam uma população de células que pode ser isolada a partir de tecido cerebral embrionário, fetal ou adulto. No cérebro em desenvolvimento estas células existem como progenitores neuroepiteliais que se diferenciam em vários progenitores neurais que vão dar origem aos três tipos celulares característicos do sistema nervoso, astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. No sistema nervoso adulto, estas células representam uma população de astrócitos que têm a capacidade de se diferenciar em caso de infecção ou inflamação, e habitam nichos específicos na zona subventricular do prosencéfalo e na zona subgranular do hipocampo. A sua capacidade única de se diferenciarem em células do sistema nervoso e de, após enxerto, conseguirem ultrapassar a barreira hematoencefálica, faz com que estas células apresentem um elevado potencial para o desenvolvimento de terapias regenerativas e genéticas para o tratamento de doenças neurodegenerativas e de cancro do cérebro. Em cultura, estas células são aderentes ou formam complexos esféricos de progenitores neurais, apresentam a forma bipolar e expressam factores característicos de células neuronais, tais como nestina, Sox2 e Pax6, e astrogliais, tais como GFAP, GLAST, BLBP e RC2. A capacidade de diferenciação que estas células apresentam e o desenvolvimento de protocolos de diferenciação simples e eficazes fez com que as NSCs tenham sido alvo de diversos estudos de regeneração de tecidos e transferência de genes. Estudos recentes demonstraram que em caso de enxerto, as NSCs conseguem diferenciar-se em neurónios dopaminérgicos e substituir lesões em modelos de doença de Parkinson e conseguem reduzir o processo inflamatório em modelos de esclerose múltipla. Em termos de entrega de genes, os estudos efectuados demonstraram que as NSCs podem ser transfectadas e entregar genes terapêuticos que potenciam o melhoramento de várias doenças de foro neurológico. Um dos grandes problemas até agora tem sido o desenvolvimento de métodos de transfecção eficientes. Até muito recentemente, a transfecção de NSCs era basicamente feita através de métodos virais, no entanto os problemas patogénicos associados a estes vectores e a possibilidade de indução de mutagénese das células transfectadas fez com que a atenção dos cientistas divergisse para as metodologias não virais. Em comparação com as primeiras, estas metodologias oferecem uma série de vantagens, tais como, maior capacidade de empacotamento, menor imunogenicidade, fácil e maior segurança de manuseamento. A entrega de genes usando estes métodos pode ser feita através de tratamentos químicos, como partículas de fosfato de cálcio, biopolímeros biodegradáveis e liposomas catiónicos, e através de tratamentos físicos, tais como sonoporação, bombardeamento de partículas, magnetofecção, electroporação e microporação. Para além do método de transfecção, há que ter em atenção o tipo de vector usado. Após transfecção, os vectores têm que ultrapassar barreiras extra e intracelulares que causam silenciamento episomal do transgene. É por este motivo que têm sido desenvolvidos muitos trabalhos com o intuito de melhorar os vectores. Um dos factores que mais afecta a eficiência de um plasmídeo é o conteúdo deste em motivos CpG. Estes dinucleótidos não-metilados são característicos de genomas bacterianos e, se presentes em plasmídos, são reconhecidos pelo sistema imunitário de mamíferos, mais especificamente por células que expressam TLR9, despoletando reacções imunológicas inatas e secundárias que levam à degradação do vector e posterior silenciamento do transgene. Recentemente têm sido produzidos plasmídeos de conteúdo reduzido em motivos CpG que em relação aos pDNAs convencionais, apresentam eficiência e persistência melhoradas. Para além destes tipos de vectores, o desenvolvimento da tecnologia de minicirculos, que são pequenos vectores desprovidos de sequências bacterianas e de conteúdo CpG reduzido, permitiu um melhoramento de 10 a 10,000x das eficiências de transfecção em relação aos pDNAs convencionais. O objectivo principal deste estudo foi a optimização das condições de transfecção não viral de NSCs (CGR8-NSC) por microporação e a comparação das eficiencias de transfecção de NSCs quando transfectadas com minicirculos e pDNAs com conteúdo em motivos CpG reduzido ou mesmo inexistente. Neste estudo, foram feitas duas optimizações das condições de microporação para o uso de dois tampões de electroporação diferentes, o RB, um tampão de formulação desconhecida, e o HMB, um tampão preparado no laboratório e que já tinha sido utilizado para transfectar células HEK293T e células estaminais mesenquimatosas. A microporação com o tampão RB foi feita transfectando pVAX-eGFP e variando a voltagem (entre 1400 e 1600V), a duração do pulso (20 e 30 ms) e o número de pulsos (1 e 2). A condição que no geral demonstrou ser mais eficaz foi 1500V, 20 ms e 1 pulso (percentagem de células transfectadas ≈ 60%; viabilidade e recuperação celular 85-90%). A optimização com HMB foi feita microporando as NSCs com dois vectores diferentes (pVAX-eGFP e MC-GFP) e variando a voltagem entre 1600 e 1900V. Apesar de, com o aumento da voltagem se ter verificado, em ambos os casos, uma diminuição das viabilidades e recuperações celulares (mais acentuada em células transfectadas com pVAX-eGFP), no geral, a condição que obteve os melhores resultados, exibindo as percentagens de células transfectadas (50 e 75% com pVAX-eGFP e PC-GFP) e rendimentos de transfecção (47 e 69% com pVAX-eGFP e MC-GFP) mais elevadas foi 1800V, 20 ms e 1 pulso. Um outro ensaio de optimização foi efectuado para determinar a quantidade ideal de DNA para transfectar NSCs. Para isto, NSCs foram ressuspendidas em RB e transfectadas com várias quantidades de pVAx-eGFP (0.5, 0.8, 1.0 e 1.5 μg) usando 1500V, 20 ms e 1 pulso como condições de microporação. Apesar de o aumento de DNA não ter afectado a percentagem de células GFP+ (≈50%) e de ter provocado uma diminuição das viabilidades e recuperações celulares, 0.8 μg foi a quantidade de pDNA que exibiu o maior rendimento de transfecção (≈40%), tendo sido por isso considerada a quantidade ideal de vector para transfectar NSCs. Para testar a eficiência de transfecção de minicirculos e outros pDNAs com conteúdo reduzido ou inexistente em CpGs as NSCs foram transfectadas com 2.0 x 1011 moléculas de cada vector. A transfecção com plasmídeos sem motivos CpG (pCpGfree-eGFP) revelou-se muito aquém do esperado, e quando comparando com NSCs transfectadas com pVAX-eGFP, a percentagem de células GFP+ era menor e o decaimento da expressão do transgene ao longo do tempo mais rápido em células transfectadas com pCpG-eGFP, indicando que talvez, o promotor deste plasmídeo não seja tão eficiente como o do pVAX-eGFP. Comparando células transfectadas com minicirculos (MC-GFP) com outros pDNAs (pCMV-GFP – plasmídeo correspondente de MC-GFP, e pVAX-eGFP) verificou-se que usando MC-GFP é possível manter elevados níveis de células transfectadas (≈75%) sem comprometer a viabilidade celular (80-90%) e a morfologia bipolar característica das NSCs em cultura. Adicionalmente, a expressão do gene mantém-se mais alta com MC-GFP ao longo de 10 dias e não afecta a proliferação celular. Testes adicionais foram efectuados para quantificar o número de cópias de vector no núcleo de NSCs transfectadas. Em estudos anteriores tinha-se verificado que há uma certa dose de plasmídeo a partir do qual a expressão do transgene satura. Em NSCs verificou-se que, independente do vector, a partir de 0.8 μg há uma estabilização e posterior decaimento da expressão da GFP, e, quando comparando o número de cópias de cada vector no núcleo, verificou-se que apesar da quantidade de MC-GFP e pCMV-GFP ser semelhante, o nível de expressão do primeiro era mais elevado. Adicionalmente, a análise ao longo de 10 dias da quantidade de cópias do núcleo revelou que o MC-GFP era o vector que se encontrava em maior quantidade no núcleo e o que revelava maiores níveis de expressão do transgene, indicando que este, devido ao seu menor tamanho e conteúdo CpG mais reduzido (≈6%) é menos degradado que os outros plasmídeos. Em comparação, os resultados com pCMV-GFP e pVAX-eGFP, que apresentam conteúdo semelhante em motivos CpG (≈7%), diferem muito entre si, apresentando o pCMV-GFP eficiências e viabilidades celulares mais elevadas. Este facto é difícil de ser explicado mas há três diferenças entre estes dois plasmideos que podem justificar esses valores: i) diferente sinal de poliadenilação dos dois plasmídeos (pVAX-eGFP apresenta o sinal BGH e o pCMV-GFP apresenta o sinal SV40), que como estudos anteriores já demonstraram pode influenciar os níveis de expressão, ii) diferenças na sequência do gene reporter que pode originar uma proteína com maior ou menor intensidade de fluorescência; iii) ou ao nível de purificação de cada plasmídeo. Finalmente, nem o uso de microporação nem a transfecção com plasmídeo afectou a capacidade de diferenciação das NSCs em neurónios. Comparando os resultados obtidos é possível concluir que o uso de microporação como método de transfecção de NSCs dá origem a elevadas eficiências de transfecção. Em comparação com os outros pDNAs, os Minicirculos foram os vectores que demonstraram as melhores eficiências de transfecção e os maiores níveis de expressão do transgene sem comprometer a morfologia e a viabilidade das células. Pode-se concluir que o tamanho destes vectores e que a diferença e 1% no conteúdo em motivos CpG é suficiente para que o silenciamento episomal do transgene seja mais fraco com MC-GFP. Como trabalho futuro, seria interessante avaliar a expressão de TLR9 em NSCs após transfecção para verificar se há realmente silenciamento devido aos motivos CpG e quantificar o RNA mensageiro para avaliar a estabilidade e frequência do transgene. Seria também muito benéfico avaliar a eficiência dos minicirculos através de transfecção por outros métodos não virais, tais como, lipofecção ou magnetofecção, e efectuar estudos in vivo para avaliar o tráfico intracelular de minicirculos, e também clonar um gene de interesse nos minicirculos para avaliar o seu potencial no desenvolvimento de futuras terapias para doenças de foro neurológico. Até à data, ainda não tinham sido efectuados estudos de transfecção em NSCs usando microporação ou minicirculos. Este trabalho representa a primeira perspectiva para o uso destas tecnologias para a transfecção destas células e indica que os minicirculos representam um novo modelo eficiente e seguro de entrega não viral de genes para NSCs e uma alternativa muito promissora para o desenvolvimento de terapias para o tratamento de doenças neurodegenerativas ou cancro do cérebro onde uma expressão transiente de transgene pode ser necessária

Human papillomavirus 16 L2 inhibits the transcriptional activation function, but not the DNA replication function, of HPV-16 E2

In this study we analysed the outcome of the interaction between HPV-16 L2 and E2 on the transactivation and DNA replication functions of E2. When E2 was expressed on its own, it transactivated a number of E2-responsive promoters but co-expression of L2 led to the down-regulation of the transcription transactivation activity of the E2 protein. This repression is not mediated by an increased degradation of the E2 protein. In contrast, the expression of L2 had no effect on the ability of E2 to activate DNA replication in association with the viral replication factor E1. Deletion mutagenesis identified L2 domains responsible for binding to E2 (first 50 N-terminus amino acid residues) and down-regulating its transactivation function (residues 301–400). The results demonstrate that L2 selectively inhibits the transcriptional activation property of E2 and that there is a direct interaction between the two proteins, although this is not sufficient to mediate the transcriptional repression. The consequences of the L2–E2 interaction for the viral life cycle are discussed