NANOTUBOS DE CARBONO COMO UNA ALTERNATIVA PARA LA TRANSFECCIÓN DE OVOCITOS MADUROS DE Bos taurus

La introducción de material genético dentro de células animales tiene múltiples ventajas en el área farmacéutica y otras áreas de interés económico, como la agrícola y la pecuaria. Las técnicas de transfección existentes, sobre todo aquellas basadas en el uso de agentes lipofectantes, no son exitosas en ovocitos y cigotos debido a que la zona pelúcida que los recubre impide la penetración del material genético. Otras, como la microinyección, demandan el uso de equipos altamente costosos y especializados. Por esta razón este proyecto propone el uso de nanotubos de carbono (NTC) funcionalizados con ADN como un sistema de transfección de células. Debido a que no se sabe si los NTC son capaces de atravesar la zona pelúcida, el objetivo del presente trabajo es evaluar la internalización de los NTC funcionalizados con diacetato de fluoresceína en ovocitos maduros de Bos taurus mediante microscopía confocal. Para esto NTC fueron sintetizados, purificados y funcionalizados con diacetato de fluoresceína. En los estudios de internalización los ovocitos obtenidos de ovarios de vacas sacrificadas fueron madurados in vitro y separados en dos grupos, un grupo control (sin interacción con NTC) y un grupo interaccionado con NTC funcionalizados con diacetato de fluoresceína (1 mg/ml) por 30 min. Terminado el tiempo los ovocitos de ambos grupos fueron fijados y permeabilizados con paraformaldehído al 4% amortiguado y PBS-Tritón 0.2% respectivamente. Los núcleos de las células fueron teñidos con DAPI y analizados mediante microscopía confocal. Los resultados muestran que los NTC utilizados tienen un tamaño de 1.8 μm longitud y 40-70 nm de diámetro y presentaron una efectiva funcionalización con el fluorocromo. Los estudios de internalización indican la presencia de los NTC en la zona nuclear y en el citoplasma de las células. Estos resultados nos permiten concluir que los NTC pueden atravesar la zona pelúcida de los ovocitos maduros, convirtiéndose en excelentes candidatos para ser utilizados como vectores para la transfección de genes

Robust estimation of bacterial cell count from optical density

Optical density (OD) is widely used to estimate the density of cells in liquid culture, but cannot be compared between instruments without a standardized calibration protocol and is challenging to relate to actual cell count. We address this with an interlaboratory study comparing three simple, low-cost, and highly accessible OD calibration protocols across 244 laboratories, applied to eight strains of constitutive GFP-expressing E. coli. Based on our results, we recommend calibrating OD to estimated cell count using serial dilution of silica microspheres, which produces highly precise calibration (95.5% of residuals <1.2-fold), is easily assessed for quality control, also assesses instrument effective linear range, and can be combined with fluorescence calibration to obtain units of Molecules of Equivalent Fluorescein (MEFL) per cell, allowing direct comparison and data fusion with flow cytometry measurements: in our study, fluorescence per cell measurements showed only a 1.07-fold mean difference between plate reader and flow cytometry data

Author Correction: Robust estimation of bacterial cell count from optical density

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Robust estimation of bacterial cell count from optical density

AbstractOptical density (OD) is widely used to estimate the density of cells in liquid culture, but cannot be compared between instruments without a standardized calibration protocol and is challenging to relate to actual cell count. We address this with an interlaboratory study comparing three simple, low-cost, and highly accessible OD calibration protocols across 244 laboratories, applied to eight strains of constitutive GFP-expressing E. coli. Based on our results, we recommend calibrating OD to estimated cell count using serial dilution of silica microspheres, which produces highly precise calibration (95.5% of residuals  &lt;1.2-fold), is easily assessed for quality control, also assesses instrument effective linear range, and can be combined with fluorescence calibration to obtain units of Molecules of Equivalent Fluorescein (MEFL) per cell, allowing direct comparison and data fusion with flow cytometry measurements: in our study, fluorescence per cell measurements showed only a 1.07-fold mean difference between plate reader and flow cytometry data.</jats:p