2 research outputs found

    Termite nests as an abundant source of cultivable actinobacteria for biotechnological purposes

    Get PDF
    A total of 118 actinobacterial isolates were collected from the three types of termite nests (mound, carton, and subterranean nests) to evaluate their potential as a source of bioactive actinobacteria with antimicrobial activity. The highest number (67 isolates) and generic abundance (7 known genera) of actinobacterial isolates were obtained from carton nests. Streptomyces was the dominant genus in each type of termite nest. In the non-Streptomyces group, Nocardia was the dominant genus detected in mound and carton nests, while Pseudonocardia was the dominant genus in subterranean nests. A discovery trend of novel species (<99% similarity in the 16S rRNA gene sequence) was also observed in the termite nests examined. Each type of termite nest housed >20% of bioactive actinobacteria that could inhibit the growth of at least one test organism, while 12 isolates, belonging to the genera Streptomyces, Amycolatopsis, Pseudonocardia, Micromonospora and Nocardia, exhibited distinct antimicrobial activities. Streptomyces sp. CMU-NKS-3 was the most distinct bioactive isolate. It was closely related to S. padanus MITKK-103T, which was confirmed by 99% similarities in their 16S rRNA gene sequences. The highest level of extracellular antimicrobial substances was produced by the isolate CMU-NKS-3, which was grown in potato dextrose broth and exhibited a wide range (6.10×10−4–1.25 mg mL−1) of minimum inhibitory concentrations against diverse pathogens. We concluded that termite nests are an abundant source of bioactive strains of cultivable actinobacteria for future biotechnological needs

    Mechanism of transcriptional regulation by HNF-4 and HNF-1

    Get PDF
    My studies were focused on different mechanistic aspects of tissue specific gene regulation by HNF-1 and HNF-4. HNF-4 and HNF-1 (Hepatic Nuclear Factor 4 and 1) are liver-enriched transcription factors which regulate genes that play important roles in various metabolic pathways in the adult liner. In humans , heterozygous mutations in the HNF-4 and HNF-1 genes are associated with an early onset form of type II diabetes called Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY I and III, respectively), also proving the importance of these factors in pancreatic b-cell function. First, in an effort to explore the functional importance of the interaction between HNF-4 and the known coactivator CBP, which possesses histone acetyltransferase activity, we found that CBP acytylates HNF-4 DNA-binding activity and its affinity of interaction observation with CBP itself and is required for target gene activation. The most interesting observation of this work is that this modification is crucial for the proper nuclear retention of HNF-4, which binds referentially to non-acetylated HNF-4. The results of this study suggest that acetylation is a key posttranslational modification that affects several properties of HNF-4 critical for its biological functions. Secondly, while studying the molecular mechanism involved in HNF-1-dependent gene activation, we found that HNF-1 can physically interact with the histone acetyltransferases (HATs) CBP, P/CAF, SRC1 and RAC3 and that the synergistic action between these co-activators enhances HNF-1-dependent transcriptional activation. Our studies were mainly focused on the synergium observed between the more robust HATs CBP and P/CAF, which can independently interact with the N-terminal and the C-terminal domain of HNF-1, respectively. The transcriptional activation potential of HNF-1 on a genome integrated promoter was strictly dependent on the synergistic action of CBP and P/Caf and requirement for P/CAF HAT activity for HNF-1-dependent activation from a transiently transfected reporter. Employing in vitro assays, we found that the interaction of CBP with the N-terminal domain of HNF-1 greatly increased the binding affinity of P/CAF for the C-terminal activation domain, which provides a potential mechanism for the observed functional synergism. These results support a model which involves the combined action of multiple co-activator recruited by HNF-1 to activate transcription by coupling nucleosome modification and recruitment of the general transcription machinery. Thirdly, exploring the mechanism behind the impaired transactivation potential of two dominant-negative mutants of HNF-1 (P447L), occurring in maturity onset diabetes of the young (MODY3) patients, we found that they paradoxically exhibit stronger interactions with either CBP or P/CAF than the wild type protein both in vivo and in vitro. Further in vivo studies showed that the dominant-negative effect of MODY3 mutants is not due to a preferential recruitment of the corepressor NCOR or the deacetylase protein HDAC1, but not the MODY3 mutants, stimulated the HAT activity of CBP in vitro. Other transcription factors such as Sp! And HNF-4 also stimulated the HAT activity of CBP, demonstrating a more dynamic role for DNA-binding proteins in the transcription process. They are not only required for the recruitment of coactivators to the promoter, but they may also modulate their enzymatic activity. Finally, in order to explore the role/involvement of the HNF4 and HNF-1 preinitiation complex assembly and chromatin remodeling processes in a natural target gene, we analyzed the order of recruitment of factors to the alpha-1-antitrypin (a1-AT) promoter upon the initial activation of the gene during enterocyte differentiation. We found that a complete preinitiation complex, including the HNF-1 and HNF-4 transcription factors, componets of TFIID, TFIIH and the mediator complex, as well as, phosphorylated RNA pol-II, waw assembled at the promoter long before transcriptional activation. The histone acetyltransferases CBP and P/CAF were recruited subsequently, but local histone hyperacetylation was delayed. After transient recruitment of hBrm, remodeling of the neighboring nucleosome coincided with transcription initiation. The results suggest that at this promoter chromatin reconfiguration is a defining step of the initiation process, acting after the assembly of the Pol II machinery.Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη του μηχανισμού μεταγραφικής ενεργοποίησης από τους παράγοντες HNF-4 και HNF-1. Οι HNF-4 και HNF-1 είναι ηπατοειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν γονίδια που παίζουν ρόλο σε ποικίλα μεταβολικά μονοπάτια στο ενήλικο ήπαρ. Στον άνθρωπο ετερόζυγες μεταλλαγές στα γονίδια HNF-4 και HNF-1 έχουν συνδεθεί με την μορφή του νεανικού διαβήτη τύπου ΙΙ που ονομάζεται MODY (MODY Ι και ΙΙ αντίστοιχα), αποδεικνύοντας την σημασία των παραγόντων αυτών στη λειτουργία των β-κυττάρων του παγκρέατος. Η εργασία αυτή χωρίζεται σε τρία μέρη. Στο πρώτο μέρος μελετάται η λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης του HNF-4 με τον συνενεργοποιητή CBP που έχει ενεργότητα ακετυλοτρανσφεράσης των ιστονών. Στη εργασία αυτή δείχθηκε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας HNF-4 ακετυλιώνεται από τον συνενεργοποιητή CBP σε αμινοξικά κατάλοιπα (λυσίνες) που εντοπίζονται στην περιοχή που είναι υπεύθυνη για την είσοδο του παράγοντα στον πυρήνα του κυττάρου (NLS).In vitro πειράματα και πειράματα παροδικής διαμόλυνσης έδειξαν ότι η μετα-μεταφραστική αυτή τροποποίηση αυξάνει την ικανότητα πρόσδεσης του HNF-4 στο DNA και την συγγένεια της αλληλεπίδρασης με τον ίδιο τον συνεργοποιητή CBP και είναι απαραίτητη για την μεταγραφική ενεργότητα του HNF-4. Η πιο ενδιαφέρουσα παρατήρηση της εργασίας αυτής είναι ότι η ακετυλίωση του HNF-4 είναι πολύ σημαντική για την συγκράτηση του παράγοντα στον πυρήναα του κυττάρου. Από τα πειράματα είναι φανερό ότι όταν ο παράγοντας δεν είναι ακετυλιωμένος εξέρχεται από τον πυρήνα του κυττάρου στο κυτταρόπλασμα μέσω της πρωτεΐνης CRM1 που αλληλεπιδρά με μεγαλύτερη συγγένεια με την μη-ακετυλιωμένη μορφή του HNF-4. Τα αποτελέσματα αυτής της εργασίοας προτείνουν ότι η ακετυλίωση είναι μια σημαντική μετα-μεταφραστική τροποποίηση που επηρεάζει πολλές ιδιότητες του μεταγραφικού παράγοντα HNF-4, σημαντικές για την δράση του. Στο δεύτερο κομμάτι της εργασίας μελετάται ο μηχανισμός με τον οποίο ο παράγοντας HNF-1 ενεργοποιεί την μεταγραφή. Πιο συγκεκριμένα , βρέθηκε ότι ο HNF-1 αλληλεπιδρά in vivo και in vitro με τις ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών CBP, P/CAF, SRC-1 και RAC3 και ότι η συνεργιστική δράση των συνενεργοποιητών αυτών αυξάνει την HNF-1 εξαρτώμενη μεταγραφική ενεργοποίηση. Πιο λεπτομερής μελέτη έδειξε ότι ο παράγοντας CBP προσδένεται στο αμινοτελικό άκρο του HNF-1 που αντιστοιχεί στην περιοχή με την οποία προσδένεται στο DNA, ενώ οι άλλοι τρεις στην καρβοξυτελική περιοχή που είναι υπεύθυνη για την ενεργοποιητική του δράση (Activation domain). Η μελέτη εστιάστηκε περισσότερο στην συνέργια που παρατηρήθηκε μεταξύ των συνενεργοποιητών CBP και P/CAF. Η μεταγραφική ενεργότητα του HNF-1 σε υποκινητή που έχει εντεθεί στο γένωμα των κυττάρων φαίνεται ότι εξαρτάται αυστηρά από την συνεργιστική δράση των δύο παραπάνω συνενεργοποιητών και απαιτεί τις HAT ενζυμικές ενεργότητες και των δύο σε αντίθεση με την επιλεκτική απαίτηση της HAT του P/CAF για την HNF-1-εξαρτώμενη μεταγραφική ενεργοποίηση παροδικά διαμολυσμένου γονιδίου αναφοράς. Με in vitro πειράματα δείχθηκε ότι η πρόσδεση του CBP στο αμινοτελικό τμήμα του HNF-1 αυξάνει την συγγένεια πρόσδεσης του P/CAF στο καρβοξυτελικό γεγονός που παρέχει μία πιθανή εξήγηση για την παρατηρούμενη συνέργια μεταξύ των δύο συνενεργοποιητών. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο ο HNF-1 ενεργοποιεί την μεταγραφή στρατολογώντας διαφορετικούς συνενεργοποιητές οι οποίοι συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και διευκολύνουν πιθανότατα την μετέπειτα στρατολόγηση της γενικής μεταγραφικής μηχανής. Μελετώντας στη συνέχεια τον μηχανισμό έλλειψης μεταγραφικής ενεργότητας δύο φυσικών μεταλλαγών του HNF-1 των P519L και P447L που έχουν βρεθεί σε ασθενείς με νεανικό διαβήτη (MODY III), παρατηρήθηκε ότι οι μεταλλαγές αυτές αλληλεπιδρούν με μεγαλύτερη συγγένεια και με τους δύο συνενεργοποιητές CBP και P/CAF σε σύγκριση με την πρωτεΪνη αγρίου τύπου. Πιο λεπτομερής μελέτη έδειξε ότι η έλλειψη της μεταγραφικής ενεργότητας των μεταλλαγών αυτών δεν οφείλεται σε επιλεκτική αλληλεπίδραση τους με τον συγκαταστολέα NcoR ή την απακετυλάση HDAC1 αλλά οι συνενεργοποιητές CBP και P/CAF όταν βρίσκονται σε σύμπλοκο με τις μεταλλαγές εμφανίζουν μειωμένη HAT ενζυμική ενεργότητα. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι η πρωτεΐνη αγρίου τύπου - και όχι οι μεταλλαγές - αυξάνει την ΗΑΤ ενζυμική ενεργότητα του CBP in vitro. Στη συνέχεια δείχθηκε ότι και άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες όπως Sp1 και HNF-4 επάγουν την ενζυμική ενεργότητα του CBP. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών προσδίδουν στους μεταγραφικούς παράγοντες ένα πιο δυναμικό ρόλο στην διαδικασία της μεταγραφικής ενεργοποίησης. Δεν απαιτούνται μόνο για την στρατολόγηση συνενεργοποιητών στους υποκινητές αλλά φαίνεται πως τροποποιούν και την ενζυμική τους ενεργότητα. Στο τρίτο κομμάτι της εργασίας μελετάται ο ρόλος των HNF-4 και HNF-1 στις διαδικασίες συγκρότησης του προενακτήριου συμπλόκου και αναδιαμόρφωσης της χρωματινικής δομής στον υποκινητή φυσικού γονιδίου-στόχου τους. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε η σειρά στρατολόγησης των παραγόντων στον υποκινητή του γονιδίου της α1-αντιτρυψίνης κατά την ενεργοποίηση του στη διάρκεια της διαφοροποίησης των εντερικής προέλευσης CaCo2 κυττάρων. Η μελέτη αυτή έδειξε ότι ένα ολοκληρωμένο προενακτήριο σύμπλοκο που περιλαμβάνει τους δύο ενεργοποιητές HNF-4 και HNF-1, συστατικά του TFIID, τον γενικό μεταγραφικό παράγοντα TFIIH, το σύμπλοκο των διαμεσολαβητών, καθώς και την φωσφορυλιωμένη μορφή της ΡΝΑ ΙΙ πολυμεράσης συγκροτείται στον συγκεκριμένο υποκινητή πολύ πριν από την χρονική στιγμή της μεταγραφιής έναρξης. Ακολουθεί η στρατολόγηση των ακετυλοτρανσφερασών CBP και P/CAF ενώ η παρατηρούμενη υπερακετυλίωση της ιστόνης H3 δεν συνοδεύει άμεσα την παραπάνω διαδικασία. Τέλος η παροδική στρατολόγηση του παράγοντα hBrm και η αναδιαμόρφωση του νουκλεοσώματος που καλύπτει το σημείο έναρξης της μεταγραφής συμπίπτουν με την χρονική στιγμή μεταγραφικής έναρξης. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η αναδιαμόρφωση της χρωματίνης στον υποκινητή του γονιδίου της α1-αντιτρυψίνης είναι το τελευταίο καθοριστικό βήμα στη διαδικασία έναρξης της μεταγραφής μετά από την συγκρότηση του προενακτήριου συμπλόκου
    corecore