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Alteraciones en el efecto ejercido por exosomas de cardiomiocitos humanos bajo condiciones de isquemia
Los exosomas son pequeñas vesículas de membrana secretadas por la mayoría de los tipos de células con un papel importante en la comunicación celular. Para evaluar sus efectos en el contexto de la isquemia cardíaca, se añadieron exosomas aislados de cardiomiocitos humanos cultivados (CM-Exo) expuestos a normoxia (Nx) o hipoxia (Hx) a fibroblastos (Fb) y células endoteliales (EC). Los CM-Exo se caracterizaron mediante microscopía electrónica, análisis nanosight y western blot junto con análisis proteómicos. Los exosomas mostraron una fuerte preferencia por ser internalizados por EC sobre Fb, lo que sugiere un mecanismo de comunicación activo basado en exosomas entre CM y EC en el corazón. No se observaron diferencias entre Nx y Hx CM-Exo en un ensayo de formación de tubo de Matrigel, como un modelo in vitro de la angiogénesis humana. Por el contrario, en un ensayo de curación de heridas con Fb, el cierre de la herida fue más rápido en Fb tratados con Hx CM-Exo que con Nx CM-Exo, lo que sugiere un efecto pro-fibrótico de los Hx CM-Exo. En general, estas observaciones son consistentes con las diferentes cargas de proteínas detectadas por el análisis proteómico en condiciones Nx y Hx y las vías biológicas identificadas. La comunicación paracrina entre CM-Exo, Fb y EC en diferentes condiciones fisiológicas podría explicar la contribución de los CM-Exo a la remodelación cardíaca después de una lesión isquémica.Exosomes are small membrane vesicles secreted by most cell types with an important role in cell-to-cell communication. To test their effects in the context of heart ischemia, exosomes isolated from cultured human cardiomyocytes (CM-Exo) exposed to normoxia (Nx) or hypoxia (Hx) were added to non-CM cells, fibroblasts (Fb) and endothelial cells (EC). CM-Exo were characterized using electron microscopy, nanosight analysis and western blot together with proteomic analysis. Exosomes showed a strong preference to be internalized by EC over Fb, suggesting an active exosome-based communication mechanism between CM and EC in the heart. No differences were observed between Nx and Hx CM-Exo in a Matrigel tube-formation assay, as an in vitro model of human angiogenesis. By contrast, in a Fb wound-healing assay, wound closure was faster in Fb treated with Hx CM-Exo than with Nx CM-Exo, supporting a pro-fibrotic effect of Hx CMExo. Overall, these observations were consistent with the different protein cargoes detected by proteomic analysis under Nx and Hx conditions and the biological pathways identified. The paracrine crosstalk between CM-Exo, Fb and EC in different physiological conditions could account for the contribution of CM-Exo to cardiac remodeling after ischemic insult.Cardiomiocitos, fibroblastos, células endoteliales, exosomas, hipoxia, comunicación celular.Buigues Caravaca, M. (2018). Alteraciones en el efecto ejercido por exosomas de cardiomiocitos humanos bajo condiciones de isquemia. http://hdl.handle.net/10251/110680TFG
Modificación genética de células estromales mesenquimales para potenciar la eficacia de las vesículas extracelulares en el ámbito de la terapia cardíaca
[ES] La cardiopatía isquémica, caracterizada por la falta de suministro adecuado de oxígeno al tejido cardíaco, es una afección grave que puede desencadenar un infarto agudo de miocardio y contribuir al desarrollo de la insuficiencia cardíaca (IC). A pesar de las terapias actuales, la IC sigue siendo una enfermedad con alta morbilidad y mortalidad, lo que destaca la necesidad de estrategias terapéuticas más efectivas. En este contexto, las células madre mesenquimales (MSCs) y, en especial sus vesículas extracelulares (EVs), han surgido como opciones prometedoras por sus propiedades regenerativas, pro-angiogénicas e inmunomoduladoras. Sin embargo, el reto actual se centra en mejorar la eficacia terapéutica de las EVs, ya sea mejorando su biodisponibilidad en el tejido cardíaco o potenciando sus capacidades intrínsecas, con el fin de hacer viable una terapia basada en las mismas.
En este trabajo, nos hemos centrado en la mejora de las EVs mediante la modificación genética de las MSCs. Hemos seguido dos enfoques: la carga de oncostatina M (OSM) en la superficie de las EVs y la sobreexpresión inducible del dominio intracelular de Notch1 (N1ICD) junto con el factor inducible por hipoxia 1-alfa (HIF1A) en MSCs para enriquecer las EVs con factores terapéuticos, con la expectativa de mejorar su eficacia en el contexto de la isquemia cardíaca.
Los resultados obtenidos muestran que las EVs cargadas con OSM poseen propiedades antifibroticas superiores a las EVs nativas, además de reducir el daño cardíaco provocado por la infusión de isoproterenol in vivo. Por otro lado, la sobreexpresión de N1ICD y HIF1A actúa a modo de precondicionamiento genético favoreciendo la carga de diferentes moléculas terapéuticas en las EVs. Estas EVs han demostrado ejercer efectos beneficiosos in vitro como la reducción de la fibrosis, la protección de los cardiomiocitos y reducción de la hipertrofia, la disminución de especies reactivas de oxígeno, y el aumento de la angiogénesis. En el estudio in vivo estas EVs redujeron el daño provocado por la infusión de isoproterenol.
En conclusión, hemos generado dos tipos de EVs con un potencial terapéutico superior a las EVs nativas en el contexto de la patología cardíaca. Este trabajo abre la puerta al diseño de nuevas estrategias terapéuticas basadas en EVs, abordando de manera integral los diversos aspectos de la enfermedad cardíaca.[CA] La cardiopatia isquèmica, caracteritzada per la falta de subministrament adequat d'oxigen al teixit cardíac, és una afecció greu que pot desencadenar un infart agut de miocardi i contribuir al desenvolupament de la insuficiència cardíaca (IC). Malgrat les teràpies actuals, la IC continua sent una malaltia amb alta morbiditat i mortalitat, la qual cosa destaca la necessitat d'estratègies terapèutiques més efectives. En este context, les cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) i, especialment les seues vesícules extracelul·lars (EVs), han sorgit com a opcions prometedores per les seues propietats regeneratives, pro-angiogèniques i inmunomoduladores. No obstant això, el repte actual se centra en millorar l'eficàcia terapèutica de les EVs, ja siga millorant la seua biodisponibilitat en el teixit cardíac o potenciant les seues capacitats intrínseques, amb la finalitat de fer viable una teràpia basada en estes.
En este treball, ens hem centrat en la millora de les EVs mitjançant la modificació genètica de les MSCs. Hem seguit dos enfocaments: la càrrega d'oncostatina M (OSM) en la superfície de les EVs i la sobreexpressió induïble del domini intracel·lular de Notch1 (N1ICD) juntament amb el factor induïble per hipòxia 1-alfa (HIF1A) en MSCs per a enriquir les EVs amb factors terapèutics, amb l'expectativa de millorar la seua eficàcia en el context de la isquèmia cardíaca.
Els resultats obtinguts mostren que les EVs carregades amb OSM posseeixen propietats antifibròtiques superiors a les EVs natives, a més de reduir el dany cardíac provocat per la infusió d'isoproterenol in vivo. D'altra banda, la sobreexpressió de N1ICD i HIF1A actua a mode de precondicionament genètic afavorint la càrrega de diferents molècules terapèutiques en les EVs. Estes EVs han demostrat exercir efectes beneficiosos in vitro com la reducció de la fibrosi, la protecció dels cardiomiòcits i reducció de la hipertròfia, la disminució d'espècies reactives d'oxigen, i l'augment de l'angiogènesis. En l'estudi in vivo estes EVs van reduir el dany provocat per la infusió d'isoproterenol.
En conclusió, hem generat dos tipus de EVs amb un potencial terapèutic superior a les EVs nadiues en el context de la patologia cardíaca. Este treball obri la porta al disseny de noves estratègies terapèutiques basades en EVs, abordant de manera integral els diversos aspectes de la malaltia cardíaca.[EN] Ischemic heart disease, characterized by a lack of adequate oxygen delivery to the heart tissue, is a serious condition that can trigger acute myocardial infarction and contribute to the development of heart failure (HF). Despite current therapies, HF remains a disease with high morbidity and mortality, highlighting the need for more effective therapeutic strategies. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) and, especially their extracellular vesicles (EVs), have emerged as promising options due to their regenerative, pro-angiogenic and immunomodulatory properties. However, the current challenge focuses on improving the therapeutic efficacy of EVs, either by improving their bioavailability in cardiac tissue or by enhancing their intrinsic capabilities, in order to make a therapy based on them viable.
In this work, we have focused on the improvement of EVs through genetic modification of MSCs. We have followed two approaches: loading of oncostatin M (OSM) on the surface of EVs and inducible overexpression of Notch1 intracellular domain (N1ICD) together with hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1A) in MSCs to enrich EVs with therapeutic factors, with the expectation of improving its effectiveness in the context of cardiac ischemia.
The results obtained show that OSM-loaded EVs have superior antifibrotic properties than native EVs, in addition to reducing cardiac damage caused by isoproterenol infusion in vivo. On the other hand, the overexpression of N1ICD and HIF1A acts as genetic preconditioning, favouring the loading of different therapeutic molecules in EVs. These EVs have been shown to exert beneficial effects in vitro such as reducing fibrosis, protecting cardiomyocytes and reducing hypertrophy, decreasing reactive oxygen species, and increasing angiogenesis. In the in vivo study, these EVs reduced the isoproterenol-induced myocardial damage.
In conclusion, we have generated two types of EVs with a therapeutic potential superior to native EVs in the context of cardiac pathology. This work opens the door to the design of new therapeutic strategies based on EVs, comprehensively addressing the various aspects of heart disease.Buigues Caravaca, M. (2024). Modificación genética de células estromales mesenquimales para potenciar la eficacia de las vesículas extracelulares en el ámbito de la terapia cardíaca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/20440