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    Characterization and modulation of technofunctional properties of pea proteins

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    Plant-derived ingredients for food formulation have gained increasing interest in recent years as animal products pose a higher burden on the environment. Among plant proteins, those from pea (Pisum sativum L.) are of particular interest because of their low allergenicity, low cost, high availability, and good reputation among consumers. However, the technofunctionality of pea proteins is often inferior to animal-derived proteins limiting a more widespread use in food products. These technofunctional properties include - among others - foaming, gelling, and binding of other ingredients and it depends on the food product, which functionality food scientists must utilize and optimize. Cost effective approaches to improve the technofunctionality of pea proteins are therefore desirable and would allow the industry to further implement the use of sustainable ingredients in foods. In line with these overall goals, the aim of the first section of this thesis was to characterize a commercial pea protein isolate and to modulate the physicochemical and technofunctional properties through homogenization for foaming application. The main goal of the second section was to mix pea proteins with pectin to obtain a suitable binder with desired properties for the application in meat alternatives. The mixing approach was based on previous research data that had shown that interacting protein-polysaccharide systems display a synergistic behaviour in terms of their functional properties. First section: Foams are two phase systems consisting of gas bubbles that are stabilized by surface-active ingredients such as proteins in the discontinuous, aqueous phase. The physico-chemical properties of proteins such as their solubility determines foaming performance. In Chapter I, a commercial pea protein isolate was fractionated into a water-soluble and a water-insoluble fraction for characterization. Although the two fractions were similar in protein composition, they showed distinct differences in physicochemical properties. For instance, the particle size of soluble pea proteins was around 40-50 µm at acidic pH (3-5), while no measurable particles were detected at neutral The insoluble pea proteins were large at pH 3 and 7 (> 80 µm) and ca. 40-50 µm close to their isoelectric point at pH 5. The results suggest that commercial pea protein isolates consisted of several fractions with differences in their physico-chemical properties. The yield of the water-insoluble fraction was higher and therefore used in Chapter II, where experimental results illustrated that dispersions of insoluble pea protein aggregates (5% w/w, pH 7) could be disrupted from 180 ± 40 µm (control) to 0.2 ± 0.0 µmm upon homogenization at pressures ≥ 125 MPa. This was attributed to a cleavage of intermolecular interactions such as disulphide bonds, hydrogen bonds, and hydrophobic interactions. The decrease in insoluble pea protein aggregate size was accompanied by an increase in solubility from 23 ± 1% to ≥ 80% that may be beneficial for its technofunctionality. Consequently, homogenization was applied to the same material at pH 3 and 5 with the aim of investigating its foaming performance in Chapter III. In general, unhomogenized dispersions of pea protein aggregates (5% w/w, pH 3 or 5) did not foam at both tested pH values due to large pea protein aggregates with low solubility and surface activity. At pH 3, the dissociation of pea protein aggregates into smaller, more soluble, and more surface-active proteins was responsible for a high foam capacity (FC = 360-520%) with medium foam stability as measured by drainage (FS = 19-30 min). Only a limited particle size reduction upon homogenization was observed at pH 5, which was close to the isoelectric point of the pea proteins. Nevertheless, the still large aggregates consisted of re-aggregated smaller protein particles that were able to form a smaller amount of rather stable foams with thick interfacial films (FC = 213-246%, FS = 32-42 min). Overall, homogenization of insoluble pea protein aggregates was shown to change its physicochemical properties thereby benefitting technofunctional properties such as foaming. Second section: Another technofunctionality of interest is binding of different structural elements in e.g., meat alternatives. For this, the binder must be i.) sticky to glue heterogeneous components together and ii.) able to readily solidify upon further processing thereby ensuring a coherent bulk matrix. In Chapter IV, the influence of pH (3.50, 4.75, 6.00) and biopolymer concentration (17.5-50.0% w/w) on the stickiness of a pea protein isolate apple pectin mixture (mixing ratio r = 6:1) was investigated. It was found that biopolymer concentrations of 17.5-20.0% w/w led to low stickiness due to a lack of cohesive forces (WoA = 0.29-0.51 mJ). At high biopolymer concentrations of 40-50% w/w, the biopolymer mixtures were also not sticky because of adhesion being limited (WoA = 0.02-0.05 mJ). There was a good balance of adhesion and cohesion that facilitated a high stickiness (WoA = 0.48-0.65 mJ) at intermediate concentrations of 25-30% w/w, which was also indicated by a viscoelastic behavior (G ≈ G). At those concentrations, the mixtures at pH 6 were stickier due to increased swelling of the pea proteins. The importance of viscoelasticity for stickiness of biopolymer mixtures was confirmed in Chapter V, where pea protein isolate and apple pectin (25% w/w, pH 6) were mixed in different ratios r. Mixtures of pea protein and apple pectin and particularly the sample with r = 2:1 possessed high stickiness due to the development of a multiphase morphology that allowed for a good balance of adhesion and cohesion with distinct frequency dependency. Pea protein alone (r = 1:0, c = 25% w/w) had an elastic but soft texture with low stickiness due to limited viscous properties, whereas a sample solely consisting of apple pectin (r = 0:1, c = 25% w/w) was also not sticky because of its high cohesion and stiffness. The results of Chapter VI revealed that pea protein homogenization prior to mixing with apple pectin led to smaller protein particles in the blend that contributed to a higher cohesive strength. Interestingly, vacuum-dried pea proteins resulted in a higher network strength as this drying method prevented reaggregation of small protein particles to a higher extent as compared to freeze-drying. Overall, the mixture with homogenized and vacuum-dried pea proteins was nearly twice as sticky as the mixture with untreated pea proteins. In Chapter VII, sticky mixtures of different pea protein preparations (soluble, homogenized and unhomogenized pea proteins) and pectin (25% w/w, pH 6, r = 2:1) were tested for their ability to solidify upon different treatments, namely heating as well as the addition of transglutaminase, laccase, calcium, and combinations thereof. Calcium was found to facilitate crosslinking of pectin chains and thus induced solidification of the mixtures. For instance, the consistency coefficient K increased from 2800 ± 1000 Pasn for pea protein isolate apple pectin mixtures to around 19000 Pasn when calcium was added. Heat treatment and transglutaminase did not lead to solidification indicating that pectin made up the continuous phase. Furthermore, laccase led to the highest degree of solidification when sugar beet pectin was used (K > 30000 Pasn) due to ferulic acid and pea protein tyrosine crosslinking. Consequently, the sticky mixture of pea protein and sugar beet pectin (25% w/w, pH 6, r = 2:1) with the addition of laccase for solidification was identified as the most suitable binder for a bacon type meat analogue, which was the object of the study carried out in Chapter VIII. This binder had the highest binding strength (W = 2.0-4.3 mJ) between textured protein, fat mimic, and both layers at 25 °C due to the introduction of covalent bonds by laccase within the binder and between the binder and the adherends. A control sample without laccase addition had lower binding properties (W = 0.7-1.0 mJ) and the binding strength of a methylcellulose hydrogel (6% w/w) serving as benchmark was only higher between two fat mimics at 70 °C (W = 1.8 ± 1.1 mJ) due to increased hydrophobic forces. Finally, the pea protein sugar beet pectin binder (22.5% w/w, pH 6, r = 2:1) was tested in burger patty type meat analogues to glue textured vegetable protein and fat particles together (Chapter IX). The binder system did not influence the hardness of the burger patties suggesting that this property was governed by the structural elements and not the binder. However, the cohesiveness as determined by sensory analysis was found to be superior when the pea protein sugar beet pectin binder was used (-0.7 ± 0.2) as compared to the methylcellulose benchmark (-2.9 ± 0.3). This was attributed to the sticky character of the biopolymer mixture that enabled improved binding of the different structural elements. Overall, this novel binder based on plant-derived ingredients was shown to be applicable in different meat alternatives. Last, Chapter X reviewed the functionality and binding mechanism of currently used binders in foods and showed that stickiness, hardening/solidification, and water holding capacity are of great importance. In many food products, the binder transitions from a sticky food glue to a solid matrix triggered by different process operations that depend on the characteristics of the applied binder. From the presented results, it can be concluded that pea proteins are useful functional ingredients in various application scenarios. The desired technofunctionality can be improved through different process operations such as fractionation, homogenization, or mixing with other plant-derived ingredients. For this, knowledge regarding structure-function relationship and other influential factors is needed. In some cases such as in binders process operations must be well orchestrated to induce structural transitions and therefore changes in functionality at the desired time during manufacturing. Overall, the results of this thesis contributed to a better understanding for a more widespread use of pea proteins to promote a more sustainable food system. The appended graphical abstract summarizes the key steps undertaken in this thesis to come to this conclusion.Pflanzliche Inhaltsstoffe fĂĽr die Herstellung von Lebensmitteln haben in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen, da tierische Produkte eine größere Belastung fĂĽr die Umwelt darstellen. Unter den pflanzlichen Proteinen sind diejenigen aus Erbsen (Pisum sativum L.) wegen ihrer geringen Allergenität, ihrer niedrigen Kosten, ihrer hohen VerfĂĽgbarkeit und ihrer Wertschätzung seitens der Verbraucher von besonderem Interesse. Die Technofunktionalität von Erbsenproteinen ist jedoch häufig schlechter als die von tierischen Proteinen, was eine breitere Verwendung in Lebensmitteln einschränkt. Zu diesen technofunktionellen Eigenschaften gehören unter anderem Schäumen, Gelieren und Binden anderer Zutaten, und es hängt vom Produkt ab, welche Funktionen Lebensmittelwissenschaftler nutzen und optimieren mĂĽssen. KostengĂĽnstige Ansätze zur Verbesserung der Technofunktionalität von Erbsenproteinen sind daher wĂĽnschenswert und wĂĽrden es der Industrie ermöglichen, die Verwendung nachhaltiger Zutaten in Lebensmitteln weiter zu beschleunigen. Basierend auf diesen ĂĽbergeordneten Absichten bestand das Ziel des ersten Abschnitts dieser Arbeit darin, ein kommerzielles Erbsenproteinisolat zu charakterisieren und die physikochemischen und technofunktionellen Eigenschaften durch Homogenisierung fĂĽr die Anwendung als Schaumbildner zu modulieren. Das Hauptziel des zweiten Abschnitts bestand darin, Erbsenproteine mit Pektin zu mischen, um ein geeignetes Bindemittel mit den gewĂĽnschten Eigenschaften fĂĽr die Anwendung in Fleischalternativen zu erhalten. Der Mischungsansatz basierte auf frĂĽheren Forschungsdaten, die zeigten, dass interagierende Protein-Polysaccharid-Systeme eine Synergie in Bezug auf ihre funktionellen Eigenschaften aufweisen. Erster Abschnitt: Schäume sind Zweiphasensysteme, die aus Gasblasen bestehen und durch oberflächenaktive Bestandteile wie Proteine in der diskontinuierlichen, wässrigen Phase stabilisiert werden. Die physikochemischen Eigenschaften der Proteine, wie ihre Löslichkeit, bestimmen die Schaumbildung. In Kapitel I wurde ein kommerzielles Erbsenproteinisolat zur Charakterisierung in eine wasserlösliche und eine wasserunlösliche Fraktion auftrennt. Obwohl die beiden Fraktionen eine ähnliche Proteinzusammensetzung aufwiesen, zeigten sie deutliche Unterschiede in ihren physikochemischen Eigenschaften. So betrug die Partikelgröße der löslichen Erbsenproteine bei saurem pH-Wert (3-5) etwa 40-50 µm, während bei neutralem pH-Wert keine messbaren Partikel festgestellt wurden. Die unlöslichen Erbsenproteine waren hingegen bei pH 3 und 7 groĂź (> 80 µm) und lagen bei pH 5 (in der Nähe ihres isoelektrischen Punktes) bei ca. 40-50 µm. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass handelsĂĽbliche Erbsenproteinisolate aus mehreren Fraktionen bestehen, die sich in ihren physikochemischen Eigenschaften unterscheiden. Die Ausbeute der wasserunlöslichen Fraktion war höher und wurde daher in Kapitel II verwendet. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass Dispersionen von unlöslichen Erbsenproteinaggregaten (5% w/w, pH 7) durch Homogenisierung bei einem Druck von ≥ 125 MPa von 180 ± 40 µm (Kontrolle) auf 0,2 ± 0,0 µm zerkleinert werden konnten. Dies wurde auf eine Spaltung der intermolekularen Wechselwirkungen wie Disulfidbindungen, WasserstoffbrĂĽcken und hydrophobe Wechselwirkungen zurĂĽckgefĂĽhrt. Die Verringerung der Größe der unlöslichen Erbsenproteinaggregate ging mit einem Anstieg der Löslichkeit von 23 ± 1% auf ≥ 80% einher, was wiederum fĂĽr die Technofunktionalität von Vorteil sein könnte. Folglich wurde das gleiche Material bei einem pH-Wert von 3 und 5 homogenisiert, um die Schaumkapazität und Schaumstabilität in Kapitel III zu untersuchen. Im Allgemeinen schäumten unhomogenisierte Dispersionen von Erbsenproteinaggregaten (5% w/w, pH 3 oder 5) bei beiden getesteten pH-Werten nicht, was auf groĂźe Erbsenproteinaggregate mit geringer Löslichkeit und Oberflächenaktivität zurĂĽckzufĂĽhren ist. Bei pH 3 war die Dissoziation der Erbsenproteinaggregate in kleinere, besser lösliche und oberflächenaktivere Proteine verantwortlich fĂĽr eine hohe Schaumkapazität (360-520%) mit mittlerer Schaumstabilität (= 19-30 min), die mittels Drainage gemessen wurde. Bei pH 5, der nahe dem isoelektrischen Punkt der Erbsenproteine lag, wurde nur eine begrenzte Verringerung der Partikelgröße bei der Homogenisierung beobachtet. Dennoch bestanden die immer noch groĂźen Aggregate aus reaggregierten kleineren Proteinpartikeln, die eine kleinere Menge recht stabile Schäume mit dicken Grenzflächenfilmen bildeten (Schaumkapazität = 213-246%, Schaumstabilität = 32-42 min). Insgesamt hat sich gezeigt, dass die Homogenisierung von unlöslichen Erbsenproteinaggregaten deren physikochemische Eigenschaften verändert und dadurch technofunktionelle Eigenschaften wie das Schäumen begĂĽnstigt wurden. Zweiter Abschnitt: Eine weitere Technofunktionalität von Interesse ist die Bindung verschiedener Strukturelemente, z. B. in Fleischalternativen. Dazu muss das Bindemittel i.) klebrig sein, um heterogene Komponente zusammenzukleben, und ii.) in der Lage sein, sich bei der Weiterverarbeitung leicht zu verfestigen, um dadurch eine kohärente Matrix zu gewährleisten. In Kapitel IV wurde der Einfluss des pH-Wertes (3,50, 4,75, 6,00) und der Biopolymerkonzentration (17,5-50,0% w/w) auf die Klebrigkeit einer Mischung aus Erbsenproteinisolat und Apfelpektin (Mischungsverhältnis r = 6:1) untersucht. Es wurde festgestellt, dass Biopolymerkonzentrationen von 17,5-20,0% w/w zu einer geringen Klebrigkeit aufgrund geringer Kohäsion (Adhäsionsarbeit 0,29-0,51 mJ) fĂĽhrten. Bei hohen Biopolymerkonzentrationen von 40-50% w/w waren die Biopolymermischungen ebenfalls nicht klebrig, da die Adhäsion gering war (Adhäsionsarbeit 0,02-0,05 mJ). Bei mittleren Konzentrationen von 25-30% w/w herrschte ein gutes Gleichgewicht zwischen Adhäsion und Kohäsion, wodurch eine hohe Klebrigkeit (Adhäsionsarbeit 0,48-0,65 mJ) ermöglichte wurde, was sich auch im viskoelastischen Verhalten (G ≈ G) widergespiegelte. Bei mittleren Konzentrationen waren die Mischungen bei pH 6 klebriger, was auf eine verstärkte Quellung der Erbsenproteine zurĂĽckzufĂĽhren war. Die Bedeutung der Viskoelastizität fĂĽr die Klebrigkeit von Biopolymermischungen wurde in Kapitel V bestätigt, indem Erbsenproteinisolat und Apfelpektin (25% w/w, pH 6) in verschiedenen Mischverhältnissen r gemischt wurden. Mischungen aus Erbsenprotein und Apfelpektin und insbesondere die Probe mit r = 2:1 besaĂźen eine hohe Klebrigkeit aufgrund der Entwicklung eines Mehrphasensystems, das ein gutes Gleichgewicht von Adhäsion und Kohäsion mit deutlicher Frequenzabhängigkeit ermöglichte. Erbsenprotein allein (r = 1:0, c = 25% w/w) hatte eine elastische, aber weiche Textur mit geringer Klebrigkeit aufgrund begrenzter viskoser Eigenschaften, während eine Probe, die nur aus Apfelpektin bestand (r = 0:1, c = 25% w/w), aufgrund ihrer hohen Kohäsion und Steifigkeit ebenfalls nicht klebrig war. Die Ergebnisse von Kapitel VI zeigten, dass die Homogenisierung von Erbsenprotein vor dem Mischen mit Apfelpektin zu kleineren Proteinpartikeln in der Mischung fĂĽhrte, die zu einer höheren Kohäsion beitrugen. Interessanterweise fĂĽhrten vakuumgetrocknete Erbsenproteine zu einer höheren Netzwerkfestigkeit, da diese Trocknungsmethode im Vergleich zur Gefriertrocknung die Reaggregation kleiner Proteinpartikel eher verhinderte. Insgesamt war die Mischung mit homogenisierten und vakuumgetrockneten Erbsenproteinen fast doppelt so klebrig wie die Mischung mit unbehandelten Erbsenproteinen. In Kapitel VII wurden klebrige Mischungen aus verschiedenen Erbsenproteinpräparaten (lösliche, homogenisierte und nicht homogenisierte Erbsenproteine) und Pektin (25% w/w, pH 6, r = 2:1) auf ihre Verfestigungsfähigkeit durch verschiedenen Behandlungen, nämlich Erhitzen sowie Zugabe von Transglutaminase, Laccase, Calcium und Kombinationen daraus, geprĂĽft. Es wurde festgestellt, dass Calcium die Vernetzung der Pektinketten fördert und so die Verfestigung der Mischungen bewirkt. So stieg beispielsweise der Konsistenzkoeffizient K bei Mischungen aus Erbsenproteinisolat und Apfelpektin von 2800 ± 1000 Pasn auf etwa 19000 Pasn, wenn Calcium zugesetzt wurde. Wärmebehandlung und Transglutaminase fĂĽhrten nicht zu einer Verfestigung, was darauf hindeutet, dass das Pektin die kontinuierliche Phase bildet. DarĂĽber hinaus fĂĽhrte Laccase zum höchsten Verfestigungsgrad, wenn ZuckerrĂĽbenpektin verwendet wurde (K > 30000 Pasn), was auf die Vernetzung von Ferulasäure und Erbsenprotein-Tyrosin zurĂĽckzufĂĽhren ist. Folglich wurde die klebrige Mischung aus Erbsenprotein und ZuckerrĂĽbenpektin (25% w/w, pH 6, r = 2:1) mit dem Zusatz von Laccase zur Verfestigung als das am besten geeignete Bindemittel fĂĽr ein bacon-ähnliches Fleischersatzprodukt ermittelt und in Kapitel VIII untersucht. Dieses Bindemittel wies bei 25 °C die höchste Bindungsstärke (Arbeit 2,0-4,3 mJ) zwischen texturierten Protein- und Fettimitatschichten sowie Schichten des gleichen Materials auf, was auf die Bildung kovalenter Bindungen durch Laccase innerhalb des Bindemittels und zwischen dem Bindemittel und den Adhärenten zurĂĽckzufĂĽhren ist. Eine Kontrollprobe ohne Laccase-Zusatz hatte geringere Bindungseigenschaften (Arbeit 0,7-1,0 mJ), und die Bindungsstärke eines Methylcellulose-Hydrogels (6% w/w), das als Referenz diente, war nur zwischen zwei Fettimitatschichten bei 70 °C höher (Arbeit 1,8 ± 1,1 mJ), was auf erhöhte hydrophobe Kräfte zurĂĽckzufĂĽhren ist. SchlieĂźlich wurde das Bindemittel aus Erbsenprotein und ZuckerrĂĽbenpektin (22,5% w/w, pH 6, r = 2:1) in Fleischersatzprodukten vom Typ Burger-Patty getestet, um texturiertes pflanzliches Protein und Fettpartikel zusammenzukleben (Kapitel IX). Das Bindemittelsystem hatte keinen Einfluss auf die Härte der Burger-Patties, was darauf hindeutet, dass diese Eigenschaft von den Strukturelementen und nicht vom Bindemittel bestimmt wird. Die sensorische Analyse ergab jedoch, dass die Kohäsion bei Verwendung des Bindemittels aus Erbsenprotein und ZuckerrĂĽbenpektin besser war (-0,7 ± 0,2) als bei Verwendung von Methylcellulose (-2,9 ± 0,3). Dies wurde auf den klebrigen Charakter der Biopolymermischung zurĂĽckgefĂĽhrt, der eine bessere Bindung der verschiedenen Strukturelemente ermöglichte. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass dieses neuartige Bindemittel auf Basis pflanzlicher Inhaltsstoffe in verschiedenen Fleischalternativen eingesetzt werden kann. SchlieĂźlich wurde in Kapitel X die Funktionalität und der Bindungsmechanismus von derzeit in Lebensmitteln verwendeten Bindemittel aufgezeigt und resĂĽmiert, dass Klebrigkeit, Aushärtung/Verfestigung und Wasserhaltevermögen von groĂźer Bedeutung sind. In vielen Lebensmitteln geht das Bindemittel von einem klebrigen Lebensmittelkleber zu einer festen Matrix ĂĽber, was durch verschiedene Prozessschritte ausgelöst wird, die von den Eigenschaften des verwendeten Bindemittels abhängen. Aus den vorgestellten Ergebnissen lässt sich schlieĂźen, dass Erbsenproteine nĂĽtzliche funktionelle Inhaltsstoffe in verschiedenen Anwendungsszenarien sind. Die gewĂĽnschte Technofunktionalität kann durch verschiedene Prozessschritte wie Fraktionierung, Homogenisierung oder durch Mischen mit anderen pflanzlichen Inhaltsstoffen verbessert werden. HierfĂĽr sind Kenntnisse ĂĽber die Struktur-Funktions-Beziehung und andere Einflussfaktoren erforderlich. In einigen Fällen - wie z. B. bei Bindemitteln - mĂĽssen die Prozessabläufe gu

    A highly virulent variant of HIV-1 circulating in the Netherlands

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    We discovered a highly virulent variant of subtype-B HIV-1 in the Netherlands. One hundred nine individuals with this variant had a 0.54 to 0.74 log10 increase (i.e., a ~3.5-fold to 5.5-fold increase) in viral load compared with, and exhibited CD4 cell decline twice as fast as, 6604 individuals with other subtype-B strains. Without treatment, advanced HIV-CD4 cell counts below 350 cells per cubic millimeter, with long-term clinical consequences-is expected to be reached, on average, 9 months after diagnosis for individuals in their thirties with this variant. Age, sex, suspected mode of transmission, and place of birth for the aforementioned 109 individuals were typical for HIV-positive people in the Netherlands, which suggests that the increased virulence is attributable to the viral strain. Genetic sequence analysis suggests that this variant arose in the 1990s from de novo mutation, not recombination, with increased transmissibility and an unfamiliar molecular mechanism of virulence