Trithorax group proteins: switching genes on and keeping them active

Cellular memory is provided by two counteracting groups of chromatin proteins termed Trithorax group (TrxG) and Polycomb group (PcG) proteins. TrxG proteins activate transcription and are perhaps best known because of the involvement of the TrxG protein MLL in leukaemia. However, in terms of molecular analysis, they have lived in the shadow of their more famous counterparts, the PcG proteins. Recent advances have improved our understanding of TrxG protein function and demonstrated that the heterogeneous group of TrxG proteins is of critical importance in the epigenetic regulation of the cell cycle, senescence, DNA damage and stem cell biology

Étude du rôle de la E3 ubiquitine ligase RFWD3 en réponse au stress réplicatif

Les cellules sont constamment soumises à des sources endogènes et exogènes de dommages à l’ADN pouvant conduire à l’accumulation de mutations et au développement de pathologies telles que le cancer. Parmi les sources endogènes, le stress réplicatif est un obstacle majeur au maintien de l’intégrité génomique qu’il est nécessaire de préserver avant la duplication des cellules. Les mécanismes de tolérance au stress réplicatif sont essentiels à la survie des cellules saines. En revanche, dans un contexte de pathologie cancéreuse, de nombreux agents chimiothérapeutiques visent particulièrement à cibler la réplication afin d’induire un stress délétère important pour pouvoir tuer spécifiquement les cellules tumorales qui ont un taux de réplication plus élevé que les cellules saines. Si les traitements actuels sont relativement efficaces, l’émergence de cellules cancéreuses résistantes aux agents chimiothérapeutiques est fréquente, car celles-ci sont capables de s’adapter et d’utiliser des voies alternatives de réparation et de tolérance leur permettant de faire face aux dommages causés par les réactifs. Le but de ce projet de recherche s’inscrit dans une motivation d’approfondir les connaissances des mécanismes moléculaires de réponse au stress réplicatif. Nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux rôles de deux E3 ubiquitine ligases PRP19 et RFWD3, dans la réponse au stress réplicatif. Ces deux protéines sont connues pour être localisées aux sites de dommages à l’ADN, via leur interaction avec RPA, un facteur clé, senseur de la voie de signalisation du stress réplicatif ATR-CHK1. PRP19 et RFWD3 sont importants pour l’ubiquitination de RPA et favorisent la réparation par recombinaison homologue. En revanche leurs mécanismes d’action précis aux sites de dommages restent encore flous. L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle importante dans la modulation et la régulation de la réponse aux dommages au même titre que la phosphorylation ou l’acétylation. De ce fait, il est concevable d’imaginer que PRP19 et RFWD3, via leur activité E3 ubiquitine ligase, régulent une panoplie de facteurs, en plus de RPA, pour moduler la réponse aux dommages à l’ADN. Actuellement, PRP19 et RFWD3 ont des substrats encore peu connus ce qui nous laisse un large éventail de recherche concernant l’identification de nouveaux facteurs potentiellement ubiquitinés par ces deux E3 ubiquitine ligases. Dans un premier manuscrit, nous avons tenté de caractériser au mieux comment PRP19 favorise l’ubiquitination de RPA aux fourches de réplications bloquées. Ainsi nous avons découvert que PRP19 collabore avec RFWD3 pour ubiquitiner RPA et qu’aucune de ces deux E3 ubiquitine ligases n’est suffisante à elle seule. Nous avons également montré que PRP19 interagit avec la forme phosphorylée de RPA, grâce à un patch chargé positivement présent sur son domaine WD40, pour être recruté aux sites de dommages tandis que RFWD3 interagit de façon constitutive avec RPA. Le recrutement de PRP19 permet ainsi l’activation d’ATR nécessaire à l’hyper-phosphorylation de RPA et tous ces évènements semblent fonctionner dans une boucle d’amplification positive pour favoriser l’ubiquitination de RPA par PRP19 et RFWD3. Nous avons également caractérisé les interactomes de PRP19 et RFWD3 en réponse au stress réplicatif afin d’identifier de nouveaux facteurs jouant un rôle dans la réponse aux dommages à l’ADN et dont la fonction serait potentiellement modulée par leur ubiquitination. Dans le second manuscrit que je présente dans cette thèse, nous avons focalisé notre attention sur les résultats issus de l’interactome de RFWD3. Nous avons identifié parmi ces interacteurs la translocase SMARCAL1 (SWI/SNF2-related, matrix-associated, actin dependent regulator of chromatin subfamily A-like 1), un facteur essentiel pour la réversion des fourches de réplication en réponse au stress réplicatif. Mes travaux montrent que RFWD3 ubiquitine SMARCAL1 pour le désengager des fourches de réplication bloquées et empêcher la formation de fourches aberrantes clivées par MUS81 et délétères pour la cellule. Nous montrons aussi qu’en réponse aux rayons ultraviolets, la déplétion de RFWD3 induit une accumulation de RPA-ADN simple brin qui est partiellement dépendante de SMARCAL1 et MUS81 suggérant que RFWD3 régule également d’autres facteurs qui sont impliqués dans la réparation des trous (nicks) d’ADN simple brin induits par les ultraviolets. Nous avons pu caractériser l’une des fonctions de RFWD3 dans la réponse au stress réplicatif qui est la modulation de la fourche de réplication via la régulation de la localisation de SMARCAL1 sur RPA médiée par son ubiquitination en réponse au stress réplicatif, cependant, il reste encore de nombreuses pistes à étudier. En effet, l’identification des différents interacteurs de PRP19 et RFWD3 nous permettent de suggérer des rôles dans la régulation de différents facteurs importants pour la réponse au stress réplicatif. L’émergence fréquente de cellules cancéreuses résistantes aux traitements chimiothérapeutiques existants a encouragé le développement d’inhibiteurs de la réponse au stress réplicatif (e.g. inhibiteurs des kinases ATR et CHK1) pour améliorer l’efficacité des traitements actuels. Dans ce contexte, étudier et caractériser avec précision les mécanismes impliqués dans la réponse au stress réplicatif constitue un enjeu important pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques

The role of the human INO80 complex in telomere maintenance

Les extrémités des chromosomes contiennent des répétitions de séquences d’ADN appelées télomères qui empêchent l’activation inopportune de la réponse aux dommages de l'ADN afin de préserver l'intégrité génomique. Les télomères raccourcissent à chaque cycle de réplication d’ADN et la télomérase a pour fonction de contrebalancer cette érosion en allongeant les télomères. Les cellules somatiques n’expriment pas la télomérase, donc leur durée de vie est normalement limitée par ce raccourcissement progressif des télomères qui conduit à l'activation de la voie p53 entraînant un arrêt de la croissance cellulaire. En revanche, les cellules cancéreuses acquièrent l'immortalité cellulaire principalement en réactivant la télomérase ou en utilisant des méthodes alternatives d'allongement des télomères basées sur la recombinaison d’ADN. Auparavant, dans notre laboratoire, un criblage CRISPR à l'échelle du génome a été réalisé dans la lignée cellulaire pré-B NALM-6 traitée avec la molécule BIBR1532, un inhibiteur de la télomérase. Ces résultats suggéraient que cinq sous-unités du complexe de remodelage de la chromatine INO80, lorsque supprimées indépendamment, réduisaient la prolifération des cellules ayant un raccourcissement des télomères induit par le BIBR1532. Mon objectif était d'étudier cette interaction génétique afin de comprendre les processus biologiques impliqués dans cette létalité synthétique. Après l'élimination des gènes codant à la fois pour la sous-unité enzymatique de la télomérase humaine (hTERT) ainsi que les sous-unités spécifiques du complexe INO80 humain, nous avons constaté que les cellules double-négatives avaient une capacité proliférative réduite, ce qui démontre que l’interaction génétique mesurée par criblage CRISPR est bel et bien spécifique. Étant donné le rôle du facteur de transcription p53 dans la réponse cellulaire au raccourcissement télomérique, nous avons exploré l’importance de cette voie de signalisation pour l’interaction entre le complexe INO80 humain et la télomérase. Après l’activation de p53 avec un traitement avec la molécule nutlin-3a, les niveaux d'expression de plusieurs cibles de p53 tels que MDM2 et CDKN1A ont augmenté dans les cellules ayant une délétion du gène NFRKB, codant pour une sous-unité du complexe INO80 humain. Les cellules ayant une délétion du gène UCHL5, codant pour le partenaire d’interaction de NFRKB, ont également montré une augmentation de l’expression de MDM2 lorsque traitées avec nutlin-3a. Enfin, la perte de télomérase (hTERT) modifie les niveaux d'expression des composants de la 2 voie p53 CDKN1A, BAX et MDM2. En conclusion, la suppression des gènes codant pour des sous-unités du complexe INO80 telles que NFRKB ou UCHL5 est nuisible aux cellules ayant une délétion de la télomérase. Le complexe INO80 humain peut être impliqué dans l'inhibition de la voie p53, en réponse à l'activation de p53 soit par des télomères courts ou avec un traitement avec nutlin-3a. Des recherches plus approfondies sur cette interaction génétique pourraient mener au développement de nouvelles thérapies combinatoires afin d’inhiber la croissance des cellules cancéreuses.The ends of chromosomes contain telomeric repeats that prevent the DNA damage response from being activated in order to preserve genomic integrity. Telomerase functions to alleviate incomplete DNA replication at telomeres, and to repair those telomeres damaged by various means including oxidative damage. The lifespan of telomerase negative somatic cells is normally restricted by gradual telomere shortening which can lead to the activation of the p53 pathway resulting in cellular growth arrest. Cancer cells often elongate their telomeres in order to acquire cellular immortality predominantly by reactivating telomerase or by using recombination-based, alternative telomere lengthening methods. Previously in our lab, a genome-wide CRISPR screen was conducted in the pre-B cell line NALM-6 treated with a small molecule inhibitor of telomerase, BIBR1532. These previous results suggested that five subunits of the INO80 chromatin-remodeling complex, when independently deleted, reduced cellular proliferation in cells with BIBR1532 induced telomere shortening. My goal was to investigate this genetic interaction in order to understand the biological processes implicated in this synthetic lethal relationship. After the knockout of the genes encoding both the enzymatic subunit of human telomerase (hTERT) and specific subunits of the human INO80 complex, I found that the proliferative capacity of NALM-6 cells was reduced. This result indicates the genetic interaction identified by CRISPR screening is in fact specific. In addition, after p53 stimulation with nutlin-3a treatment, expression levels of the p53 pathway component MDM2 were altered after the knockout of the genes encoding specific subunits of the human INO80 complex, NFRKB and UCHL5, individually. CDKN1A expression was also altered after nutlin-3a treatment and NFRKB knockout. Finally, the loss of telomerase (hTERT) alters the expression levels of the p53 pathway components CDKN1A, BAX and MDM2. In conclusion, the deletion of the genes encoding specific subunits of the INO80 complex, including NFRKB and UCHL5, is harmful to cells after hTERT knockout. The human INO80 complex may be involved in inhibiting the p53 pathway, in response to p53 activation by short telomeres or nutlin-3a treatment. Further investigation into this synthetic lethal relationship may shed light on new combinatorial therapeutics in cancer

Remodelage de la chromatine lors de l'activation transcriptionnelle synergique de cdx1 par l'acide rétinoïque et par Wnt3a

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal

Le coeur des ARN non codants - Un long chemin à découvrir [In the heart of noncoding RNA: a long way to go].

The identification and characterization of long noncoding RNA in a variety of tissues represent major achievements that contribute to our understanding of the molecular mechanisms controlling gene expression. In particular, long noncoding RNA play crucial roles in the epigenetic regulation of the adaptive response to environmental cues via their capacity to target chromatin modifiers to specific locus. In addition, these transcripts have been implicated in controlling splicing, translation and degradation of messenger RNA. Long noncoding RNA have also been shown to act as decoy molecules for microRNA. In the heart, a few long noncoding RNA have been demonstrated to regulate cardiac commitment and differentiation during development. Furthermore, recent findings suggest their involvement as regulators of the pathophysiological response to injury in the adult heart. Their high cellular specificity makes them attractive target molecules for innovative therapies and ideal biomarkers

Regulation of transcription elongation factors SPT2 and SPT6 by casein kinase II

Comme pour tous les autres processus en lien avec l’ADN, la structure de la chromatine lors de la transcription est dans un état de perpétuel changement. Ainsi, elle est ouverte pour permettre l’accès à l’ADN, pour ensuite se replier correctement. La dynamique de la structure chromatinienne est régulée finement par de multiples mécanismes qui agissent ensemble afin de rendre le processus hautement efficace. Ces mécanismes comprennent les modifications post-traductionelles des histones, le remodelage de la chromatine par les remodeleurs ATP-dépendants, l’incorporation des variants d’histones et l’assemblage/désassemblage des nucléosomes par les chaperons d’histones. En plus de ces activités, il y a un certain nombre de composantes non-reliées aux histones qui sont directement impliquées dans les modulations de la conformation de la chromatine associées à la transcription. Chez la levure, un de ces facteurs est la protéine HMG-like Spt2p, démontrée précédemment comme étant directement impliquée dans le réassemblage des nucléosomes dans le sillon de l’ARN polymérase II en déplacement le long du segment d’ADN transcrit. Dans la présente étude, nous démontrons que Spt2p est phosphorylée directement par la caséine kinase II (CKII) et que cette modification inhibe sa liaison à la chromatine. Nos résultats indiquent que la CKII altère l’interaction de Spt2p avec le chaperon d’histone Spt6p. Nous avons aussi trouvé que la phosphorylation directe de Spt6p par la CKII stimule l’association de ce facteur avec un autre partenaire, Iws1p. Cette association est absolument nécessaire pour le repliement correct des nucléosomes durant l’élongation. De plus, cette régulation positive du complexe Spt6p/Iws1p par la CKII module directement l’association de ce complexe avec la méthyltransférase de H3K36, Set2p. Finalement, nous avons montré que la phosphorylation de Spt6p par la CKII est essentielle à l’inhibition des promoteurs cryptiques et des erreurs de transcription. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent un nouveau mécanisme par lequel la CKII contrôle le repliement correct de la structure de la chromatine dans les régions codantes en modulant les interactions du chaperon d’histone essentiel Spt6p avec ses partenaires Spt2p, Iws1p et Set2p.Like any other DNA-related process, chromatin structure is in a state of constant flux during transcription, unfolded to get access to DNA and refolded back properly. The dynamics of chromatin structure are tightly regulated and multiple mechanisms act together to make the process highly efficient. These include modifications of histones, chromatin remodeling by ATP-dependent remodeling factors, incorporation of histone variants and nucleosome disassembly and reassembly by histone chaperones. In addition to these activities, there are a number of non-histone chromatin components that are directly involved in the modulation of chromatin associated with transcription. In yeast, one of these factors is the HMG-like protein Spt2p previously shown to participate directly in the process of nucleosome reassembly in the wake of RNA polymerase II movement along transcribed DNA. In this work, we show that Spt2p is directly phosphorylated by the casein kinase II (CKII) and we demonstrate that this modification inhibits its association with chromatin. Our findings indicate that CKII disrupts the interaction of Spt2p with the histone chaperone Spt6p. Interestingly, we also found that direct phosphorylation of Spt6p by CKII stimulates the association of this factor with another partner, Iws1p. This association is absolutely required for the refolding of nucleosomes during elongation. Furthermore, this positive regulation of the Spt6p/Iws1p complex by CKII modulates directly the association of this complex with the H3K36 methyltransferase Set2p. Finally, we show that phosphorylation of Spt6p by CKII is essential to the inhibition of cryptic promoters and spurious transcription. Taken together, our results suggest a new mechanism whereby CKII directs chromatin structure refolding in coding regions by modulating the interaction of the essential histone chaperone Spt6p with its partners Spt2p, Iws1p and Set2p

Modulation du positionnement des nucléosomes par le variant d'histone H2A.Z chez Saccharomyces cerevisiae

Dans le noyau des cellules eucaryotes, l'ADN est empaqueté dans une structure nommée chromatine, principalement grâce à des protéines appelées histones. Le haut niveau de compaction de cette structure exerce généralement un effet négatif sur les processus impliquant l'ADN, tels la recombinaison, la réplication, la réparation et la transcription. Un remodelage de la chromatine est nécessaire pour que ces processus puissent être effectués. Ce remodelage peut impliquer divers procédés, dont l'incorporation de variants d'histones. Le variant d'histone H2A.Z a ici été étudié afin de mieux comprendre son rôle dans la régulation de la transcription chez Saccharomyces cerevisiae. La présence du variant d'histone H2A.Z aux promoteurs des gènes GAL1 et GAL10 , impliqués dans le catabolisme du galactose, a été observée par immunoprécipitation de la chromatine par notre groupe. Nous avons aussi déterminé que sa présence est nécessaire pour l'activation de la transcription de ces gènes, son rôle exact restant encore irrésolu. Les travaux ci-présentés se basent sur l'hypothèse selon laquelle H2A.Z joue un rôle dans la stabilisation de nucléosomes clés à la région promotrice, en attente du signal d'activation, lesquels seraient désassemblés au moment de l'induction. Aussi, nous avons voulu étudier le rôle de H2A.Z sur le positionnement, la stabilité et l'abondance relative des nucléosomes à l'ensemble de la région promotrice de GAL1 et GAL10 chez Saccharomyces cerevisiae à l'aide de la technique de balayage des nucléosomes. Cette technique a nécessité une mise au point à ce jour inachevée, étant donné la rencontre de différents obstacles, tels le besoin d'un contrôle pour réduire les faux positifs, l'optimisation de l'amplification par toutes les paires d'amorces dans les mêmes conditions expérimentales, etc. Ainsi, il a été possible d'obtenir un patron reproductible du positionnement des nucléosomes à la région promotrice de GAL1 et GAL10 en absence d'induction dans la levure de type sauvage et pour le mutant de délétion de H2A.Z correspondant. Ces patrons démontrent des positions similaires, mais des niveaux d'abondance différents pour certains nucléosomes, ce qui permet de supposer que H2A.Z influence la stabilité de certains nucléosomes, du moins à cette région promotrice. Dans le but de valider la technique utilisée, des études similaires ont été réalisées à une autre région promotrice bien caractérisée. Le promoteur du gène CHA1 a récemment fait l'objet de plusieurs études sur le positionnement des nucléosomes à sa région promotrice, de même que sur la présence du variant d'histone H2A.Z à cette même région. De ces expériences découlent la connaissance du positionnement des nucléosomes au promoteur en absence et en présence d'induction du gène, en plus de la confirmation de la présence de H2A.Z à cette région. Ce gène modèle a permis de valider l'efficacité de la technique de balayage des nucléosomes à fournir les mêmes résultats que ceux observés précédemment. Afin de vérifier le rôle de H2A.Z dans l'activation de la transcription de ce gène, un essai d'extension d'amorce a été réalisé. Contrairement au résultat attendu, il a été observé que la délétion de H2A.Z a un effet positif sur l'expression de CHA1. Les expérimentations réalisées dans le cadre de ces travaux de maîtrise permettent de constater que la technique de balayage des nucléosomes est adéquate pour reproduire le positionnement des nucléosomes à la région promotrice de CHA1. Toutefois, à la région promotrice de GAL1 et GAL10 , cette technique ne semble pas encore tout à fait au point. Finalement, il peut être conclu que l'influence du variant d'histone H2A.Z sur la régulation de la transcription de ces gènes s'exerce via des mécanismes différents

Structure tridimensionnelle du complexe histone acétyltransférase NuA4 (S. cerevisiae)

Chez S.cerevisiae, NuA4 est un complexe Histone acetyltransferase (HAT) de 1,3 MDa contenant 13 sous unités. Esal, seule HAT essentielle chez la levure, est la sous-unité catalytique qui acétyle les histones H4 et H2A et une des six protéines essentielles du complexe. De plus, six protéines sont présentes dans d'autres complexes de modification (SAGA, Sin3/Rpd3) et de remodelage ATP- dépendant de la chromatine (Ino80 et Swrl) et deux sous-groupes ont été identifiés comme ayant une activité cellulaire indépendante et distincte de NuA4 (PiccoloNuA4 et le trimère Eaf5/7/3). Cette organisation modulaire de NuA4 correspond aux multiples besoins de recrutements et de régulation d'Esal par la cellule lors des événements de réparation, de transcription et de replication de la chromatine. Chez l'humain, le complexe Tip60 est l'orthologue de NuA4 et regroupe les activités de modification de la chromatine de NuA4 et de Swrl. L'organisation spatiale de NuA4 présente donc beaucoup d'intérêt. Au sein du laboratoire du professeur Jacques Côté, je concentre mon travail sur la production et la purification du complexe NuA4. Avec nos échantillons hautement purifiés, les techniques d'analyse par microscopie électronique (EM) et de reconstitution informatique, réalisées par nos collaborateurs Johnathan Chittuluru et Francisco Asturias, permettent, avec une forte résolution, de visualiser le complexe en 3D. Les atouts majeurs associés à cette technique sont aussi de visualiser les interactions du complexe avec un nucléosome et de localiser les sous-unités dans le complexe (par deletion ou étiquetage). Dès lors, ces résultats apportent des indications pertinentes sur NuA4 et ces différents modules qui par recrutement ou interaction directe avec les histones participent à la régulation dynamique de la chromatine

Caractérisation du rôle de HSM3 en transcription génique chez Saccharomyces cerevisiae

La chromatine est une structure composée d'ADN et de protéines, principalement des histones, permettant la compaction du génome à l'intérieur du noyau des cellules eucaryotes. Cette compaction de l'ADN, bien qu'essentielle, représente dans un même temps une barrière à plusieurs processus cellulaires exigeant un accès à l'ADN, dont la transcription génique. L'échange d'histones canoniques par des variants d'histones, tel H2A.Z, est un des moyens utilisés par les cellules pour reconfigurer la chromatine, et ainsi contrôler l'expression des gènes. Connaître les interactions protéiques de H2A.Z est donc une façon de mieux comprendre cette histone, mais également les mécanismes de transcription génique. Dans ce but, nous avons utilisé et optimisé une méthode basée sur une purification par affinité en tandem de protéines complexées à H2A.Z sur la chromatine, chez la levure Saccharomyces cerevisiae . Les partenaires protéiques de H2A.Z isolés de cette façon ont par la suite pu être identifiés à l'aide de la spectrométrie de masse, et c'est ainsi que la protéine Hsm3 a été relevée. La protéine Hsm3 était déjà connue comme étant importante pour la réparation des bases mal appariées, ainsi que comme chaperonne dans l'assemblage de la base de la sous-unité 19S du protéasome, mais aucun rôle en transcription ne lui était jusqu'à présent associé. Nous avons tenté de mieux caractériser cette protéine en construisant une souche de levure n'exprimant plus le gène HSM3 , puis en faisant des essais de croissance avec cette souche sur différents milieux. Ceci nous a permis de constater que Hsm3 est importante pour la croissance des cellules sur un milieu contenant de la caféine. À l'aide d'autres immunoprécipitations, nous avons par la suite pu confirmer l'interaction de cette protéine avec les histones H2A et H2A.Z sur la chromatine. Des essais d'expression ont finalement démontré la nécessité de Hsm3 pour l'induction de l'expression des gènes INO1, SUC2, GAL1 et GAL10 , mais seulement sous certaines conditions de croissance. Puisque cette protéine était déjà connue en tant que chaperonne du protéasome, nous avons vérifié si les phénotypes associés à la suppression de Hsm3 provenaient seulement d'un retard dans l'assemblage de ce complexe. Pour ce faire, nous avons comparé les effets de l'inactivation du protéasome à une suppression de Hsm3 sur l'induction de l'expression des gènes, mais nos résultats ne nous ont pas permis de confirmer ni d'infirmer cette hypothèse. En conclusion, la protéine Hsm3 interagit directement avec la chromatine, et est impliquée dans certains mécanismes de transcription génique, cette implication étant fortement dépendante des conditions de croissance utilisées