Genetics-related questions’ knowledge and cognitive dimensions in matriculation examinations in biology and their connection to the aims of the Finnish national high school curriculum

Biologian ylioppilaskirjoituksista eli summatiivisesta arvioinnista ei ole kattavasti tutkimustietoa. Tämän tyyppistä tutkimusta tarvitaan, sillä arviointi ohjaa, mitä ja kuinka opiskelijat oppivat sekä mitä he pitävät tärkeänä. Lisäksi perinnöllisyystiede on yksi haastavimmista biologian osa-alueista ja opettajien mielestä se tulee pysymään tärkeänä tulevaisuudessa. Perinnöllisyystieteen opiskelun tärkeyttä voidaan oikeuttaa myös filosofisilla, sosiaalisilla ja terveydellisillä syillä. Täten tämä tutkimus keskittyy perinnöllisyystieteen osuuteen biologian ylioppilaskirjoituksissa. Tutkimuksen tavoite oli tarjota tietoa biologian ylioppilaskirjoitusten haasteista ja sisällöistä sekä kuinka ne ovat linjassa lukion opetussuunnitelman perusteiden kanssa. Tutkimuksen tuloksilla voidaan arvioida ovatko biologian ylioppilaskirjoitukset ja lukion opetussuunnitelman perusteet linjassa toisiinsa sekä mahdollisesti auttaa suunnittelemaan uusia lukion opetussuunnitelman perusteita ja ylioppilaskokeita, jotka olisivat paremmin linjassa lukion opetussuunnitelmien perusteiden kanssa. Tutkimuskysymykset olivat: 1. Mitä tiedon ja ajattelun taitojen tasoja ylioppilaskirjoitukset mittaavat perinnöllisyystieteen tehtävissä? 2. Miten tiedon ja ajattelun taitojen tasot ylioppilaskirjoitusten perinnöllisyystieteen tehtävissä suhteutuvat opetussuunnitelman perusteissa kirjattujen tavoitteiden kanssa? Aineisto koostui biologian ylioppilaskirjoitusten perinnöllisyystieteen tehtävistä aikavälillä kevät 2011 – syksy 2020 (20 koetta) sekä Lukion opetussuunnitelman perusteiden 2003 ja 2015 perinnöllisyystieteeseen sopivista tavoitteista. Laadullista sisällönanalyysiä käytettiin määrittämään tiedon tasot (fakta-, käsite- tai menetelmätieto) ja ajattelun taitojen tasot (muistaa, ymmärtää, soveltaa, analysoida, arvioida tai luoda). Laadullisen sisällönanalyysin analyysirunko perustui uudistettuun Bloomin taksonomiaan. Tämän avulla analysoitiin perinnöllisyystieteen kysymykset biologian ylioppilaskirjotuksista sekä lukion opetussuunnitelmien perusteiden perinnöllisyystieteen tavoitteet. Ylioppilaskoekysymykset ja tavoitteet analysoitiin vielä tarkastelemalla ovatko tehtävät linjassa tavoitteisiin. Luokitellut kysymykset jaettiin kahteen eri alakategoriaan sen mukaan mitä lukion opetussuunnitelman perusteita ne vastasivat. Perinnöllisyystieteen kysymykset keväästä 2011 syksyyn 2017 vastasivat Lukion opetussuunnitelman perusteita 2003 ja kysymykset keväästä 2018 syksyyn 2020 vastasivat Lukion opetussuunnitelman perusteita 2015. Aikavälin kevät 2011 – syksy 2017 kysymykset jakautuivat kaikille tiedon tasoille. Kysymyksistä kaikki muut, paitsi yksi, mittasivat alempia ajattelun taitojen tasoja (muistaa, ymmärtää ja soveltaa). Aikavälin kevät 2018 – syksy 2020 kysymykset jakautuivat myös kaikille tiedon tasoille. Pääosa kysymyksistä mittasi alempia ajattelun taitojen tasoja, mutta muutama osakysymys mittasi korkeampia ajattelun taitojen tasoja (analysoida, arvioida ja luoda). Pääyhdistelmäluokka oli kummallakin aikavälillä käsitetiedon ymmärtäminen. Kaikki tavoitteet puolestaan luokiteltiin käsite- tai menetelmätietoon kuuluviksi. Ajattelun taitojen tasoista tavoitteet jakautuivat kaikille muille tasoille, paitsi muistamiseen. Tavoitteittain kysymyksiä tarkasteltaessa käytettiin luokitteluun konstruktiivisen linjakkuuden ideaa. Tässä luokittelussa kaksi tavoitetta Lukion opetussuunnitelman perusteista 2003 ja seitsemän tavoitetta Lukion opetussuunnitelman tavoitteista 2015 eivät olleet linjassa yhteenkään kysymykseen. Näistä tavoitteista suurin osa vaati korkeampia ajattelun taitojen tasoja. Kaikki tehtävät puolestaan vastasivat jotakin tavoitetta. Korkeamman ajattelun taitojen tasoja edellyttäviä tavoitteita vastasi pääosin vähemmän tavoitteita, kuin alempia ajattelun taitojen tasoja edellyttäviä. Tulokset olivat pääosin odotusten mukaisia tiedon ja ajattelun taitojen osalta. Ylioppilaskoekysymysten ajattelun taidot painottuivat alemmille ajattelun taidon tasoille. Lisäksi kysymysten ja tavoitteiden linjakkuutta tarkasteltaessa tulkintaan omaa haastettaan loi tavoitteiden monitulkintaisuus sekä ajattelun taitojen tasojen kumulatiivisuus, sillä osa tavoitteisiin linjassa olevista tehtävistä ei ollut ajatuksen taitojen tasoiltaan yhtä korkealla kuin tavoitteessa odotettu, mutta oli silti linjassa tavoitteen kanssa. Lisäksi luoda-tason tehtävien puuttumiseen ylioppilaskokeista voi olla useampi syy. Tavoitteiden ja tehtävien linjakkuus arvioinnissa olisi hyvä huomioida tulevaisuudessa, koska arvioinnilla on suuri vaikutus opiskeluun.There are no comprehensive research data on Finnish matriculation examinations in biology. This type of data is needed, because evaluation guides what and how students learn and what they consider important. Genetics is one the most challenging topics in biology, and in the opinion of teachers it will continue to be an important discipline in the future. The importance of studying genetics can also be justified with philosophical, social and health reasons. This is why the present study focused on the genetics component of the matriculation exam in biology. The aim of the study was to provide information on the challenges and contents of past matriculation examinations in biology and how they have aligned with high school curricula. The results of the study could be used to evaluate this alignment in relation to genetics questions in the biology exam, and could help in designing new matriculation examinations that align better with the existing high or new high school curricula and their aims. The research questions were: 1. What knowledge and cognitive dimensions are measured with the genetics-related questions in matriculation examinations in biology? 2. How do knowledge and cognitive dimensions in genetics-related questions in biology matriculation examinations relate to high school curriculum aims? The data comprised matriculation examination papers in biology from spring 2011 to autumn 2020 (20 exams) and the aims of the Finnish national High School Curriculum in 2003 and in 2015. Qualitative content analysis was performed on the knowledge dimensions (factual, conceptual or procedural knowledge) and the cognitive process dimensions (remembering, understanding, applying, analyzing, evaluating or creating). The basis of this qualitative content analysis was Bloom’s revised taxonomy. The analysis was conducted on genetics-related matriculation examination questions and on the aims of the high school curriculum. The test questions and the aims were compared to determine whether they aligned. Classified questions were divided into two subcategories depending on which high school curricula they corresponded to. Genetics-related questions from spring 2011 to autumn 2017 corresponded to the High School Curriculum in 2003 and questions from spring 2018 to autumn 2020 corresponded to the High School Curriculum in 2015. Questions from the previous period were divided into all knowledge dimensions. All questions, except one, incorporated lower cognitive dimensions (remembering, understanding and applying). The main combined class was understanding conceptual knowledge. Questions from the later time period were also divided into all knowledge dimensions. Mostly lower cognitive dimensions were incorporated into the questions, but a few subquestions addressed higher cognitive dimensions (analyzing, evaluating and creating). The main combined class was understanding conceptual knowledge. All the aims were classified into conceptual or procedural knowledge classes. The aims were also divided between all cognitive dimensions, except remembering. Using constructive alignment as the basis for matching aims with questions, two aims in the High School Curriculum of 2003 and six aims in the High School Curriculum of 2015 had no questions that matched them. These aims mostly measured the cognitive dimension of creating. Several aims appeared to incorporate higher cognitive dimensions, but the questions were less well aligned with the aims than with those incorporating lower cognitive dimensions. The results concerning knowledge and cognitive dimensions were mostly as expected. Lower cognitive dimensions were highlighted in genetics-related matriculation examination questions in biology. The challenge of interpretation brought ambiguity to the aims and cumulative levels of cognitive dimensions when aligning questions with aims, as some of the questions aligned with aims did not assess such high cognitive dimensions as would be expected based on the aims, but were nonetheless aligned with them. Furthermore, there may be several reasons behind the absence of the creating dimension in matriculation examination questions. The alignment of questions and aims would be important to consider in the future, because evaluation has a considerable impact on studying

Characterization of Interaction Between ABBA and NEDD9

Ihmisen aivokuoren merkittäviä ominaisuuksia ovat sen suuri koko ja poimuttuneisuus. Nämä piirteet ovat laajalti alkiovaiheen kehityksen aikaisten hermokantasolujen korkean määrän sekä monimuotoisuuden ansiota. Radiaaligliasolut ovat erityisen suuressa roolissa alkion neurogeneesin aikana, sillä ne tuottavat useita eri solutyyppejä sekä toimivat mekaanisena tukena vastasyntyneille hermosoluille, jotka vaeltavat aivokuoren kehityksen aikana kohti lopullista sijaintiaan. Näille soluille tyypillisiä ominaispiirteitä ovat niiden jakautumiseen liittyvät ainutlaatuiset prosessit, kuten sooman migraatio solusyklin eri vaiheiden aikana sekä jakautumistason tarkka säätely. Vaikka näiden solujen jakautumisprosesseja on tutkittu melko laajalti, niiden taustalla vaikuttavat molekyylitason mekanismit ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. ABBA ja NEDD9 ovat proteiineja, joiden on todettu esiintyvän radiaaligliasoluissa alkionkehityksen aikana. ABBA toimii säätelijänä solukalvon dynaamisissa muutoksissa sekä aktiinin polymerisaatiossa radiaaligliasoluissa, kun taas NEDD9-ekspressiotasoilla on osoitettu olevan suora vaikutus solujen kykyyn edetä mitoosista sytokineesiin. ABBA- ja NEDD9-proteiinien välillä on aiemmin todettu vuorovaikutus Y2H (yeast two-hybrid) -seulonnassa. Tämän pro gradu -tutkielman tavoitteena oli vahvistaa ABBA- ja NEDD9-proteiinien välinen vuorovaikutus biokemiallisesti. Ensin niiden vuorovaikutusta arvioitiin ko-immunopresipitaatiolla, joissa käytettiin C6-glioomasolujen endogeenisia proteiineja. Toinen lähestymistapa oli testata, onko näiden proteiinien välillä kyseessä välitön interaktio NEDD9:n N-terminaalisen SH3-domeenin sekä ABBA:n proliinirikkaan C-terminaalisen osan välillä. Tämä hypoteesi testattiin käyttämällä puhdistettuja proteiineja sekä domeeneja biokemiallisissa sitoutumisanalyyseissä. Vaikka ko-immunopresipitaatio-analyyseissä ilmeni selkeä vuorovaikutus, kykenin osoittamaan, ettei NEDD9 SH3-domeenin ja ABBA:n välillä ole suoraa sitoutumista. Tämä viittaa siihen, että vuorovaikutus voi vaatia muita domeeneja tai olla epäsuora. Nämä tulokset tarjoavat uutta tietoa, joka auttaa karakterisoimaan ABBA:n ja NEDD9:n biologista merkityksistä aivokuoren kehityksessä sekä muissa konteksteissa.The human cerebral cortex is characteristically large and folded, which can be majorly attributed to the high number and variety of neural progenitors during embryonic development. Radial glial cells are essential neural progenitors during neurogenesis. In addition to giving rise to new cell types, they also provide scaffold for migrating newborn neurons. Radial glia are known to portray peculiar characteristics in their cell division process, including unique migratory behavior as well as specifically regulated cleavage furrow orientation. While these processes of radial glial division have been studied extensively, the underlying molecular mechanisms are still largely unknown. ABBA (actin-bundling protein with BAIAP2 homology) and NEDD9 (neural precursor cell expressed, developmentally downregulated 9) are proteins, which are both known to be expressed in certain radial glia progenitors during embryonic development, while they are mainly absent in neurons. ABBA has a defined role of regulating plasma membrane deformation and actin polymerization in radial glia, while NEDD9 expression levels are a known factor in the correct progression from mitosis to cytokinesis. An interaction between ABBA and NEDD9 has previously been identified in a yeast two-hybrid screen done for the embryonic mouse brain. The aim of this thesis was to validate the interaction between ABBA and NEDD9 biochemically. First, their interaction was evaluated by doing co-immunoprecipitation assays on the endogenous proteins from C6 cells. The second approach was to test, whether their interaction is directly mediated by the N-terminal SH3-domain of NEDD9 and the proline-rich C-terminal portion of ABBA. This was done by doing biochemical binding assays using purified proteins and domains of interest. While co-immunoprecipitation of the two proteins gave results indicating an interaction, I could show that there is no direct binding between NEDD9 SH3-domain and ABBA, suggesting that the interaction might require other domains or be indirect. Together, these results provide valuable information that will help characterize what roles of ABBA and NEDD9 play in cortical development and beyond

Glutamiinin aistinnan säätelytekijöiden analysoiminen Drosophila melanogaster -malliorganismissa

Glutamiini on yksi ihmiskehon yleisimmistä aminohapoista; sillä on tärkeä rooli niin hiilen kuin typenkin aineenvaihdunnassa. Monet soluille välttämättömät reaktiot, kuten proteiinisynteesi ja solujen hapetus-pelkistystasapainon ylläpitäminen, ovat siitä riippuvaisia. Solujen aineenvaihduntaa säädellään ravintoaineiden saatavuuden mukaisesti. Syöpäsolut kuitenkin poikkeavat tästä säätelystä, ja esimerkiksi kiihtynyt glutamiinin aineenvaihdunta tarjoaa niille rakennuspalikoita nopeaan lisääntymiseen sekä työkaluja solulle epäsuotuisissa stressiolosuhteissa selviytymiseen. Tästä johtuen olemme kiinnostuneita selvittämään glutamiinin aistinnan ja aineenvaihdunnan säätelymekanismeja syvällisemmin. Tutkimuksessa käytimme Drosophila melanogaster -malliorganismia. Banaanikärpänen on ideaali valinta, sillä vaikka sen genomi on huomattavasti ihmisgenomia yksinkertaisempi, ovat useimmat geenit ja niiden säätelyreitit hyvinkin konservoituneita lajien välillä. Työssä keskityimme aiemmin löydettyjen säätelytekijäkandidaattien, Forkhead box O (FoxO), Super sex combs (Sxc), Spalt major (Salm) ja Spalt-related (Salr), tutkimiseen. Hyödynsimme kärpäslinjoja, jotka ali- tai yliekspressoivat kandidaattigeenejä ja analysoimme, millaisia fysiologisia tai geneettisiä vasteita havaitsemme, kun kärpäset saavat joko ruokaa glutamiinilla tai ilman glutamiinia. Tuloksista näimme, että foxo ja sxc mutantit ilmensivät glutamiini-intoleranttia fenotyyppiä. Varmistimme myös, ettei fenotyyppi ollut riippuvainen siitä, että mutantit toukat olisivat syöneet eri määrän ruokaa sen glutamiinipitoisuudesta riippuen. Emme huomanneet selkeää glutamiini-intoleranssia kärpäsillä, joilla Salr tai Salm oli aliekspressoitu. Pyrimme ymmärtämään syvällisemmin FoxO:n ja Sxc:n rooleja glutamiinin aineenvaihdunnassa. Aminohappojen hajottaminen tuottaa ammoniakkia, ja toisaalta glutamiinin metabolialla on tärkeä rooli ammoniakin detoksifikaatiossa. Siksi olimme kiinnostuneita, voisiko foxo tai sxc mutanttien hemolymfan pH-arvoissa olla eroja glutamiinia sisältävällä ruoalla vs. glutamiinittomalla ruoalla. Saamiimme tuloksiin nojaten emme kuitenkaan voineet yhdistää FoxO:a tai Sxc:tä glutamiiniperäisen ammoniakin poistamisen säätelyyn. Lisäksi selvitimme FoxO:n roolia kuuden eri geenin, Paics, Uro, Sesn, salr, Prat2, ja Gdh, säätelyssä lusiferaasi-reportterigeeni analyysilla. Tuloksista näimme, että FoxO säätelee niistä jokaisen ekspressiota. Seuraavaksi voisimme hyödyntää tässä työssä rakennettuja plasmideja selvittääksemme, onko soluviljelmän glutamiinipitoisuudella vaikutusta näiden kuuden geenin FoxO:sta riippuvaiseen säätelyyn.Glutamine, the conditionally essential amino acid, is a major carbon and nitrogen carrier required for a range of cell functions, such as protein synthesis and maintaining redox balance. While healthy cells adjust their activities in response to glutamine availability, tumor cells display deregulated glutamine uptake and metabolism allowing quick proliferation and survival in cellular stress conditions. Hence, further knowledge of the glutamine sensing network is of interest. Utilizing Drosophila melanogaster, the roles of formerly identified glutamine sensing regulator candidates, Forkhead box O (FoxO), Super sex combs (Sxc), Spalt major (Salm) and Spalt-related (Salr), were explored. Drosophila is an efficient model organism for analyzing gene regulatory mechanisms, with its simple genome but conserved genes and metabolic pathways. Loss-of function and gain-of-function mutants of the candidates were cultured with/without glutamine, and their physiological response and gene expression changes were analyzed. The results show the glutamine intolerant phenotype of FoxO and Sxc deficiency, not dependent on altered food intake levels of larvae. However, glutamine intolerance of Salr and Salm deficiency was not observed. Moreover, we aimed to gain further insight to the roles of FoxO and Sxc in glutamine metabolism. Since amino acid catabolism produces ammonia, and glutamine metabolism plays a vital role in ammonia detoxification, we performed a pH-based measurement of foxo and sxc mutant larvae hemolymph on food with/without glutamine. However, we could not associate FoxO or Sxc with regulation of glutamine-derived ammonia clearance. In addition, we explored FoxO downstream regulator candidates. Putative promoter areas of Paics, Uro, Sesn, salr, Prat2 and Gdh were cloned into reporter vectors and the luciferase activity was analyzed under the expression of foxo. The results indicate that FoxO is a regulator of all of the 6 genes. Next we could utilize the here constructed plasmids to see whether the FoxO-mediated regulation is affected by altered glutamine levels in cell culture

Eliniän perinnölliset tekijät täpläverkkoperhosessa (Melitaea cinxia)

Elinikä on keskeinen kelpoisuuden piirre yhdessä hedelmällisyyden, leviämisen ja kasvun kanssa. Elinajan vaihteluun vaikuttavien ympäristötekijöiden lisäksi siihen vaikuttavat myös perinnölliset tekijät. Teorian perusteella eliniän geneettisen vaihtelun odotetaan olevan suhteellisen pientä, koska eliniällä on suuri merkitys yksilön kelpisuuteen. Toisaalta elämänhistorian eri piirteiden vaihtokauppojen ja organismien luonnossa kohtaamien vaihtelevien tai epävakaiden ympäristöolosuhteiden vuoksi elämänhistorian piirteiden odotetaan ylläpitävän geneettistä moninaisuutta. Malliorganismeilla, kuten banaanikärpäsellä ja sukkulamadolla, tehtyjen tutkimusten perusteella on paljastettu keskeisiä näkemyksiä eliniän geneettisestä perustasta. Joidenkin geenien on osoitettu vaikuttavan elinikään enemmän kuin toisten, ja eri lajeissa näyttää olevan samanlaisia homologisia geenejä, jotka vaikuttavat elinikään ja ovat evolutiivisesti konservoituneita. Monet näistä geeneistä kohdentuvat insuliinireseptoreihin ja insuliinin signalointiprosesseihin. Näiden geenien alleelisen vaihtelun ja yli- tai ali- ekspression on osoitettu liittyvän eliniän vaihteluihin. Huolimatta näiden laboratorio-olosuhteissa osoitettujen geenien vaikutuksesta elinikään, meillä on vain vähän ymmärrystä niiden vaikutuksesta luonnon populaatioissa. Yleisesti ottaen eliniän vaihteluun vaikuttavien geenien arvioiminen luonnonpopulaatioissa on harvinaista, jopa olosuhteissa, joissa tiedetään, että eliniässä on perinnöllinen tekijä. Täpläverkkoperhonen (Melitaea cinxia) on perhonen, joka esiintyy suurimmassa osassa Eurooppaa. Sitä käytetään mallilajina ekologiassa ja evoluution tutkimuksessa suhteessa metapopulaatiodynamiikkaan ja spatiaalisesti rakenteellisiin elinympäristöihin. Suomessa perhosta on tutkittu laajasti sekä koeolosuhteissa että kenttätutkimuksissa. Täpläverkkoperhonen toimii hyvänä malliorganismina elämänhistorian vaihtelun geneettisten tekijöiden arvioinnissa, koska saatavilla on jo valtava määrä valmiiksi kerättyä genomista ja ekologista dataa. Tässä opinnäytetyössäni tavoitteenani on valaista eliniän geneettistä taustaa käyttämällä täpläverkkoperhosta malliorganismina. Tarkemmin sanottuna testaan joidenkin tunnettujen elinikään liittyvien kandidaattigeenien yhteyttä aikuisperhosen eliniän fenotyyppiseen vaihteluun perustuen aiemmin saatuun kokeelliseen tietoon yksilöistä, jotka on kerätty luonnontilaisesta metapopulaatiosta toukkavaiheen aikana.Lifespan is a key fitness trait, together with fecundity, dispersal, and growth. In addition to environmental factors shaping variation in lifespan, it is also influenced by genetic components. Based on theory, genetic variation in lifespan is expected to be reduced due to its high relevance to fitness. However, due to trade-offs between different life-history traits and the variable or unstable environmental conditions organisms face in nature, life-history traits are also expected to sustain higher genetic variation. From studies in model organisms, such as the fruit fly and the roundworm, researchers have uncovered key insights into the genetic basis of lifespan. Some genes have been shown to contribute more to lifespan than others and different species seem to share homologous genes influencing lifespan that have been conserved. Many of these genes relate to the insulin receptors and insulin signaling processes. The allelic variation and over- or under-expression of these genes have been shown to be associated with changes in lifespan. However, regardless of our accumulating knowledge of these genes in impacting lifespan under laboratory conditions, we have little understanding of the role of these genes impacting variation in lifespan under more natural conditions. In general, assessment of genes affecting variation in lifespan in natural populations is rare, even under circumstances where we know that the lifespan has a heritable component. The Glanville fritillary (Melitaea cinxia) is a butterfly that inhabits most of Europe. It is used as a model species in ecology and evolution in relation to metapopulation dynamics and spatially structured habitats. It has been studied extensively both under experimental conditions and via observational studies in the field. The Glanville fritillary butterfly works as a good model organism for assessments of genetic components of life-history variation, as vast amounts of genomic and ecological data are already available. In this thesis, I aim to shed light on the genetic background of lifespan by using the Glanville fritillary as a model organism. More specifically, I will test the association of some well-known lifespan-related candidate genes with a phenotypic variation on the butterfly’s adult lifespan based on previously obtained experimental data on individuals collected from the natural metapopulation during the larval stage

Effects of biomembrane properties on cellular responses in an epicardial patch

Iskeeminen sydämen vajaatoiminta on maailman johtava kuolinsyy. Sairauden aiheuttaa pitkäaikainen sydänlihaskudoksen hapen ja ravintoaineiden puute, jonka taustalla on usein sepelvaltimotauti. Tukkeuma sepelvaltimoissa estää hapen ja ravintoaineiden pääsyn sydänlihaskudokseen ja voi täten johtaa sydännekroosiin ja arpeutuneeseen sydänlihaskudokseen. Arpeutunut sydänkudos menettää joustavuutensa ja täten sydämen pumppausteho pienenee johtaen sydämen vajaatoimintaan. Vaikka iskeemistä vajaatoimintaa voidaan itsessään hoitaa monin eri tavoin ei arpeutuneelle kudokselle ole toistaiseksi olemassa tehokasta hoitomuotoa. Prekliinisiä ja kliinisiä tutkimuksia uusista hoitomuodoista on meneillään arpikudosta parantavan hoidon löytämiseksi Solututkimuksissa sydänlihaskudoksen päälle asetettavien epikardiaalisten paikkojen on osoitettu lisäävän siirrettyjen solujen eloonjäämistä ja jäämistä sydänkudokseen sekä tehostavan parakriinisten vaikutusten tehoa verrattuna perinteisiin injektiohoitoihin. Soluja tukevan vaikutuksen lisäksi epikardiaalisissa paikoissa käytetty biomembraani on tärkeässä osassa paranemisprosessia ja sen ominaisuuksilla on suuri vaikutus hoitovasteeseen. Tämän maisterintutkielman tarkoituksena oli rakentaa standardoitu koejärjestely, jonka avulla voidaan vertailla biomembraanien ominaisuuksia, kuten läpäisevyyttä pienille molekyyleille (glukoosi ja laktaatti), sekä erikokoisille proteiineille. Myös biomembraanin ominaisuuksien vaikutuksia siirretyistä soluista saataviin vasteisiin voitiin tutkia koejärjestelyä muokkaamalla. Koejärjestelyä testattiin tutkimalla ProxiCorTM-biomembraania, jota käytetään eteiskorvakkeen soluista kehitetyssä epikardiaalisessa mikrosiirteessä. Koejärjestely oli onnistunut ja sen avulla suoritettu ProxiCorTM-membraanin koestus paljasti membraanin olevan läpäisevä sekä pienille molekyyleille että proteiineille. ProxiCorTM-membraanin käyttö myös tasasi pH:ta tutkimusasetelmassa. Lisäksi ProxiCorTM-membraanin käyttö mahdollisti seerumin indusoiman solujen jakautumisen läpäisemättömään kalvoon verrattuna. Saadut tulokset todistavat rakennetun koejärjestelyn toimivuuden ja tukevat täten sen jatkokehitystä.Ischemic heart failure is the leading cause of death in the world. The disease is caused by coronary heart disease, in which the narrowed coronary arteries limit oxygen- and nutrient-rich blood from reaching the myocardial tissue. Obstructed arterial blood flow can cause myocardial necrosis and scarring. Scar tissue is non-contractile and poorly elastic. It can thus compromise the pumping capacity of the heart. Current medical and interventional therapies have only very limited efficacy to reduce myocardial scarring. Preclinical and clinical research efforts are underway to generate myocardial scar-reducing and regenerative therapies. In the field of cardiac cellular therapies, the delivery of cells has conventionally been based on intramyocardial injections. However, epicardial patches have been demonstrated to reduce scarring and promote myocardial healing. In addition to merely being a carrier or cover for the cellular transplant, the biomembrane of the patch can also be considered as an active element for the patch’s therapeutic activity. Thus, the properties of the biomembrane can have a major impact on both the cellular and the therapeutic tissue response. The aim of this Master's thesis was to build a standardized test set up to study the properties of the biomembrane. Biomembrane permeability to small (glucose, lactate) molecules and different size proteins was investigated. In addition, the set up was modified to enable the investigation of biomembrane properties on the survival of the grafted cells. Finally, the test set up was evaluated by studying the properties of ProxiCorTM, the biomembrane currently used together with autologous atrial micrografts (AAMs) in epicardial patch. As a result, the set up was successfully constructed and characterized. The ProxiCorTM membrane demonstrated permeability to both small molecules and proteins, and a stable pH was maintained across the membrane. ProxiCorTM enabled traverse serum-induced proliferation of cells compared to the control impermeable membrane. Taken together, these results prove the functionality of the test set up and thus support its further development

Vuoden 2016 kanin verenvuototautiepidemian vaikutus Helsingin kanipopulaation geneettiseen monimuotoisuuteen

Kaniini (Oryctolagus cuniculus) on Iberian niemimaalta kotoisin oleva nisäkäs, joka on levinnyt ihmisen toiminnan ansiosta ympäri maailmaa. Kani on erittäin menestynyt vieraslaji nopean lisääntymiskykynsä ja generalistisen taipumuksensa ansiosta. Kanit ovat aiheuttaneet suuria muutoksia paikalliseen luontoon useissa maissa, ja siksi haitallisia populaatioita on yritetty kontrolloida mm. levittämällä kanienverenvuototautia (rabbit haemorrhagic disease, RHD). Suomessa kaneja tavataan ainoastaan pääkaupunkiseudulla ja muutamissa muissa taajamissa. Helsingin kanipopulaation uskotaan syntyneen karanneista lemmikkikaneista 1980-luvun lopulla. Kanien määrä kasvoi Helsingissä merkittävästi 2000-luvulla, ja ne ovat levinneet myös Espooseen ja Vantaalle. Kanien verenvuototauti levisi tahattomasti suomeen keväällä 2016, mistä seurasi populaation koon merkittävä romahdus kesän aikana. Kanien populaatiogenetiikkaa on tutkittu useissa eri maassa, mutta ei koskaan Suomessa. Pro graduni tavoitteena oli tutkia Helsingin kanien geneettistä monimuotoisuutta ja populaation rakennetta ja verrata tuloksia aiemmin julkaistuihin tutkimuksiin. Kanipopulaatioiden on todettu selviävän suuristakin populaatiokoon romahduksista eli pullonkauloista menettämättä merkittävästi geneettistä monimuotoisuutta. Suomen kylmä ilmasto itsessäänkin jo koettelee kanien selviytymisen rajoja, ja siksi oli kiinnostavaa selvittää, miten pohjoisen ilmaston ja RHD-epidemian aiheuttaman populaatiokoon romahduksen yhteisvaikutus ilmeni Helsingin kanikannassa. Tutkimuksen aineistona oli kanikudosnäytteitä ennen ja jälkeen RHD-epidemiaa, vuosilta 2008-2009 (n=130) sekä 2019-2020 (n=59). Populaatiogeneettisiä analyyseja varten genotyypattiin neljätoista kaneilla varioivaa DNA-mikrosatelliittilokusta. Populaatio rakennetta oli havaittavissa sekä vanhassa että uudessa populaatiossa pienillä, mutta merkitsevillä FST arvoilla. Uusissa näytteissä oli enemmän alleeleja ja suuremmat heterotsygotia-arvot vanhoihin näytteisiin verrattuna, mikä oli yllättävä tulos RHD-epidemian jälkeen. Yksi mahdollinen selitys on, että populaatioon on tullut geenivirtaa uusista karanneista kaneista. Muiden maiden kanipopulaatioihin verrattuna Helsingin kanit ovat monimuotoisuudeltaan selkeästi köyhempiä. Pullonkaulatestit antoivat merkitsevän signaalin molemmille populaatiolle, joten testeillä ei pystytty erikseen vahvistamaan juuri RHD-epidemian aiheuttamaa geneettistä pullonkaulaa. Testien tulokseen on voinut vaikuttaa migraatio sekä populaation syntymähetkellä perustajanvaikutuksesta seurannut pullonkaula. Kanit ovat osoittaneet poikkeuksellisen adaptaatiokykynsä Helsingin kylmässä ilmastossa, ja populaatio selvisi äärioloista huolimatta myös RHD-epidemian aiheuttamasta populaation romahduksesta menettämättä merkittävästi geneettistä monimuotoisuutta.The European rabbit (Oryctolagus cuniculus) is a small mammal native to the Iberian Peninsula, but introduced by humans to all continents except Antarctica. The rabbit has been a remarkably successful invasive species due to its generalist nature and fast reproduction. Its spreading has mostly been destructive to the local nature, and humans have used fatal rabbit diseases such as rabbit haemorrhagic disease (RHD) to control harmful populations. The rabbit population in Helsinki is one of the most northern annually surviving rabbit populations in the world. It is believed to have originated from escaped pet rabbits in the late 1980s, and in the early 2000s, the rabbits spread rapidly around the Helsinki area. RHD spread unintentionally to Finland in 2016, and the disease caused a significant reduction in the Helsinki rabbit population. Rabbit population genetics has previously been studied in several countries, but never before in Finland. The aim of the thesis was to examine the genetic diversity and population structure of the Helsinki rabbit population before and after the RHD epidemic, and to compare the results to similar preceding rabbit population genetic studies. Rabbit populations have previously been found to recover from major population crashes without a notable loss in genetic diversity using DNA microsatellite markers. The recent RHD epidemic in Helsinki provided an opportunity to study, whether a rabbit population can recover from a population crash even in a harsher environment without losing genetic diversity. To conduct genetic analysis, fourteen DNA microsatellite loci were genotyped from individuals caught during two distinct time periods, in 2008-2009 (n=130) and in 2019-2020 (n=59). Population structure was observed in both temporal rabbit populations with small but significant FST values. The 2019-2020 population was more diverse than the 2008-2009 population in terms of allele numbers and expected heterozygosity. This result was unexpected considering the recent RHD-epidemic but could be explained by gene flow from new escaped rabbits. Compared to other wild rabbit populations around the world, the Helsinki area rabbits exhibit significantly lower genetic diversity. Bottleneck tests showed a significant signal separately in both temporal populations, but the RHD bottleneck cannot be distinguished based on the tests. The results could be biased by new gene flow, or the initial bottleneck caused by the founder effect of only a few pet rabbits. The rabbits have demonstrated their adaptation and survival skills in the cold climate of Helsinki. The population has significantly lower genetic diversity compared to other wild populations, yet recovered from a major RHD epidemic without reduction in genetic diversity under these more extreme environmental conditions. It has been proven again; the rabbit is a thriving invasive species

Tapaus-verrokkitutkimus Serpina3 c.918-1G>C muunnoksen rintasyöpärikin arvioimiseksi Etelä-Suomen väestössä

Rintasyöpä on yleisin naisilla esiintyvä syöpä ja vuonna 2020 se oli viidenneksi yleisin kuolemaan johtava syöpä. Suomessa diagnosoitiin vuonna 2019 yli 5000 uutta rintasyöpä tapausta, joista 94 % esiintyi naisilla ja 6 % miehillä. Tähän mennessä korkean riskin rintasyöpägeenit kuten BRCA1, BRCA2 ja TP53 on tunnistettu sekä lisäksi monia keskikorkean riskin geenejä. Silti yhdessä kaikki löydetyt geenit selittävät vain noin puolet familiaarisista rintasyöpätapauksista. Lisäksi kaikki löydetyt rintasyövän alttiusgeenit ovat yhteydessä DNA:n korjausmekanismiin. Serpina3 erottuu joukosta ei-DNA-korjausmekanismigeeninä vain geeninä, joka koodaa Serpin-superperheeseen kuuluvaa proteaasi-inhibiittoria. Serpina3 on yhdistetty moniin sairauksiin ja erityisesti muutokset sen ilmentymistasossa on liitetty kasvaimen etenemiseen monissa syövissä, myös rintasyövässä. Aikaisempi tutkimus kuitenkin esittää, että Serpina3 c.918- 1G>C variantti on rintasyövälle altistava Pohjois-Suomen väestössä. Tässä pro gradu- työssä tutkitaan tapaus-verrokkitutkimuksena Serpina3 c.918-1G>C variantin liittymistä rintasyöpään Etelä- Suomen väestössä. Lisäksi Serpina3 c.918-1G>C muutoksen kantajien kasvaimen histologia ja solumarkkerit analysoitiin. Tutkimuksessa käytettiin rintasyöpäpotilailta kerättyä DNA:ta sekä DNA:ta veren luovuttajilta ja biopankista. Rintasyöpäpotilaat kattoivat sekä familiaariset että valikoimattomat tapaukset. Serpina3 c.918-1G>C variantin esiintyvyyttä kartoitettiin genotyypittämällä potilaat ja kontrollit. Genotyypitys tehtiin käyttämällä TaqMan reaaliaikaista PCR:ää ja kantajat varmistettiin Sanger sekvensoinnilla. Tilastollisia testejä käytettiin aineiston analysoinnissa. Tutkittua Serpina3 c.918-1G>C varianttia ei löydetty tilastollisesti merkittävästi enemmän (p>0.05) rintasyöpätapauksista kuin kontrolleista. Varianttia löydettiin 0.23 % familiaarista tapauksista ja 0.36 % valikoimattomista tapauksista, yhteensä 0.28 % kaikista rintasyöpätapauksista. Yleisyys väestökontrolleissa oli 0.27 %. Kasvaimen histologia oli duktaalinen 73 % kantajilla ja 9 % kasvain oli lobulaarinen. Toisin sanoen kantajien kasvainten histologia mukaili tavallista jakaumaa. Kaikki kantajat olivat HER2 negatiivisia ja kaikki paitsi yksi olivat sekä ER- että PR-positiivisia. Solun jakautumisen markkeriainetta, Ki-67, löydettiin noin puolelta kantajista. Yhteenvetona tämän tutkimuksen perusteella voidaan esittää, että Serpina3 c.918-1G>C ei ole rintasyövälle altistava geenimuutos ainakaan Etelä-Suomen väestössä.Breast cancer is the most prevalent cancer in women worldwide and in 2020 it was the fifth deadliest. In Finland 2019 more than 5000 breast cancer cases were diagnosed, 94% in women and 6% in men. Until now, the high-risk breast cancer susceptibility genes have been identified including BRCA1, BRCA2 and TP53 as well as many of the moderate risk genes. Still, together all the identified genes explain only approximately half of the familial breast cancer cases. Furthermore, all the known breast cancer susceptibility genes are linked to the DNA repair mechanism. Serpina3 stands out as a non-DNA repair gene but as a gene that encodes a protease inhibitor which belongs to the serpin superfamily. Serpina3 has been associated with various diseases before and especially changes in its expression levels are linked to the tumor prognosis in many cancers including breast cancer. However, a previous study proposed that Serpina3 c.918-1G>C is a susceptibility variant for breast cancer in the Northern Finland population. This thesis a case-control study to investigate whether Serpina3 c.918-1G>C variant is associated with breast cancer in the Southern Finland population. In addition, the tumor histology and cellular markers of Serpina3 c.918-1G>C carriers were examined. This study utilized DNA collected from breast cancer patients as well as DNA from blood donors and healthy biobank controls. Breast cancer patients included both familial and unselected cases. The prevalence of Serpina3 c.918- 1G<C variant was studied by genotyping the cases and controls. Genotyping was done by TaqMan real-time PCR and carriers were further confirmed by Sanger sequencing. Moreover, statistical tests were used in the data analyses. The studied Serpina3 c.918-1G>C variant was not found to be significantly (p>0.05) enriched in the breast cancer cases. The variant was found in 0.23 % of familial and 0.36 % of unselected cases, altogether in 0.28 % of all studied breast cancer cases, the frequency in controls was 0.27 %. The tumor histology was found to be ductal in 73 % of the Serpina3 c.918- 1G>C variant carriers and only 9 % had lobular tumor. In other words, the tumor histology followed the usual distribution. All the carriers had a HER2 negative tumor and all except one case were both ER and PR positive. About half of the carriers expressed the cellular proliferation marker Ki67. As a conclusion, the results from this study do not suggest Serpina3 c.918-1G>C as a breast cancer risk variant at least in the Southern Finland population

Kalsynteniini-3:n laminiinin G-domeenin tyyppinen -domeeni muodostaa dimeerejä liuoksessa

Kalsynteniini-3 on tyypin I kalvoproteiini, jota esiintyy pääasiassa post-synaptisissa solukalvoissa. Se kuuluu kalsynteniinien proteiiniperheeseen, joka on osa kadheriinien superperhettä. Kalsynteniini-3 sisältää solulimanpuoleisen C-terminaalisen osan, kalvon läpäisevän domeenin ja solunulkoisen N-terminaalisen osan, joka sisältää laminiinin G-domeenin tyyppisen -domeenin (LNS) ja kaksi kadheriinidomeenia (CAD). Kalsynteniini-3:a esiintyy pääasiassa aivoissa, mutta sitä on myös sydämessä, maksassa, haimassa, keuhkoissa, lihaksissa ja istukassa. Kalsynteniini-3:lla on vaikutusta neurogeneesiin, sillä se vaikuttaa eksitatoristen ja inhibitoristen synapsien kehitykseen. Sillä voi olla myös vaikutusta Alzheimerin taudin kehittymisessä, koska sen on havaittu pystyvän sitoutumaan β-amyloidipeptidiin, jonka tiedetään olevan avainasemassa Alzheimerin taudin synnyssä. Kalsynteniini-3 on synaptinen adheesioproteiini, joka sitoutuu postsynaptisiin neureksiineihin solunulkoisella osallaan. Aikaisempien tutkimusten tulokset ovat kuitenkin ristiriidassa keskenään sen suhteen, mikä kalsynteniini-3:n domeeni sitoutuu neureksiineihin. Erimielisyyttä esiintyy myös siitä, sitoutuuko kalsynteniini-3 neureksiini-α:aan, neureksiini-β:aan vai molempiin. Näiden ristiriitojen takia tämän pro gradu -työn tavoitteena oli tuottaa rekombinanttien bakulovirusten avulla hyönteissoluviljelmissä osia kalsynteniini-3:sta siten, että ne sisälsivät joko kalsynteniini-3:n kaksi CAD-domeenia, LNS-domeenin tai kaikki kolme domeenia. Nämä puhdistetut kalsynteniini-3:n osat olisi käytetty kokeissa, joissa olisi määritelty, mitkä kalsynteniini-3:n domeenit sitoutuvat neureksiineihin. Valitettavasti vain kalsynteniini-3:n LNS-domeenin puhdistus onnistui ja CAD-domeeneja sisältävien rakenteiden puhdistus epäonnistui. SEC-MALLS-koe, joka tehtiin kalsynteniini-3:n LNS-domeenille, paljasti, että kalsynteniini-3:n LNS-domeeni muodostaa dimeerejä liuoksessa, mikä on yhdenmukaista sukupuolihormoneja sitovan globuliinin LNS-domeenilla tehtyjen kokeiden kanssa. Tämän pro gradu -työn toinen tavoite oli ilmentää kalsynteniini-3:n osia HEK293T-solujen pinnalla, ja testata kalsynteniini-3:n ja neureksiinien sitoutumista solun pinnalla tehtävässä sitoutumiskokeessa. Sitoutumiskokeen tulokset viittaavat siihen, että sitoutuminen tapahtuu kalsynteniini-3:n CAD-domeenien avulla, ja että kalsynteniini-3 sitoutuu neureksiini-α:aan, mutta ei neureksiini-β:aan. Sitoutumiskokeen tulokset olivat kuitenkin ristiriitaisia: sitoutumista kalsynteniini-3:n täyspitkän solunulkoisen osan ja neureksiini-α:n välillä ei havaittu, mutta sitoutumista havaittiin pelkän kalsynteniini-3:n CAD-domeenin sisältävän proteiinin ja neureksiini-α:n välillä. Tämän vuoksi solun pinnan sitoutumismääritystä ei voida pitää täysin luotettavana, ja se tulisi toistaa ennen uusien johtopäätösten tekemistä.Calsyntenin-3 is a type I transmembrane protein, that is mainly expressed on the post-synaptic cell membranes. It belongs to the calsyntenin family that is part of the cadherin superfamily. Calsyntenin-3 consists of a cytosolic C-terminal region, a transmembrane domain and an extracellular N-terminal part, that consists of a laminin G-like domain (LNS) and two cadherin domains (CAD). Calsyntenin-3 is mainly expressed in the brain, but it can also be found in the heart, liver, pancreas, lung, skeletal muscle and placenta. Calsyntenin-3 has an effect on neurogenesis by affecting the development of excitatory and inhibitory synapses. It might also play a role in Alzheimer’s disease, as it has been found to be able to bind β-amyloid peptide, that is known to play a key role in the development of Alzheimer’s disease. Calsyntenin-3 acts as a synaptic adhesion protein, that binds to the post-synaptic neurexins with its extracellular region. However, the previous studies have contradicting results regarding the calsyntenin-3 domains that mediate the interaction between the calsyntenin-3 and neurexins. There is also disagreement whether calsyntenin-3 binds neurexin-α, neurexin-β or both. Because of these discrepancies, the aim of this master’s thesis study was to produce the calsyntenin-3 ectodomain constructs that contained either the two CAD domains, the LNS domain or all three domains, using baculovirus mediated protein production in insect cell cultures. These purified protein constructs were meant to be used for the determination of the binding domains. Unfortunately, only the purification of the calsyntenin-3 LNS domain was successful and the purification of the constructs, containing the CAD domains, was unsuccessful. A SEC-MALLS experiment, that was performed for the calsyntenin-3 LNS domain, revealed that it forms dimers in a solution, which is consistent with experiments performed with the LNS domain of human sex hormone‐binding globulin. The second aim of this master’s thesis study was to express the calsyntenin-3 ectodomain constructs on the surface of HEK293T cells and to test the binding between calsyntenin-3 and neurexins in a cell surface binding assay. The results of the cell surface binding assay indicated that the binding is mediated by the calsyntenin-3 CAD domains and that calsyntenin-3 binds to neurexin-α, but the binding to neurexin-β was not detected. However, the results from the cell surface binding assay were conflicting: the binding between the calsyntenin-3 full ectodomain construct and neurexin-α was not detected, but the binding was detected between calsyntenin-3 CAD ectodomain construct and neurexin-α. Therefore, the cell surface binding assay cannot be considered entirely reliable and should be repeated before making further conclusions

Arvon mekin ansaitsemme : Kohti monitieteellistä lääketieteen, teknologian ja terveystieteiden koulutusta ja tutkimusta Tampereella

Lääketieteellinen tiedekunta aloitti toimintansa Tampereella vuonna 1972, joten vietämme nyt sen 50-vuotisjuhlaa. Ensimmäiset 30 vuotta tiedekunnan historiassa olivat toiminnan pystyttämisen ja vakauttamisen aikaa. Tästä on kirjoitettu vuonna 2002 kirjassamme ”30-vuotinen sota: Tampereen lääketieteellisen tiedekunnan synty ja selviytyminen”. Nyt käsillä olevassa kirjassa keskitytään viimeksi kuluneeseen 20 vuoteen. Näitä vuosia ovat kuvanneet toiminnan laajeneminen ja rakenteelliset uudistukset. Nykyisestä lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunnasta ei valmistu vain lääkäreitä, vaan myös bioteknologian maistereita ja biotekniikan diplomi-insinöörejä sekä näiden kaikkien alojen tohtoreita. Näiden rakenteellisten muutosten seurauksena terveys- ja hoitotieteet puolestaan siirtyivät osaksi yhteiskuntatieteiden tiedekuntaa, kuitenkin sekä fyysisesti että toiminnallisesti integroituina Kaupin kampuksen kokonaisuuteen

Verihiutaleperäisten solunulkoisten vesikkelipopulaatioiden aktivaattoririippuvaisten erojen karakterisointi

Solunulkoiset vesikkelit (Eng: extracellular vesicles, EV:s) ovat fosfolipimembraanin rajaamia nanopartikkeleja, joita erittävät eukaryootit ja prokaryootit. Solunulkoiset vesikkelit kantavat sisällään makromolekyylejä ja singalointimolekyylejä muihin soluihin, toimien näin tärkeinä solujen välisen kommunikaation välittäjinä sekä patologisissa että homeostaattisissa oloissa. Vesikkelit ovat lisäksi hyvin kiinnostavia niiden sovellusmahdollisuuksien vuoksi diagnostiikassa ja terapeuttisissa sovelluksissa. Solunulkoiset vesikkelit ovat pieniä ja heterogeenisiä kokonsa, sisältönsä sekä solukalvon koostumuksen puolesta. Tämän vuoksi niiden karakterisoinnissa sekä eristyksessä on yhä huomattavia haasteita, eikä selkeitä analyyttisiä ja kliinisiä ohjeistuksia ole kyetty muodostamaan. Tämän vuoksi vesikkelitutkimus kaipaa kipeästi standardoituja ja luotettavia menetelmiä niiden erotteluun ja karakterisointiin. Tässä tutkielmassa fysikaalisia ja immunokemiallisia menetelmiä sovellettiin verihiutaleperäisten EV-populaatioiden tarkasteluun. Verihiutalevesikkelit tuotettiin aktivoimalla niitä erilaisilla biokemiallisilla aktivaatiosignaaleilla. Ihmisten verihiutaleita aktivoitiin trombiinilla ja kollageenilla, sekä kalsiumionoforilla. Uutena verihiutaleaktivaattorina tutkimukseen otettiin mukaan tulehdusreaktiota kiihdyttävä S100A8/A9 -proteiinikompleksi. Aktivaattorien vaikutusta verihiutaleisiin sekä niiden erittämiin vesikkeleihin tutkittiin nanovirtaussytometrialla. Tuottuneiden vesikkelien kokojakaumaa arvioitiin nanopartikkelien jäljitysanalyysillä (Eng: nanoparticle tracking analysis, NTA) sekä asymmetrisellä poikittaisvirtauskenttävirtausfraktioinnilla (Eng: asymmetric flow field-flow fractionation, AF4), joka on uusi menetelmä vesikkelitutkimuksessa. Viimeiseksi vesikkelien solukalvomarkkereita tarkasteltiin uudella nanopartikkelien kuvantamismenetelmällä, joka perustuu fluoresoivien leimojen lokalisaatioon vesikkelin kalvolla ja jonka hyödyllisyyttä vesikkelitutkimuksessa haluttiin arvioida. Onnistuimme tuottamaan uusia vihjeitä tavoista, joilla verihiutaleet reagoivat solunulkoisiin tulehdus- ja kudosvauriosignaaleihin vesikkelien erityksen kautta. Kun verihiutaleiden aktivointimarkkereita tarkasteltiin virtaussytometrialla, S100A8/A9 proteiini aiheutti muutoksen kalvomarkkeriproteiinien jakautumisessa verihiutaleiden ja verihiutalevesikkelien pinnalla verrattuna trombiini- kollageeniaktivaatioon sekä aktivoimattomaan kontrolliin. Lisääntynyt TLT-1 markkerin pitoisuus yhdessä alentuneen integriini aIIbb3-ekspression kanssa viittaa ilmiöön, jossa S100A8/A9 olisi saanut verihiutaleet tuottamaan vesikkelejä eri tavoin pakatuista α-jyväsistä, sen sijaan että niitä erittyisi suoraan verihiutaleen solukalvolta. TLT-1 ekspression kasvu verrattuna P- selektiinimarkkerin laskuun verihiutalevesikkelien pinnalla saattaa johtua S100A8/A9:n aiheuttamasta muutoksesta, jossa verihiutale erikoistuu aktivoituessaan vesikkelieritykseen aggregaation sijaan. AF4 paljasti hienovaraisia, eri aktivaattoreiden aiheuttamia eroja verihiutalevesikkelien kokojakaumissa, joita ei kyetty erottamaan yhtä tarkasti jäljitysanalyysillä tai virtaussytometrialla. AF4-menetelmä optimoitiin pienten verihiutalevesikkelien tutkimukseen. Kun verihiutalevesikkelejä tarkasteltiin MALS-detektorilla, verihiutaleaktivaatio S100A8/A9-proteiinilla tuotti suurempia vesikkelejä, kuin trombiinilla ja kollageenilla aktivoidut verihiutaleet. AF4 on hellä ja monipuolinen menetelmä, jolla voidaan erotella verihiutalevesikkelien alapopulaatioita hyvin tarkasti ja on näin ollen erittäin lupaava menetelmä vesikkelien karakterisointiin ja fraktiointiin. Tulevaisuudessa AF4-MALS –menetelmä voitaisiin yhdistää fraktionkeräimeen, jolloin erotellut vesikkelipopulaatiot voidaan kerätä jatkokäsittelyä varten. Eräs jatkokäsittelymenetelmä voi tulevaisuudessa olla hyvin optimoitu nanokuvantaminen. Nämä menetelmät yhdistämällä saadaan tarkkaa tietoa vesikkelien monimuotoisista biologisista ominaisuuksista.Extracellular vesicles (EVs) are phospholipid bilayer-enclosed nanoparticles that are secreted by eukaryotic and prokaryotic cells. EVs carry macromolecules and signalling molecules to adjacent cells and play an important role in intercellular communication under both pathologic and homeostatic conditions. Therefore, they have become of significant interest for their therapeutic, diagnostic and prognostic potential. EVs are small and highly heterogeneous in size, shape, cargo and membrane composition, posing several challenges for establishing analytical and clinical guidelines. Therefore, EV research requires standardized and robust methods for their separation and characterization. In this study physical and immunochemical methods were employed to characterize human platelet-derived EVs (pEVs) generated from platelets activated with different external biochemical stimuli. The platelet-activating effect of the pro-inflammatory S100A8/A9 protein complex and a combination of thrombin and collagen were studied with nano flow cytometry. The size distribution of pEVs was studied with nanoparticle tracking analysis (NTA) and asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4), which represents a newly emerging method on the EV field. Finally, fluorescent labelling and co-localization analysis were employed to characterize membrane marker composition of pEVs and assess its usefulness as an analytic tool for EV research. We succeeded in providing new hints towards meaningful discoveries in platelet biology by characterizing the way platelets respond to inflammatory and hemostatic signals by shedding pEVs. When platelet activation markers are characterized with flow cytometry, the S100A8/A9 protein appeared to cause a shift in membrane activation markers when compared to the thrombin- collagen mix and the baseline control. Increased TLT-1 translocation and decreased integrin αIIbβ3 expression on pEV surfaces suggests that S100A8/A9 induced pEV secretion through differently packed platelet α-granules, rather than from the plasma membrane. An increase in TLT-1 expression compared to decreased P-selectin and αIIbβ3 suggests that S100A8/A9 stimulation shifts platelet phenotype towards secretion rather than aggregation. A protocol for small pEV separation with AF4-MALS was set up. With this method, subtle differences between small pEV populations were seen that were not distinguishable with NTA or flow cytometry. When investigated with AF4-MALS, S100A8/A9 induced pEVs appeared larger than those produced with thrombin- collagen activation. The mean particle sizes of the pEV populations obtained from activated platelets were generally also larger than those produced without an activator. We tested novel methods to detect subtle differences in small EV population sizes that are easily missed with conventional methods due to their technical limitations. A well-optimised AF4 protocol can detect different pEV subpopulations and is a promising tool for EV. In the future, when AF4 is combined with a MALS detector and a fraction collector, nanoimaging of fluorescently labelled EVs could be combined with it as a downstream application to obtain information on their versatile biological functions