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    Editing of the ADORA2A gene by CRISPR/Cas9

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    Tese de mestrado, Neuroci√™ncias, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021A percentagem de popula√ß√£o envelhecida, a n√≠vel mundial, tem vindo a aumentar progressivamente, o que, por seu turno, est√° associado a um aumento das doen√ßas ligadas ao envelhecimento como as doen√ßas cardiovasculares e neurodegenerativas . O envelhecimento, afeta as c√©lulas de todo o sistema nervoso, causando um decl√≠nio das fun√ß√Ķes sensitivas e cognitivas sendo o principal fator de risco de Doen√ßa de Alzheimer (DA), que √© a forma mais comum de dem√™ncia . Entre as estruturas cerebrais, aquelas envolvidas na mem√≥ria, como o hipocampo, parecem ser particularmente vulner√°veis √† senesc√™ncia e degenera√ß√£o. A DA √© caracterizada por defici√™ncias cognitivas progressivas que comprometem progressivamente a mem√≥ria e aprendizagem e, eventualmente, a capacidade de realizar as tarefas mais simples. Patologicamente, esta doen√ßa √© caracterizada : i. pela forma√ß√£o sequencial de placas senis (ou neur√≠ticas) extracelulares que resultam da acumula√ß√£o do p√©ptido ő≤-amil√≥ide (Aő≤); ii. Tran√ßas neurofibrilares intracelulares formadas por filamentos de prote√≠na tau hiperfosforilada; iii. Perda sin√°ptica e neuronal seletiva, no hipocampo e c√≥rtex cerebral, respons√°vel pela atrofia cerebral; iv. gliose, resultante da ativa√ß√£o e prolifera√ß√£o de c√©lulas da microglia e de astr√≥citos. No entanto, os mecanismos pelos quais a patologia da DA afeta a neurog√©nese n√£o est√£o completamente compreendidos. A agrega√ß√£o e a acumula√ß√£o de p√©ptidos Aő≤ e prote√≠nas tau, inflama√ß√£o, altera√ß√Ķes gen√©ticas nas vias e genes relacionados com a neurog√©nese podem prejudicar a matura√ß√£o de neur√≥nios rec√©m-nascidos e inibir a neurog√©nese do hipocampo, com poss√≠vel impacto na atrofia do hipocampo . Contudo, at√© √† data, nenhum estudo verificou uma associa√ß√£o entre genes relacionados com a neurog√©nese e o volume do hipocampo. Foi recentemente descrita uma associa√ß√£o entre um polimorfismo do gene que codifica o recetor de adenosina de subtipo A2A (A2AR) ‚Äď ADORA2A ‚Äď com a mem√≥ria epis√≥dica, volume do hipocampo e a tau total no l√≠quido cefalorraquidiano em pacientes com D√©fice Cognitivo Ligeiro e com DA, sugerindo que esta variante gen√©tica pode afetar a produ√ß√£o de A2AR. A adenosina, metabolito presente em todos os subtipos celulares, tem o papel de neuromodulador que influencia a atividade neuronal a diversos n√≠veis, mas tamb√©m o papel de cotransmissor ou mesmo neurotransmissor . √Č, portanto, uma mol√©cula sinalizadora extracelular que afeta a transmiss√£o sin√°ptica . Uma vez ligada a recetores acoplados √† prote√≠na G, tem a capacidade de atuar a n√≠vel pr√©- e p√≥s-sin√°ptico, inibindo ou facilitando a liberta√ß√£o de neurotransmissores e, afetando a a√ß√£o de recetores, respetivamente . Os sensores de adenosina ‚Äď recetores de adenosina ‚Äď s√£o muito mais abundantes no c√©rebro do que em qualquer outro √≥rg√£o ou tipo celular, em mam√≠feros . S√£o recetores acoplados √† prote√≠na G, e dividem-se nos subtipos A1, A2A, A2B e A3, embora sejam principalmente os recetores A1 (A1R) e A2A (A2AR), os respons√°veis pelos efeitos da adenosina no c√©rebro . Os A1R s√£o os mais abundantes e amplamente distribu√≠dos, sendo respons√°veis pela diminui√ß√£o da liberta√ß√£o de glutamato, tendo, portanto um papel neuroprotetor. Por seu turno, os A2AR s√£o mais abundantes nos g√Ęnglios basais e nas sinapses, sendo considerados recetores excitat√≥rios, na medida em que facilitam a liberta√ß√£o de neurotransmissores Durante o processo de envelhecimento h√° um aumento da express√£o dos A2AR nas zonas corticais, estando este associado ao aumento dos d√©fices cognitivos. Apesar da baixa express√£o e densidade desses recetores no hipocampo, em condi√ß√Ķes fisiol√≥gicas, os A2AR regulam a fun√ß√£o metabotr√≥pica, ionotr√≥pica e catal√≠tica de recetores de outros sistemas modulat√≥rios. Assim, os A2AR t√™m um papel importante na modula√ß√£o da transmiss√£o sin√°ptica, no hipocampo, portanto, na presen√ßa de danos sin√°pticos e cognitivos, presentes na popula√ß√£o envelhecida e nos doentes com DA. Um ‚Äúsingle nucleotide polymorphism‚ÄĚ (SNP) ‚Äď rs9608282-T ‚Äď a montante do gene ADORA2A foi associado a um maior volume do hipocampo e a um melhor desempenho da mem√≥ria4 , sugerindo que este SNP possa ter um efeito protetor sobre a estrutura e fun√ß√£o do c√©rebro. Rs9608282-T est√° localizado a montante do gene ADORA2A, numa regi√£o caracterizada pelo read-through de dois genes vizinhos, SPECC1L (‚Äúsperm antigen with calponin homology and coiled-coil domains 1-like‚ÄĚ) e ADORA2A (‚Äúadenosina A2A receptor‚ÄĚ) no cromossoma 22. Este read-through √© um forte candidato para o decaimento mediado por mRNA nonsense, levando, assim, √† n√£o produ√ß√£o de prote√≠na. Tendo em conta estudos anteriores, em modelos animais, em que tanto a dele√ß√£o e/ou a inibi√ß√£o de A2AR levam √† melhoria da mem√≥ria espacial e ao aumento da plasticidade sin√°ptica, pretendemos, ent√£o, com este trabalho, explorar a hip√≥tese de que a varia√ß√£o rs9608282-T est√° associada √† inibi√ß√£o da produ√ß√£o de prote√≠na A2AR. Contrariamente aos neur√≥nios, as linhas celulares s√£o capazes de realizar a recombina√ß√£o hom√≥loga, essencial para a edi√ß√£o gen√≥mica, por serem mitoticamente ativas. Deste modo, a primeira fase deste trabalho consistiu em verificar se ambas as linhas celulares, c√©lulas H4 e c√©lulas U2OS, eram um bom modelo para o estudo do impacto deste SNP. Primeiramente, avaliou-se se ambas as linhas celulares expressavam n√≠veis detet√°veis de mRNA e prote√≠na A2AR por recurso √†s t√©cnicas de biologia molecular qPCR e Western Blotting. Por √ļltimo, procedeu-se √† caracteriza√ß√£o das linhas celulares H4 e U2OS pelo m√©todo de Sanger Sequencing. A segunda fase deste trabalho consistiu na indu√ß√£o do SNP descrito com recurso √† edi√ß√£o gen√≥mica CRISPR/Cas9. Este m√©todo usa um RNA guia (gRNA) complementar √† sequ√™ncia de DNA alvo, acoplado a uma endonuclease ‚Äď Cas9 ‚Äď, a qual induz quebras na cadeia dupla (DSB) de DNA, nessa sequ√™ncia alvo. O DNA √© reparado por recombina√ß√£o hom√≥loga (HDR), quando na presen√ßa de uma mol√©cula de DNA dador com regi√Ķes de homologia correspondentes √†s sequ√™ncias a montante e a jusante do local de corte da Cas9. Deste modo, desenhou-se o gRNA, que flanqueia a regi√£o a ser modificada, e os dois oligonucle√≥tidos (WT e SNP-) que funcionam como template do DNA dador. Por sua vez, as c√©lulas H4 e as c√©lulas U2OS foram transfetadas com o plasm√≠deo, que contem o gRNA, e com os DNA dadores. De seguida, os mutantes gerados (WT e SNP) em cada linha celular foram validados por PCR e caracterizados pelo m√©todo de Sanger Sequencing. A partir dos resultados obtidos, conseguimos validar os modelos in vitro ‚Äď linha celular H4 e linha celular U2OS ‚Äď, uma vez que ambas as linhas celulares mostraram expressar n√≠veis detet√°veis de mRNA e prote√≠na A2AR e, tamb√©m mostraram ser wild-type, n√£o apresentando o polimorfismo em estudo. Aquando da edi√ß√£o gen√≥mica por CRISPR/Cas9 de ambas as linhas celulares, foi poss√≠vel verificar que o gRNA foi capaz de induzir DSB, no local pretendido. Os mutantes gerados (WT e SNP) em cada linha celular foram caracterizados, contudo, n√£o foi poss√≠vel gerar um clone positivo (com o SNP) nos clones que analisamos at√© √† data. Com este trabalho, foi poss√≠vel otimizar a t√©cnica de edi√ß√£o gen√≥mica por CRISPR/Cas9 nas duas linhas celulares utilizadas como modelo de estudo, implementando uma nova t√©cnica no laborat√≥rio. Contudo, mais clones precisam de ser rastreados de forma a permitir uma melhor caracteriza√ß√£o, aumentando, assim, a probabilidade de se conseguir um clone positivo para a condi√ß√£o SNP. Deste modo, permite-se um melhor estudo da repara√ß√£o do corte pelo DNA dador por processos de recombina√ß√£o hom√≥loga.Ageing is associated with cognitive decline in both humans and animals. Among brain structures, those involved in memory, such as the hippocampus, appear to be particularly vulnerable to senescence and degeneration . Recently, a gene-based association analysis4 identified a single nucleotide polymorphism (SNP) in the gene ADORA2A, encoding for adenosine A2A receptor (A2AR) as significantly associated with hippocampal volume and cognitive deficits. The minor allele of rs9608282 in ADORA2A (rs9608282-T) is linked to larger hippocampal volumes and better memory. This polymorphism occurs in a non-coding region, upstream to the coding sequence and it was just suggested, but not studied, that this protective effect could be due to alterations in A2AR expression. We have shown recently14 that a significant overexpression of A2AR occurs in hippocampal neurons of aged humans, which is aggravated in Alzheimer‚Äôs Disease (AD) patients. A similar profile of A2AR overexpression in rats was viificientevii to drive age-like memory impairments in young animals and to uncover a shift in hippocampal synaptic plasticity. More importantly, the same plasticity shift was observed in memory-impaired APP/camp1 mice modelling AD, which was rescued upon A2AR blockade. In this project, we intended to explore the hypothesis that the above identified SNP inhibits A2AR expression. For that, we genetically manipulated the ADORA2A gene using a bacterial CRISPR-associated protein-9 nuclease (Cas9) from Streptococcus pyogene (CRISPR/Cas9) system for genome editing in two cell lines, human neuroglioma H4 cells (H4 cells) and human viific viificienteviiviima viificiente U2OS cells (U2OS cells), and quantified the output to A2AR expression. Both cell lines express detectable levels of A2AR mRNA and protein, therefore being both possible in vitro models to study the viificiente the rs9608282 SNP. The H4 and U2OS cells were submitted to CRISPR/Cas9-mediated HDR to insert the rs9608282-T SNP. We verified that DSB was induced by the Cas9, but unfortunately the efficiency of HDR might have been very low since we did not catch positive clones for the rs9608282-T SNP in any of the two cell lines. These results need to be further explored, namely by sequencing the remaining clones obtained and analyse the viificiente the SNP in the A2AR protein expression as compared to the WT sequence. This viificientevii shows that viificiente CRISPR/Cas9 with the designed gRNA could successfully create a DSB around the ADORA2A SNP representing an initial step for further attempts to incorporate this SNP to study its impact in A2AR expression
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