Die Pim2-Kinase im Hepatozellulären Karzinom: Auswirkungen eines RNA-Interferenz induzierten Pim2-Knockdowns in vitro und in vivo

Liver cancer is the fourth leading cause of cancer-related mortality worldwide with limited therapeutic options. Thus, novel treatment strategies are urgently required. While the oncogenic kinase, proviral integration site for Moloney murine leukemia virus 2 (PIM2), has been shown to be overexpressed in liver cancer, little is known about the role of PIM2 in this tumor entity. In this study, we explored the functional relevance and therapeutic potential of PIM2 in liver cancer. Using PIM2‐specific siRNAs, we examined the effects of PIM2 knockdown on proliferation (WST-1 assays and spheroid assays), 3D-colony formation and colony spread, apoptosis (flow cytometry and caspase 3/caspase 7 activity), as well as cell cycle progression (flow cytometry, RT-qPCR and western blot analysis) in the two liver cancer cell lines, HepG2 and Huh‐7. In subcutaneous liver cancer xenografts, we assessed the effects of PIM2 knockdown on tumor growth via the systemic delivery of polyethylenimine (PEI)-complexed siRNA. The knockdown of PIM2 resulted in potent anti-proliferative effects in cells grown on plastic dishes, as well as in spheroids. This was due to G0/G1 cell cycle blockade and the subsequent downregulation of genes related to the S phase as well as the G2/M phase of the cell cycle, whereas the apoptotic rates remained unaltered. Furthermore, colony formation and colony spread were markedly inhibited by PIM2 knockdown. Notably, we found that HepG2 cells were more sensitive to PIM2 knockdown than the Huh‐7 cells. In vivo, the therapeutic nanoparticle-mediated delivery of PIM2 siRNA led to profound anti-tumor effects in a liver cancer xenograft mouse model. On the whole, the findings of this study underscore the oncogenic role of PIM2 and emphasize the potential of targeted therapies based on the specific inhibition of PIM2 in liver cancer

Altes Target, Neue Hits - Entwicklung von Inhibitoren für die PIM1-Kinase

Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Grundlage unterschiedlicher Vorarbeiten in drei Projekten neue Verbindungen zur Hemmung der PIM1-Kinase synthetisiert und untersucht. Die Betrachtung der Bindungsmodi vielversprechender Kandidaten anhand von Proteinkristallstrukturen erlaubte die gerichtete Weiterentwicklung der entsprechenden Moleküle unter Anwendung von Methoden des rationalen Wirkstoffdesigns. Das Ziel war die Identifizierung neuartiger Bindemotive, um diese für die hit-to-lead-Optimierung zugänglich zu machen und damit Ansatzpunkte für die Entwicklung klinisch nutzbarer PIM1-Inhibitoren zu liefern. Im ersten Projekt sollten Strukturvorschläge aus einem virtual screening-Ansatz synthetisiert werden, für welche trotz intensiver Studien bisher noch keine Syntheseroute etabliert werden konnte. Nach einer erneuten retrosynthetischen Analyse wurde eine Abwandlung der Schlüsselreaktion vorgenommen, sodass schließlich zwei der Strukturvorschläge dargestellt werden konnten. Davon wies Verbindung 2.26 zwar eine mäßige Aktivität (IC50 = 228 µM) gegen das Zielenzym auf, zeigte jedoch gleichzeitig einen sehr gut definierten Bindungsmodus in der Kristallstruktur und wurde daher für die anschließende Optimierung ausgewählt. In der Folge wurden unter Berücksichtigung der beobachteten Bindeposition Vorschläge für eine Verbesserung der Struktur erarbeitet und umgesetzt. Dabei flossen sowohl komparative Analysen bereits publizierter Inhibitoren mit ein, als auch Überlegungen im Rahmen strukturbasierten Wirkstoff¬designs. Es konnte bisher noch keine substanzielle Erhöhung der Affinität erreicht werden, jedoch wurden neue Erkenntnisse über die Bindungseigenschaften des Strukturmotivs gewonnen, welche die zukünftige Entwicklung hochaffiner Derivate unterstützen. Als Startpunkt des zweiten Projektes wurde die Proteinkristallstruktur des Quinoxalin-Fragmentes 3.2 gewählt. Durch einen Kooperationspartner wurde ausgehend von diesem Fragment mit in silico-Methoden eine Reihe von Derivaten generiert und in das Zielenzym gedockt. Nach einer Bewertung der Bindungs¬modi wurden vielversprechende Exemplare synthetisiert und ihre biologische Aktivität getestet. Diese Verbindungen wiesen jedoch keine nennenswerte Aktivität gegen die PIM1-Kinase auf, was Zweifel an der Validität der ursprünglichen Fragment-Kristallstruktur aufwarf. Die erneute röntgenkristallographische Untersuchung des Fragmentes ergab einen zweiten Bindungsmodus, welcher für die Generierung und Bewertung der docking-Ergebnisse nicht berücksichtigt worden war. Um die vermutete Beeinträchtigung der docking-Hypothesen durch den inkonsistenten Bindungs-modus des Fragmentes zu umgehen, wurde stattdessen eine systematische Weiterentwicklung im Rahmen ein SAR angestrebt. Dabei konnte Verbindung 3.37 mit einem IC50-Wert von 89 µM als viel-versprechender Ausgangspunkt für die weitere Optimierung identifiziert werden. Im dritten Projekt wurden Fragment-basierte Strukturvorschläge aus einem virtual screening auf ihre synthetische Umsetzbarkeit hin untersucht und eine Reihe von Zielverbindungen und entsprechender Analoga synthetisiert. Dabei wurde Verbindung 4.70 mit einem IC50-Wert von 26.4 µM als geeigneter Startpunkt für die weitere Optimierung identifiziert. Auf Grundlage der Kristallstruktur von 4.70 im Komplex mit PIM1 wurden verschiedene Strukturklassen abgeleitet, welche die relevanten Strukturmerkmale mit einer einfacheren synthetischen Darstellbarkeit kombinieren sollten. Dazu gehörten die Stilbene (4.77) und Indolin-2-on 4.131. Bei den Stilbenen wurde abhängig vom Substitutionsmuster ein IC50-Wert zwischen 1.60 µM und 4.32 µM erreicht. Zudem konnten für cis- und trans-Isomer anhand von Proteinkristall¬strukturen unterschiedliche Bindungsmodi festgestellt werden. Zum Zwecke einer weiteren Vereinfachung der Synthese wurde aus dieser Substanzklasse das Cyanostilben 4.95 abgeleitet, welches einen IC50-Wert von 1.72 µM aufwies. Diese Verbindungsklasse stellt aufgrund ihrer einfachen Synthetisierbarkeit einen exzellenten Ausgangspunkt dar, um durch eine SAR oder computergestützte Modifizierung eine Optimierung der bereits erreichten Aktivität anzustreben. Ferner wurde ausgehend von der Bestrebung, die cis-Stilbene in ihrer Konformation zu stabilisieren, das substituierte Triazol 4.114 entwickelt, welches mit einem IC50-Wert von 4.49 µM ebenfalls einen vielversprechenden Ausgangs-punkt für die weitere Entwicklung von Inhibitoren darstellt. Im Falle der Indolin-2-one zeigte Verbindung 4.131 mit einem IC50-Wert von 0.60 µM die stärkste Affinität aller in dieser Arbeit untersuchten Verbindungen. Mithilfe einer SAR konnte die Bedeutung einzelner Strukturmerkmale für die Affinität ermittelt werden, im Zuge dessen wurden zudem Positionen für die gerichtete Weiterentwicklung identifiziert. Anhand der Kristallstruktur eines Analogons konnte ferner der Bindungsmodus dieser Substanzklasse bestimmt werden, sodass nunmehr auch eine computergestützte Optimierung mit den Methoden des Struktur-basierten Wirkstoffdesigns möglich ist. Insgesamt konnten damit im Rahmen dieser Arbeit eine Reihe von hits mit Aktivität gegen die PIM1-Kinase im einstellig mikromolaren Bereich identifiziert werden. Durch die Entwicklung von zuverlässigen Syntheserouten verbunden mit der systematischen Analyse der relevanten Strukturmotive wurde zudem die Grundlage für nachfolgende Bestrebungen gelegt, diese Verbindungen zu hochaffinen Inhibitoren zu optimieren

Characterization of PIM kinases and cancer stem cell features in trophoblast cells

The proviral insertion in murine (PIM) lymphoma proteins are a serine /threonine kinase family composed of three isoforms: PIM1, PIM2 and PIM3 which play a critical role in the control of the cell survival, proliferation, homing, migration, apoptosis inhibition, micro-environmental signaling and drug resistance. In the human immortalized first trimester extravillous trophoblast cell line HTR8/SVneo and in the choriocarcinoma cell line JEG-3, we have analyzed the mRNA expression of PIM1, PIM2 and PIM3 by quantitative real time-PCR, and their protein expression by Western blotting and immunocytochemistry. We have further investigated the expression kinetics after stimulation with LIF. We have inhibited PIM kinases by using SGI-1776 at different doses, subsequently, we have studied the kinetics of cell function by cell viability, proliferation and apoptosis (BAD, BCL-XL, (cleaved) PARP and CASP3) and also the expression and potential PIM target c-MYC. Additionally, apoptosis and necrosis was tested by flow cytometry by annexin V and propidium iodide binding. The major results are that all analyzed PIM kinases are expressed in both cell lines and further increased upon stimulation with LIF. Inhibition of PIM kinases significantly reduces viability and proliferation and induces apoptosis as assessed by increased cleaved PARP and annexin V/propidium iodide binding. Simultaneously, phosphorylation of c-MYC was reduced. We have observed that the HTR8/SVneo cells forming spheroids expressed the stem cell surface marker CD44+ve high/CD34+ve low /CD24+ve low. Upon LIF stimulation these markers showed a decreased expression. The stemness-related transcription factors NANOG and CDX2 were constitutively expressed. Upon OSM treatment the expression level of NANOG is increased and that of CDX2 decreased. Hence, we conclude that HT8/SVneo cells contain a fraction or side-population that expresses stemness related factors

Mechanismen der Pasteurella multocida Toxin vermittelten Modulation des Osteoimmunsystems

Das Pasteurella multocida Toxin (PMT) ist ein Virulenzfaktor, der von Pasteurella multocida Bakterien sezerniert wird um Zielzellen intrazellulär modifizieren zu können. PMT wirkt auf das Skelettsystem infizierter Tiere ein und ist besonders in der Schweinezucht als Auslöser der atrophischen Rhinitis gefürchtet. PMT verschiebt das Gleichgewicht des physiologischen Knochenumbaus auf die Seite einer Netto-Negativbilanz, indem es sowohl die Funktion von Osteoblasten hemmen, als auch die Funktion von Osteoklasten fördern kann. Über die detaillierten Mechanismen, wie genau PMT die Differenzierung von Osteoklasten stimuliert, ist noch nicht so viel bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass klassische Vorläufer wie Makrophagen unter PMT Stimulation zu Osteoklasten differenzieren können. Es zeigte sich, dass PMT die sechs bislang bekannten Haupt-Schlüsselsignalwege der Osteoklastogenese NFATc1, NF-kappa B, Akt, JNK, ERK und p38 aktivieren kann. Auf der Suche nach Gemeinsamkeiten und Unterschieden zwischen der klassischen M-CSF/RANKL- und der Toxin-stimulierten Osteoklastendifferenzierung, wurde das Proteom von Zellen, die auf den Toxin-vermittelten Differenzierungsweg festgelegt worden waren, mit dem von Zellen verglichen, die alternativ das klassische Osteoklasten-Differenzierungsprogramm mit M-CSF/RANKL eingeleitet hatten. Dabei konnten viele differentiell regulierte Proteine mit Bezug zum Prozess der Osteoklastendifferenzierung gefunden werden, die durch zukünftige Analysen weitere wertvolle Erkenntnisse zum Vorgang der PMT-stimulierten Osteoklastogenese liefern könnten. Die Proteom-Daten führten auch zu der Erkenntnis, dass die PMT-stimulierte Osteoklastendifferenzierung von der Aktivierung des mTOR-Signalweges abhängig ist. Als zugrundeliegender Mechanismus konnte eine mTOR-stimulierte Aktivierung der P70s6K1 gezeigt werden, die über die Inhibition eines Repressors der Osteoklastogenese, dem PDCD4, für die PMT-stimulierten Effekte verantwortlich sein könnte. Als Folge führt dies zu der mTOR-abhängigen Aktivierung von c-jun und somit zu einer AP-1 induzierten initialen Induktion von Osteoklasten-spezifischen Genen nach PMTStimulation. Der zweite Teil der Arbeit bezieht sich auf eine Publikation, in der zuvor gezeigt werden konnte, dass die PMT-stimulierte Osteoklastendifferenzierung B-Zell-abhängig ist. Es sollte untersucht werden, welche Rolle dabei den B-Zellen in der PMT-induzierten Osteoklastogenese zukommt. Dabei zeigte sich, dass mit dem Pan-B-Zellmarker CD45R aufgereinigte Zellen in vitro als direkte Vorläufer für eine PMT-stimulierte Differenzierung von Osteoklasten eingesetzt werden können. Darüber hinaus wiesen diese mit PMT terminal differenzierten Osteoklasten sowohl Merkmale von Plasmazellen, wie die Expression des Markers Syndecan-1 und die Sekretion von löslichem IgM, als auch spezifische Marker für Osteoklasten, wie die Expression des Enzymes TRAP und Multinuklearität auf. Letztlich konnte allerdings durch die Daten der vorliegenden Arbeit nicht zweifelsfrei final bewiesen werden, ob B-Zellen tatsächlich Vorläuferzellen für die PMT-stimulierte Differenzierung sind, da eine geringe Menge an kontaminierenden Zellen nicht komplett eliminiert werden konnte

Proteinkinase CK2: ein Enzym mit mehreren Bindestellen

CK2 ist eine eukaryotische Proteinkinase der CMGC-Familie. Durch ihre pleiotrope Funktion, die ubiquitäre Lokalisation und ihre konstitutive Aktivität (in vitro) ist sie ein wichtiges Element in vielen Signalkaskaden. CK2 liegt in der Zelle sowohl als heterotetrameres Holoenzym (bestehend aus zwei katalytischen CK2a-Untereinheiten und zwei regulatorischen CK2b-Untereinheiten) als auch als monomeres CK2a-Protein vor und kann sowohl ATP als auch GTP als Phosphodonor verwenden, ein Alleinstellungsmerkmal unter CMGC-Kinasen. Die Bedeutung dieser seit vielen Jahrzehnten bekannten Serin/Threonin-Proteinkinase für zentrale Prozesse in der Zelle wurde in den letzten Jahrzehnten immer deutlicher. CK2 hat unter anderem eine wichtige antiapoptotische Funktion, die Krebszellen vor dem Zelltod schützt. Sowohl wegen ihrer außerordentlichen Eigenschaften als auch durch die medizinische Relevanz ist CK2 Objekt intensiver Forschung. Um einen Beitrag zu den noch offenen Fragen zu leisten, habe ich mich in dieser Arbeit mit den Bindestellen des katalytischen CK2a-Monomers beschäftigt. Ich konnte zeigen, dass kleine Unterschiede innerhalb der neuartigen ATP-kompetitiven Töberichfuran-Inhibitoren einen erheblichen Anteil an der Orientierung dieser Inhibitoren an der ATP-Bindestelle haben und dass ein weiterer ATP-kompetitiver Inhibitor (E9) ein außergewöhnliches Bindungsmuster aufweist. Der als Bisubstratinhibitor entwickelte Inhibitor ARC3140 zeigte in der Kristallstruktur mit CK2a die überraschende Eigenschaft mit dem ATP-kompetitiven Anteil sowohl an der ATP-Bindetasche als auch an der CK2a/b-Interaktionsstelle im Kristall zu binden. Diese Bindung an der CK2a/b-Interaktionsstelle wurde näher charakterisiert und ist kein Kristallisationsartefakt, sondern findet ebenfalls in Lösung statt. Durch die Kristallisation einer symmetrischen Holoenzymstruktur konnte ich einen Beitrag zum Verständnis der Oligomerisation von CK2 leisten. CK2b bindet nicht ausschließlich an der primären CK2a/b-Interaktionsstelle. Es ist ebenfalls eine Affinität für die sekundäre Interaktion der sauren Schleife von CK2b im Holoenzym zu der basischen Substratbinderegion von CK2a eines anderen Holoenzyms vorhanden. Diese Affinität gibt der länger diskutierten Möglichkeit der Filamentbildung eine strukturelle Basis. Die N- und C-terminalen Domänen von CK2a werden durch die Gelenkregion an der ATP-Bindetasche miteinander verbunden. Das monomere humane CK2a-Protein ist bislang das einzige CK2a-Protein, bei dem diese Gelenkregion sowohl in einer offenen als auch in einer geschlossenen Konformation kristallisiert wurde. Um einen Einblick in die Funktion dieser Konformationen zu erhalten, wurden vier Proteinvarianten kristallisiert. Durch die Verknüpfung der Strukturdaten mit Kinetiken dieser Proteinvarianten konnte die Bedeutung einzelner Aminosäurereste für die Konformation herausgestellt werden. Die Kristallisation von CK2a mit dem substratkompetitiven Inhibitor Heparin konnte erstmalig die Bindung eines größeren Moleküls an die Substratbindestelle von CK2a zeigen. Außerdem konnte eine zweite Bindungsstelle für Heparin identifiziert werden und daraus ein Modell für die Heparinbindung an CK2a im Einklang mit Kinetikdaten der CK2-Literatur postuliert werden

Inaktivierung von mRNAs und miRNAs durch DNA/LNA-basierte und mit zusätzlichen Funktionalitäten konjugierte Antisense-Oligonukleotide

Seit der Entdeckung der RNA Interferenz (RNAi) Ende der 90er Jahre wurde dieser Mechanismus als gentechnisches Werkzeug stetig weiterentwickelt und in den verschiedensten biologischen sowie medizinischen Bereichen eingesetzt. Dies ermöglichte nicht nur die Aufklärung unbekannter Gen-Funktionen durch Knockdown-Experimente, sondern auch die Entwicklung RNA-Interferenz-basierter Therapeutika. Hierbei stellt vor allem der Einsatz kurzer, nicht kodierender RNAs, welche die Genexpression mit Hilfe von RNAi beeinflussen können, eine vielversprechende Therapieoption dar. Sogenannte microRNAs (miRNAs) können einen wesentlichen Einfluss auf die Regulation unzähliger biologische Prozesse nehmen. Durch diese Beeinflussung, welche auch die Differenzierung und Proliferation von Zellen betreffen kann, können sie tumorsuppressive wie auch onkogene Eigenschaften besitzen. Neben den natürlich vorkommenden miRNAs wurde als Therapieansatz und zur gentechnischen Analyse ebenfalls synthetische kleine RNAs entwickelt, wie z.B. die small interfering RNAs (siRNAs). Dies ermöglichte es stabilere und modifizierte RNAs einzusetzen, was den Anwendungsbereich erweiterte sowie neue Therapiealternativen ermöglichte. Im ersten Projekt dieser Arbeit wurde untersucht, ob RISC-Komplexe an eine spezifische mRNA mit Hilfe eines bifunktionellen Adapter-Oligonukleotids umgeleitet werden können. Durch diesen Ansatz ist es möglich eine onkogene miRNA in ihrer Funktion zu inhibieren und gleichzeitig die Translation der mRNA eines Proto-Onkogens zu suppremieren und dadurch simultan einen synergistischen antitumorigenen Effekt zu erreichen. Dabei adressiert ein Teil des Adapters die onkogene miRNA, welche zuvor von einem RISC-Komplex gebunden wurde. Der zweite Adapter-Bereich ist gegen die 3'-UTR einer spezifischen mRNA adressiert und ermöglicht es so, den indirekt gebundenen RISC-Komplex zur mRNA umzuleiten und den Abbau dieser zu induzieren. Dieser Ansatz wurde zu Beginn der Untersuchungen bei dem Proto-Onkogen PIM1 und der onkogenen miR-20a, die die Proteinexpression des Zellzyklusregulators und Tumorsuppressors P21 herunterreguliert, analysiert. Es konnte mit Hilfe von in vitro Analysen gezeigt werden, dass mit miR-20a beladene RISC-Komplexe aus Zell-Lysaten eingefangen und isoliert werden können. In folgenden Zellkulturexperimenten wurde der Einfluss auf die Expression des Proto-Onkogens PIM1 und des Zellzyklusregulators P21 untersucht. Innerhalb der Zellkulturanalysen konnten Effekte auf die Expression der PIM1 Kinase festgestellt werden, was sich jedoch nicht eindeutig reproduzieren ließ. Auch nach einer Adressierungserweiterung der miR-20a zur kompletten miR-17 Familie sowie zur stärker exprimierten let-7 miRNA Familie, konnten keine stabilen Effekte in Zellkulturanalysen bei PIM1 sowie P21 festgestellt werden. Kürzlich konnte die Arbeitsgruppe von Michael Göbel jedoch in in vitro Experimenten bestätigen, dass beladene RISC-Komplexe mit Hilfe eines bifunktionalen Adapters zu einer spezifischen RNA umgeleitet werden können. Dies deutet darauf hin, dass es mit Hilfe eines stabileren mRNA Systems in Zukunft möglich ist, konstantere Ergebnisse in Zellkultur Experimenten zu erlangen. Ein Konjugat aus einem DNA/LNA Mixmer-Oligonukleotid und der synthetischen Nuklease Tris(2-aminobenzimidazol) wurde im zweiten Projekt dieser Arbeit untersucht. Aufbauend auf vielversprechende Ergebnisse mit entsprechenden DNA- sowie PNA-Konjugaten, welche in der Arbeitsgruppe von Michael Göbel erlangt werden konnten, wurden in dieser Arbeit zunächst in vitro Spaltkinetiken mit DNA/LNA Mixmer-Konjugaten durchgeführt. Diese bestätigten, dass der Wechsel zu DNA/LNA-Oligonukleotiden eine deutlich schnellere Spaltkinetik hervorbringt, wobei die Halbwertszeit der RNA-Substrate von 10 bis 20 Stunden auf 4 Stunden verkürzt werden konnte. Zudem spaltete das Nuklease-Konjugat RNA-Substrate von einer Länge von 412 Nukleotiden erfolgreich und spezifisch, was zuvor nur mit einer Substratlänge von 29 Nukleotiden gezeigt werden konnte. Die Spaltungsposition wurde ebenfalls charakterisiert und zeigt sich in unmittelbarer Nähe um die Bindung des Mixmer-Oligonukleotids mit dem adressierten RNA Substrat. Bei den durchgeführten Zellkulturanalysen wurde wie im ersten Projekt die mRNA der PIM1-Kinase adressiert, wobei vereinzelt Effekte beobachtet werden konnten, welche allerdings nicht reproduzierbar waren. Die vielversprechenden in vitro Ergebnisse indizieren jedoch, dass bei einer weiteren Verbesserung der Spaltkinetik, deutliche Effekte in Zellkulturanalysen erlangt werden können