Mecanismos de acción implicados en la bioactividad de flavonoides. Caenorhabditis elegans y líneas celulares como sistemas modelo

[ES] La mayoría de los estudios sobre actividad biológica de flavonoides se han centrado en la evaluación de su actividad antioxidante, fundamentalmente mediante ensayos en sistemas in vitro o ex vivo. Los ensayos con líneas celulares son una importante herramienta que permite entender como interactúan los compuestos a nivel celular y permiten obtener resultados sobre los efectos directos, por ejemplo, sobre células tumorales, o sobre células sanas para evaluar citotoxicidad. Sin embargo, en el organismo, para llegar a sus objetivos biológicos los flavonoides deben ser absorbidos y posteriormente transformados a diversos metabolitos, que son los que luego se distribuyen a los tejidos, de manera que los compuestos presentes a nivel celular son diferentes a los que se localizan originalmente en los alimentos. Son todavía escasos los estudios in vivo que permitan establecer no sólo los efectos biológicos de los distintos compuestos sino también aspectos como su biodisponibilidad, metabolismo u objetivos biológicos. En este sentido, los ensayos con organismos modelo, como el nematodo C. elegans, constituyen una alternativa adecuada para evaluar los efectos en un organismo completo e intentar dilucidar los mecanismos de acción a nivel celular o molecular antes de proceder a la evaluación en animales superiores incluido el hombre. El objetivo principal de este trabajo es evaluar los efectos de diferentes flavonoides en líneas celulares y en C. elegans, con el fin de contribuir a elucidar sus mecanismos de acción a nivel celular y/o molecular. Para ello se han planteado los siguientes objetivos específicos: 1. Evaluación de los efectos de diferentes flavonoides y sus metabolitos derivados, sobre diversas líneas celulares, tumorales y sanas. 2. Puesta a punto de un método para evaluar los niveles de daño en el ADN tras el tratamiento con diferentes flavonoides. 3. Desarrollo de metodologías para el análisis de la actividad de enzimas antioxidantes y de biomarcadores de daño oxidativo en C. elegans. 4. Ensayos para evaluar la influencia de flavonoides en la resistencia de C. elegans al daño oxidativo Los ensayos que se realizarán con el nematodo C. elegans y con líneas celulares no presentan repercusiones de tipo ético

Estudio de un modelo in vivo de los mecanismos de acción implicados en la actividad biológica de polifenoles

Trabajo de fin de grado. Grado en Biología. Curso académico 2016-2017Los flavonoides en la dieta se han relacionado con propiedades beneficiosas para la salud, lo cual ha sido atribuido en parte a sus propiedades antioxidantes, como se demostró en muchos estudios in vitro. En el organismo humano la mayoría de los flavonoides son poco biodisponibles y en gran medida biotransformados en diferentes metabolitos que podrían contribuir a los efectos biológicos de sus flavonoides originales. El ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DHPAA) es un metabolito mayoritario producido por la micriobiota del colon a partir de la quercetina, uno de los flavonoides más abundantes en la dieta humana. Sin embargo, se conoce poco acerca de la actividad y los mecanismos de acción de DHPAA. El objetivo de este trabajo fue examinar la influencia de DHPAA para modular el estrés oxidativo térmicamente inducido y los niveles intracelulares de especies reactivas de oxígeno (ROS) usando Caenorhabditis elegans como organismo modelo. Los resultados obtenidos apuntan a que el DHPAA fue capaz de aumentar la resistencia de C. elegans frente al estrés térmico en bajas dosis, pero produjo efectos perjudiciales en concentraciones más altas, lo que indica la existencia de un mecanismo de acción hormético. No se pudieron obtener conclusiones claras con respecto a la influencia de DHPAA para modular los niveles de RO

Mecanismos de acción implicados en la actividad biológica de compuesto fenólicos de la dieta: evaluación en el organismo caenorhabditis elegans

[ES] En las últimas décadas los compuestos fenólicos en general, y los flavonoides en particular, han despertado el interés de los investigadores como posibles responsables de los efectos saludables que se observan en estudios epidemiológicos que correlacionan la ingesta de dietas ricas en frutas y verduras con una menor incidencia de distintos tipos de enfermedades cardiovasculares o neurodegenerativas o distintos tipos de cáncer, entre otras. Sin embargo, siguen sin establecerse los mecanismos a través de los cuales los flavonoides ejercen las acciones biológicas observadas en los estudios in vitro o concluidas de los estudios epidemiológicos. En este contexto, el objetivo general de esta tesis es avanzar en el conocimiento de los mecanismos de acción responsables de los efectos biológicos asociados al consumo de alimentos ricos en flavonoides, utilizando Caenorhabditis elegans como organismo modelo. Para alcanzar este objetivo general se han llevado a cabo estudios con extractos ricos en compuestos fenólicos y con flavonoides aislados, concretamente con el flavanol epicatequina y el flavonol quercetina, utilizando distintas aproximaciones metodológicas, empleando tanto la cepa silvestre del nematodo como cepas mutantes y transgénicas. Los resultados han mostrado que el tratamiento con extractos de subproductos de vinificación ricos en polifenoles, produce en el nematodo una respuesta de tipo hormético y está influida por la composición fenólica cualitativa de los extractos. El tratamiento de C. elegans con epicatequina conduce a un aumento de la tolerancia al estrés térmico, así como a un descenso en los niveles de peroxidación lipídica y de proteínas carboniladas. Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que un aumento moderado de las especies reactivas de oxigeno podría ser beneficioso, posiblemente por conducir a una respuesta compensatoria estimulando los mecanismos endógenos de protección. Los efectos derivados del tratamiento con epicatequina parecen, al menos en parte, estar mediados por la regulación de la ruta de señalización de la insulina/IGF-1, ya que una variedad de mutantes con pérdida de función en genes clave de esta ruta (daf-2, age-1, akt-1, akt-2; sgk-1, daf-16, daf-18, skn-1 y hsf-1) no muestran el fenotipo termorresistente que este flavonoide proporciona en los gusanos silvestres. Además el tratamiento con epicatequina induce un aumento en la expresión de enzimas de fase II (GST-4) y de proteínas de choque térmico (HSP-16.2 y HSP-70), lo que mejoraría la capacidad de destoxificación y de eliminación de proteínas dañadas en el gusano. Estos mecanismos de acción no parecen verse modificados por la edad, aunque se produce un acentuado aumento en la expresión de HSP-16.2 en etapas más avanzadas de la vida de C. elegans. Al igual que en el caso de epicatequina, los genes age-1, akt-1, akt-2, daf-18, sgk-1, daf-2, skn-1 y hsp-16.2 también parecen estar implicados en la mejora de la resistencia al estrés observada tras el tratamiento con quercetina. Sin embargo, en este caso el efecto es independiente de daf-16 y hsf-1. El mecanismo de acción implicado en los efectos de quercetina tampoco parece verse modificado por la edad del gusano, aunque el tratamiento conduce a un aumento significativo en la expresión de las proteínas HSP-16.2 en gusanos mayores no observado en individuos jóvenes. Los resultados obtenidos en el presente trabajo ponen de manifiesto que no se puede asignar un mecanismo único de acción a los flavonoides, sino que pueden existir mecanismos diferentes según el compuesto, como denota el hecho de que epicatequina y quercetina, aun compartiendo elementos comunes en su actividad, ejercen distinta influencia sobre algunos de los componentes reguladores de la ruta de la insulina/IGF-1

Metabolitos fenólicos: preparación y evaluación de la actividad en sistemas modelo

[ES] Diversos estudios epidemiológicos han establecido una relación entre la ingesta de alimentos ricos en compuestos fenólicos y una menor incidencia de distintas patologías crónicas. Sin embargo, la contribución real de estos compuestos en el mantenimiento de la salud y los mecanismos subyacentes siguen sin esclarecerse. Los efectos sistémicos de los compuestos fenólicos se han relacionado tradicionalmente con sus propiedades antioxidantes y captadoras de radicales libres. Sin embargo, a medida que se ha avanzado en el conocimiento de su biodisponibilidad y metabolismo han surgido interrogantes sobre cuáles son los mecanismos de acción realmente implicados en la actividad biológica in vivo de estos compuestos. En este contexto, el objetivo general de esta tesis doctoral es profundizar en la implicación de los metabolitos fenólicos microbianos en los mecanismos subyacentes a la actividad biológica de los compuestos fenólicos de los alimentos, utilizando Caenorhabditis elegans como modelo. Para alcanzar este objetivo se han realizado estudios con diversos ácidos fenólicos (ácido protocatéquico (PCA), ácido vanílico, ácido 3,4-dihidroxifenilacético, ácido 3-(4-hidroxifenil)-propiónico, ácido dihidrocafeico y ácido cafeico), identificados como metabolitos de la degradación de polifenoles por la microbiota intestinal, utilizando distintas aproximaciones metodológicas en Caenorhabditis elegans. Además, se han iniciado los estudios para la preparación de derivados conjugados de ácidos fenólicos, ya que los mismos podrían representar una fracción relevante de los metabolitos circulantes en plasma tras el consumo de productos ricos en compuestos fenólicos y, por tanto, contribuir a sus efectos en el organismo. Los resultados han demostrado que los ácidos fenólicos estudiados conducen, en general, a efectos favorables sobre la resistencia al estrés oxidativo en C. elegans. No obstante, se observan diferencias en función de la concentración y del compuesto ensayados. En este sentido, parece apuntarse que el aumento de concentración por encima de determinados valores puede producir efectos adversos. En los ensayos realizados con los ácidos protocatéquico, cafeico y dihidrocafeico la modulación de los niveles de especies reactivas de oxígeno podría estar relacionada con la capacidad de estos compuestos para mejorar la resistencia al estrés térmico. Sin embargo, esta premisa no se cumple para el resto de los ácidos estudiados, por lo que no se puede establecer de forma general la existencia de una relación, al menos directa, entre niveles de especies reactivas de oxígeno y grado de resistencia a estrés del nematodo. El tratamiento con los ácidos cafeico y dihidrocafeico a las concentraciones ensayadas produce un aumento significativo en la vida media y máxima de C. elegans, resultado que no se observa en el caso del ácido protocatéquico. Los tres compuestos, sin embargo, mejoran la resistencia a estrés oxidativo, lo que parece indicar que subyacen mecanismos diferentes en los efectos inducidos por los mismos sobre longevidad y estrés oxidativo. Los resultados de expresión génica pusieron de manifiesto que los efectos favorables de los ácidos cafeico y dihidrocafeico sobre estrés oxidativo y longevidad podrían implicar la activación de varios genes relacionados con ruta de la insulina/IGF-1, en particular daf-16, daf-18, hsf-1 y sod-3, así como un gen de sirtuinas (sir-2.1). Sin embargo, en condiciones de estrés térmico solo se continuaba observando sobreexpresión de sod-3, mientras que se producía una disminución significativa en la expresión de hsf-1. Por último, se puso a punto un método para la preparación de sulfatos del ácido protocatéquico, que permitió obtener y caracterizar estructuralmente PCA-3-sulfato y PCA-4-sulfato. El procedimiento desarrollado hace posible disponer de estos metabolitos para realizar estudios in vitro e in vivo sobre la actividad biológica y mecanismos de los compuestos fenólicos de la dieta. Asimismo, los datos obtenidos sobre sus características analíticas, especialmente el comportamiento diferencial observado en los espectros UV, son también de gran utilidad para el empleo como referencias analíticas en la identificación de estos metabolitos en muestras de composición desconocida

Evaluación de los Efectos del Extracto Etanolico de Granos de Quinua (chenopodium quinoa willd) sobre el Comportamiento, Desenvolvimiento y Estrés Oxidativo en el Organismo Modelo caenorhabditis elegans

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza da Universidade Federal da Integração Latino-Americana, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Biotecnologia.La quinua es un pseudocereal muy conocido por su alto valor nutricional debido a sus aminoácidos, caracterizados como esenciales. No obstante, los fitoquímicos también demostraron efectos beneficiosos para la reducción de riesgos de enfermedades relacionadas al estrés oxidativo. Los antioxidantes son de gran envergadura para la prevención de la actuación de los radicales libres sobre nuestro organismo y el estrés oxidativo es el resultado de un desequilibrio. Este estudio utilizó el nematodo Caenorhaditis elegans cepa N2 (tipo salvaje) como organismo modelo para probar el efecto antioxidante, el comportamiento y el desenvolvimiento reproductivo del extracto etanólico de granos de quinua (Chenopodium quinoa Willd) (EECQ) obtenido a través del método Soxlhet. Para ello se hizo un tratamiento al C. elegans con extracto a 100,200,400 y 800 µg/ml con un vehículo de 1% etanol en medio buffer M9 durante 1 h en la etapa de adulto joven del nematodo para evaluar los efectos sobre el comportamiento, desarrollo y parámetros de crecimiento reproductivo. Para investigar los efectos antioxidantes del extracto se utilizó H2O2 a 200 mM como agente oxidante en los gusanos pre-tratados con EECQ y se evaluó la tasa de supervivencia bajo estrés oxidativo. El análisis estadístico se hizo mediante el sofware GraphPad Prism 9. El estudio tuvo resultados significativos encontrando un aumento de 27.8 % en latidos faríngeos y 16.4% en flexión de cuerpo del tratamiento a 400 y 800 µg/ml con respecto al control. Para el desarrollo reproductivo, no se encontraron cambios en los grupos con el tratamiento EECQ. En relación al estrés oxidativo se destacó la sobrevivencia de 57.3% a diferencia del grupo control que tuvo una estimativa menor a 20% de supervivencia. En conclusión, se mostró que el extracto presenta actividad antioxidante in vivo en el modelo estudiado

Influencia de la Curcuma Longa sobre Caenorhabditis elegans sometidos a Radiación Ultravioleta

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza da Universidade Federal da Integração Latino-Americana, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Biotecnologia.La genotoxicidad inducida por la acumulación de alteraciones del ADN, productos de la radiación solar incidente en la tierra por el deterioro de la capa de ozono, se asocian a patologías de curso crónico e invalidantes como el desarrollo de neoplasias humanas. Por tal motivo, los estudios in vivo sobre mutagénesis son cada vez más solicitados en el ámbito científico. El objetivo de este trabajo fue determinar la influencia del tratamiento con Curcuma longa antes (pre-UV 2, 4, 6. 8 mg/mL) y después (pos-UV 2,5, 7,5 y 10 mg/mL) de la exposición de los Caenorhabditis elegans a la radiación ultravioleta. Para el desarrollo de esta investigación se emplearon Caenorhabditis elegans de la cepa N2 (Wild type) sincronizados en la etapa larval L1. Se realizó la evaluación del parámetro de letalidad de los C. elegans expuestos a diferentes tiempos (10, 15, 20, 25 min.) de exposición UV. mediante una curva dosis respuesta, para determinar el tiempo de exposición (el tiempo seleccionado fue de 15 min.). Posteriormente se realizaron un pre y postratamiento con el extracto acuoso de cúrcuma sobre los gusanos expuestos a los 15 min de la radiación UV., con el cual se determinó el índice de sobrevivencia luego de 24 h y el de desenvolvimiento luego de 48 h. Los datos resultantes se analizaron mediante el análisis de ANOVA unidireccional y el test de comparación de múltiples Tukey, considerando como significativa una p<0.05. Los resultados preliminares mostraron un aumento significativo de la sobrevivencia en los gusanos pre y postratados con el extracto acuoso de cúrcuma en las diferentes concentraciones y expuestos a 15 min de radiación Ultravioleta luego de 24 h; así como el desenvolvimiento hasta la etapa larval L4 de los nematodos pretratados con el extracto acuoso de cúrcuma. Por tanto, concluimos que existe un potencial protector en los dos tipos de tratamientos sobre los C. elegans tratados

Caracterización de polifenoles y su acción sobre sirtuínas en modelos de inflamación intestinal y cáncer

Tesis descargada de TESEOEl estudio de los productos procedentes de la naturaleza, ya sean de plantas, animales invertebrados, o microorganismos, continúa siendo en la actualidad uno de los procedimientos más consistentes para el descubrimiento de nuevos compuestos que puedan dar lugar al desarrollo de fármacos. En este sentido, es interesante señalar que aproximadamente la mitad de los nuevos medicamentos introducidos entre 1981 y 2006 son derivados de productos naturales. De entre todos ellos, los polifenoles son uno de los grupos más estudiados; no obstante, las investigaciones con nuevas especies vegetales, los ensayos con extractos polifenólicos, así como la búsqueda de derivados con interés farmacológico está en claro desarrollo. Se tratan de metabolitos secundarios de plantas involucrados generalmente en los mecanismos de defensa frente agresiones externas. Con más de 8.000 variantes estructurales, la base estructural común es la presencia de uno o varios anillos fenólicos. La actividad antiradicales libres de los polifenoles está ampliamente descrita, constituyendo los antioxidantes más potentes presentes en nuestra dieta. Sin embargo se siguen investigando nuevas propiedades y en este sentido destaca la actividad antiinflamatoria. La inflamación es una reacción de la microcirculación que se caracteriza por la migración de las proteínas del suero y los leucocitos de la sangre al tejido extravascular. Esta migración se regula por la liberación secuencial de mediadores vasoactivos y quimiotácticos, tales como histamina, 5-OH-triptamina, moléculas de adhesión, y citocinas tales como el factor de necrosis tumoral-¿ (TNF-¿), o las interleucinas 1, 6, 8 y 10. Estos procesos se acompañan de un aumento de la temperatura local, enrojecimiento, hinchazón, dolor, y pérdida de la función del tejido, y a nivel celular los mecanismos de regulación son complejos involucrando a diversas vías de señalización. Son de gran interés las evidencias sobre las múltiples asociaciones entre las enfermedades inflamatorias crónicas y diferentes tipos de neoplasias; entre ellas están las que implican a la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y evolución hacia el cáncer de colon. La EII es un término utilizado para definir a un grupo de trastornos inflamatorios intestinales crónicos, afectando principalmente al intestino grueso, de etiología desconocida. Dentro de este grupo de trastornos están incluidas la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Ambas patologías se caracterizan por la aparición de una inflamación aguda recurrente de segmentos del intestino delgado y/o colon, con manifestaciones clínicas tanto intestinales como extraintestinales, que con frecuencia presentan recidivas. Las sirtuínas son histonas desacetilasas tipo III, ampliamente distribuidas en la naturaleza, con demostradas implicaciones en procesos como la inflamación, la senescencia celular, la diferenciación celular o el metabolismo. Su mecanismo de regulación se debe a su capacidad de desacetilar tanto histonas como proteínas no histonas. Existen numerosos estudios que muestran cómo el aumento de polifenoles en la dieta protege frente a enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares, inflamatorias y metabólicas, y se está discutiendo su papel en algunos procesos cancerosos, siempre consecuencia de la actividad desacetilasa de las sirtuínas. El resveratrol fue el primer compuesto polifenólico que demostró activar la sirtuína 1 (SIRT1), y ya se han descrito derivados que son hasta 800 veces más eficaces. La modulación de sirtuínas a través de otros reguladores, como la proteín cinasa activada por AMP (AMPK), es un campo de gran debate y estudio; además se está analizando la participación de ambas proteínas en la regulación del proceso de autofagia. En las investigaciones relacionadas con nuestro proyecto de tesis se ha estudiado la actividad biológica de algunos compuestos polifenólicos y su relación con las sirtuínas. Se han ensayado tanto compuestos puros (resveratrol y quercetina) como extractos enriquecidos en polifenoles (hojas de mango, hojas de uva), realizando estudios in vitro e in vivo. Concretamente: - Hemos valorado la actividad citotóxica en dos líneas celulares, la línea de leucemia monocitaria aguda humana (THP-1) y otra de adenocarcinoma de colon humano (HT-29). Si bien ninguno de los compuestos mostró actividad citotóxica con las diferentes dosis ensayadas, sí mostraron una reducción significativa en la producción de TNF-¿ en macrófagos THP-1 estimulados con lipopolisacárido bacteriano. Además, la expresión de SIRT1 se vio incrementada de manera significativa tras la exposición a los compuestos polifenólicos. - El primer estudio in vivo se han realizado con ratones deficientes en interleucina 10 (IL-10). Estos ratones knockouts se caracterizan por desarrollar de manera espontánea colitis inflamatoria que, a medida que la enfermedad avanza, puede derivar en cáncer de colon. La evaluación del proceso se ha realizado examinando y sacrificando ordenadamente los ratones a distintas edades, entre las 6 y las 18 semanas. Los resultados confirmaron que los animales deficientes en IL-10 desarrollaron una colitis inflamatoria a partir de la 6ª semana, cuya gravedad aumentó progresivamente a medida que la edad de los mismos avanzaba. En este sentido, los animales presentaron lesiones displásicas a partir de las 10 semanas, hallándose cierta correlación entre la gravedad de las lesiones yel proceso inflamatorio previo (escala). Además, se analizó la expresión colónica de SIRT1, presentando una marcada reducción en todos los grupos de animales KO para IL-10. Los resultados de este estudio también mostraron una activación de la autofagia en todos los grupos de ratones deficientes en IL-10, evidenciada por la acumulación de la proteína LC3-II, el incremento en la expresión de Beclin 1 y la disminución de los niveles de Bcl-2. - El segundo estudio in vivo consistió en evaluar el efecto de un extracto de hojas de mango, conteniendo un 60% de manguiferina, en un modelo agudo de colitis ulcerosa por administración de dextranosulfato sódico al 3% en el agua de bebida durante 7 días. Se emplearon distintos grupos entre los que se encontraba uno que recibió un tratamiento con resveratrol (50 mg/kg), como polifenol de referencia, y otros dos grupos de animales que recibieron el extracto de mango, a las dosis de 50 y 100 mg/kg. Los resultados mostraron que tanto el resveratrol como el extracto de hoja de mango podrían aliviar efectivamente la colitis, con incremento notable en la producción de moco, e inhibición de la infiltración neutrofílica y de mediadores inflamatorios incluyendo las citocinas TNF-¿ e IL-6, y la enzima COX-2. Además, los ratones tratados con resveratrol o el extracto de hoja de mango experimentaron un marcado incremento en la expresión de SIRT1 y pAMPK. Estos hallazgos sugieren que un papel destacado de los compuestos polifenólicos como estrategia terapéutica para el tratamiento de la fase activa de la colitis. - Con el fin de profundizar en el estudio de los efectos de los polifenoles como reguladores de sirtuínas, se realizaron nuevos ensayos con el nematodo Caenorhabditis elegans. Este organismo es un modelo muy empleado desde los años 70, sobre todo en estudios genéticos. El conocimiento actual de su genoma permite la elaboración de mutantes a la carta. Aunque en farmacología no es un modelo muy extendido, nos propusimos su empleo para detectar, además de los efectos sobre las sirtuínas, otras actividades que pudieran estar relacionadas. Uno de los mutantes utilizados para estos ensayos fue el mutante para el gen ire-1 (inositol requiring enzyme 1) que presentaba un mayor acúmulo de triglicéridos. La administración de metformina (100 mM), fármaco activador de AMPK, consiguió reducir la cantidad de triglicéridos acumulados en el interior del gusano, tanto en el mutante obeso como en los gusanos wild type (N2). Con el objeto de estudiar los posibles mecanismos por los cuales la metformina es capaz de revertir el ¿fenotipo obeso¿, se determinó la expresión de las lipasas FIL-1 y FIL-2 (del inglés fasting-induced lipase), activadas por ire1, así como los niveles de sir2.1, que es la sirtuína principal en C. elegans. Nuestros hallazgos sugieren que la metformina reduce la acumulación de triglicéridos a través del aumento en la expresión de las lipasas FIL-1 y FIL-2 en el fenotipo obeso, así como el incremento en los niveles de sir2.1 tanto en los gusanos wild type como en los mutantes obesos. El siguiente paso fue ensayar el efecto del resveratrol en la acumulación de triglicéridos en la cepa silvestre y en un mutante que no expresaba sirtuínas, el mutante sir2.1. El tratamiento de los gusanos con resveratrol (100 µM) mimetizó los efectos de la metformina, consiguiendo reducir el contenido de triglicéridos en los gusanos N2. Sin embargo, estos efectos desaparecieron al emplear el mutante sir2.1, ya que tras la administración del resveratrol o la metformina se pudo comprobar que este gusano no adelgazaba. Al igual que la metformina, el resveratrol no consiguió incrementar los niveles de las lipasas FIL-1 y FIL-2 en ninguna de las dos cepas. Estos resultados sugieren que el efecto adelgazante del resveratrol, al igual que la metformina, es dependiente de sirtuínas. Finalmente, se evaluó el efecto del extracto de hojas de mango sobre la longevidad del nematodo, en base a los estudios previos que demostraban que el resveratrol incrementaba este parámetro. En este sentido, los datos actuales sobre el incremento de longevidad mediante activadores de sirtuínas son muy discutidos. Nuestros resultados mostraron que el extracto de hojas de mango, a las concentraciones de 50 y 200 µg/mL no conseguía aumentar significativamente los días de vida del nematodo, aunque sí lograba que los gusanos tuvieran una vida media ligeramente mayor. La ¿teoría del soma¿ propone que el incremento de longevidad puede conseguirse, entre otros, por la reducción del tamaño, o por la restricción calórica. El tratamiento con el extracto de hoja de mango produjo cambios significativos en la longitud de los gusanos y en la ingesta de alimento (parámetro que está directamente relacionado con la restricción calórica) en la cepa N2 pero no así en la cepa sir2.1, por lo que el aumento de longevidad de los gusanos que recibieron el extracto parece dependiente de sirtuínas. Aun así se necesitan más estudios que relacionen de forma directa la estimulación de sirtuínas con el incremento de longevidad. En conclusión, tanto los estudios in vitro como los realizados in vivo demuestran los efectos beneficiosos de los polifenoles en inflamación con mecanismos que implican a la enzima SIRT1 como elemento clave de regulación de diferentes vías relacionadas

Analysis of the Rubus ulmifolius Schott associated endobacteriome, antifungal potential evaluation related with bacteria} volatilomes and study of Arthrobacter and Rhizobium strains influence on the gene expression variation related to oxidative stress tolerance of the in vivo model Caenorhabditis elegans

[ES]La población humana está en constante crecimiento y, a partir de la Revolución Industrial, experimentó un incremento exponencial descontrolado. La agricultura es la base de la alimentación humana y, para satisfacer la continua demanda de alimentos, ha tenido que evolucionar y mejorar para conseguir cultivos más eficientes. Los fertilizantes y pesticidas químicos son dos de los factores más importantes en la agricultura que aportan los nutrientes necesarios a los cultivos y los protegen de las enfermedades. El uso de los fertilizantes y de los pesticidas ha ido en aumento desde su incorporación a la agricultura. Entre el año 2000 y el 2021, el consumo mundial de fertilizantes aumentó en un 144,3%, mientras que el consumo de los pesticidas aumentó en un 162,3%. En la actualidad, se han descrito una serie de consecuencias negativas relacionadas con la salud ambiental y la humana, derivadas del uso excesivo de los compuestos agroquímicos. El exceso de estos productos que no son absorbidos por las plantas, son acumulados en los suelos. Estos, ya sea por la lluvia, la erosión del suelo, el riego o la infiltración, acaban en las aguas subterráneas y los acuíferos, lo que altera las características fisicoquímicas del agua y la contamina. Además, el uso excesivo de los pesticidas químicos ha dado lugar a la aparición de cepas de microorganismos fitopatógenos resistentes a estos compuestos, los cuales acaban perdiendo su efectividad y capacidad de control. Por esta razón, en los últimos años, las diferentes legislaciones gubernamentales y supragubernamentales se han vuelto más estrictas con respecto al uso de este tipo de compuestos químicos, por lo que es necesaria la búsqueda de alternativas más sostenibles. Una de las alternativas propuestas es el uso de bioestimulantes o biopesticidas. Por un lado, los bioestimulantes son compuestos formulados en base a microorganismos PGP (Plant Growth Promotion) que poseen diferentes mecanismos de acción que inducen el crecimiento vegetal. Por otro lado, los biopesticidas son formulados en base a microorganismos que poseen actividad antagonista frente a algún fitopatógeno, ya sea porque lo combaten o porque previenen la infección. La mayoría de estos microorganismos con interés agronómico utilizados para estos fines provienen o bien de los suelos, ya que están relacionados con la fertilidad y la productividad del suelo; o bien del interior de los tejidos vegetales, pues son organismos capaces de establecer relaciones ás estrechas con las plantas que los microorganismos edáficos. En este sentido, tanto los microorganismos edáficos como los que habitan en el interior de las plantas, llamados endófitos, pueden tener un rol activo en el mantenimiento de los sistemas agrícolas. El estudio de estos microorganismos y de sus interacciones con las plantas puede abrir nuevas puertas al desarrollo de nuevos bioestimulantes o biopesticidas. Los microorganismos del suelo desempeñan funciones que son esenciales para el mantenimiento de los ecosistemas. Además, inducen el crecimiento de las plantas y mejoran la salud vegetal, por lo que son considerados como un importante recurso para el mantenimiento de la sostenibilidad en los sistemas agrícola. La interacción entre las plantas y los microorganismos del suelo no es unidireccional, ya que las plantas también influyen en la microbiota edáfica. En este sentido, diversos estudios apoyan la teoría de que las plantas reclutan a microorganismos específicos mediante la liberación de exudados, que las ayudan en la adquisición de nutrientes y la mitigación de estreses tanto bióticos como abióticos. Estos microorganismos pueden colonizar los tejidos de la planta y establecerse en su interior, pasando a ser considerados microorganismos endófitos, los cuales ahora conforman el microbioma de la planta. Este conjunto de microorganismos está involucrado en el mantenimiento del estado de la salud y la nutrición óptima de la planta. El origen de los microorganismos que interaccionan con las plantas es diverso. La mayoría son reclutados a partir del suelo circundante, y conforman la microbiota rizosférica de la planta, mientras que otros provienen del ambiente aéreo y tienen una influencia determinante sobre la microbiota filosférica, en la superficie de los tejidos vegetales. Tanto los microorganismos que conforman la rizosfera como los que conforman la filosfera pueden acabar colonizando el interior de las plantas y así establecerse en la endosfera. Para ello, deben de atravesar y de penetrar los tejidos vegetales. Las estimaciones indican que el suelo rizosférico es el contribuyente mayoritario de la microbiota endófita de las plantas,contribuyendo con más de dos tercios de la diversidad bacteriana y la fúngica. Además, la composición de los ambientes endofíticos es diversa, variando no solo entre las plantas sino también entre los compartimentos de un mismo individuo. Dado que estos microorganismos están intrínsecamente ligados a la planta, es probable que muchos de ellos posean mecanismos beneficiosos para las plantas. Sin embargo, muchas de estas funciones siguen sin estar caracterizadas. Las nuevas técnicas de secuenciación masiva evitan algunas de las limitaciones asociadas al cultivo de microorganismos ya que permiten analizar toda la comunidad, incluidas las células que están inactivas. Estos microorganismos pueden contar con diferentes mecanismos que sirvan para el desarrollo de bioestimulantes o biopesticidas. Por un lado, los bioestimulantes cuentan con mecanismos de promoción del crecimiento vegetal, que facilitan la adquisición de nutrientes como el nitrógeno, el fósforo, el potasio o el hierro o intervienen en la regulación hormonal de la planta. Por otro lado, los biopesticidas cuentan con mecanismos de protección frente a patógenos, como la producción de moléculas antibióticas o la inducción de la resistencia sistémica en la planta

Determinación de los principios bioactivos, propiedades farmacológicas y antioxidantes de tres extractos medicinales de Echinacea para su control de calidad y estandarización

Background: The Echinacea genus belongs to the Asteraceae family and is composed of 9 species, of which E. pallida, E. angustifolia and E. purpurea are used as medicinal plants. Sales of medicinal extractsderived from these three Echinacea species reached 21 million dollars in 2002, however, it is important to mention that these extracts are being commercialized without adequate control over the standardization process, defining standardization not only as phytosanitary and agronomic regulation but also including variables that correlate the chemical content with some biological effect, decreasing the therapeutic variability, which is the main problem with herbal treatments. Because of all the above, the principal objective of the present work was to evaluate the chemical, antioxidant, anti-inflammatory, hypoglycemic and antiproliferative capacities of three hydro-alcoholic Echinacea extracts in order to establish the bases for their characterization and the future oftheir standardization. Materials and methods: Three Echinacea extracts were selected. These extracts meet the first step of the standardization process which implies the manufacturing standards described by the United States Department of Agriculture (USDA), where the main requirement is the traceability of the product and the guarantee of origin. The selected extracts were prepared by two different manufacturers using different organs or tissues. Extract A (Echinacea®) was prepared with roots of E. purpurea, extract B (Super Echinacea®) was prepared with roots, leaves, flowers and seeds of E. purpurea and extract C (Echinacea Supreme®) was prepared with roots and aerial parts of E. purpurea and roots of E. angustifolia. The three selected extracts were applied a standardization protocol as proposed by our investigation group and published in 2014, which takes into account three phases subsequent to those included in the post phytosanitary and agronomic production standards established by USDA.These steps were 1) Physical analyses; density and dry matter were assessed. 2) Chemical analyses; some qualitative tests were performed to determine the presence of some functional groups (tannins, saponins, coumarins, anthraquinones and alkaloids), as well as some specific constituents related to functional properties like total phenols, flavonoids, caffeic and chlorogenic acid, sugars and alkylamides. 3) Biological analyses; antioxidant and antiproliferative capacities were measured in vitro and the anti-inflammatory, hypoglycaemic and thermotolerance effects were measured in vivo. Finally, some associations were made between the chemical compounds and the biological measurements. Results: this study showed differences between the three stages of standardization, highlighting some observations that were considered relevant. At first, we observed that both the dry matter and the density were significantly higher in extract C. In the second stage we found that extract A presented higher amounts of total phenols (975.5 mg GAE/gdw) and total flavonoids (6.8 mg QE/ gdw) when expressed in terms of dry weight, a tendency that is modified when the results are expressed as mL of each Echinacea extract. In this case extract C presented higher amounts of phenols and flavonoids compared to the other extracts, which is very important because these types of compounds are dosed with mL of extract. Caffeic acid was only detected in extract C (0.048 ppm) and by analysis of the non-polar fraction of the hydro-alcoholic extracts, 11 alkylamides were determined for extracts A and B and 14 for extract C. In the third stage, extract C showed higher antioxidant capacity when determined by DPPH (19.97 mM TEAC/ gdw; 4.77 mM TEAC/ mL extract) and when determined by ABTS, extract A showed higher antioxidant capacity (70.09 mM TEAC/ gdw), however, when expressed as mL of extract, extract C showed a higher antioxidant capacity (10.45 mM TEAC/ mL extract). Only extract B showed anti-inflammatory activity, extract C showed antiproliferative capacity, extracts A and C showed hyperglycaemic capacity. Discussion: Certain tendencies can be observed that allow us to relate some of the chemical compounds with a biological effect. Extract C showed higher contents of phenols and flavonoids which can be related to higher antioxidant capacity by both DPPH and ABTS. Even when the content of total phenolic compounds was observed to be high, a very low content of caffeic acid was observed, leaving unknown which types of phenolic compounds are present. Extract C also showed a higher number of alkylamides which could be associated to its antiproliferative effect shown only in this extract. Three of these alkylamides were only observed in extract C which is the only one that contains E. angustioflia, which could indicate that they may be used as possible species markers. The anti inflammatory effect observed in extract B could be related to the presence of saponins observed in the qualitative analyses. There is evidence in related literature that these types of compounds are related to anti-inflammatory processes, even though it is important to note that saponins are a very diverse group and for this reason it would be interesting to study them in more detail, starting with the aerial parts of Echinacea which is what extract B is made of and focusing on terpenoids, because within the group of saponins, terpenoids are frequently associated with this kind of pharmacological effect. Conclusions: We observed differences in the physical, chemical and biological parameters showing the need to plan standardization strategies, carry out correlation studies in finer detail that allow us to conclude the proposed association raised in this study, advancethe adequate use of herbal medicine and generate chemical content data related to biological effects. These data need to be added to the current protocols, which are mostly based on ensuring the safety and identity of the product.Antecedentes: El género Echinacea pertenece a la familia Asteraceae y está compuesto de 9 especies de las cuales sólo E. pallida, E. angustifolia y E. purpurease emplean como plantas medicinales. Las ventas de los extractos medicinales en donde se emplean estas tres especies ascendierona 21 millones de dólares en el 2002.Sin embargo, es importante aclarar que estos extractos son comercializados sin tener un control adecuado en el proceso de estandarización, definiendo estandarización no solo como la regulación fitosanitaria y agronómica sino incluyendo además variables que correlacionen el contenido químico con algún efecto biológico, disminuyendo con ello la variabilidad terapéutica la cual es el principal problema de los tratamientos herbales.Es por ello que en el presente trabajo se contempló comoobjetivo principal evaluar el contenido químico, capacidad antioxidante, antiinflamatoria, hipoglucemiante y antiproliferativa de tres extractos hidroalcohólicos de Echinacea, con el fin de establecer las bases para su caracterización y a futuro de su estandarización. Materiales y Métodos: Se seleccionaron tres extractos de Echinaceaque cumplen con la primera etapa de estandarización que corresponde a las normas de manufactura descritas por United States Department of Agriculture(USDA), en las que el principal requisito es la trazabilidad del producto y la garantía de origen.Los extractos seleccionados con esta condiciónfueron preparados por dos casas comerciales diferentes empleando distintos órganos o tejidos:extracto A (Echinacea®)el cual fue elaborado con raíces de Echinacea purpurea; extracto B (Super Echinacea®) elaborado con raíces, hojas, flores y semillas de E. purpurea y el extracto C (Echinacea Supreme®) elaborado con raíces y partes aéreas de E. purpurea y raíces de E. angustifolia. A los tres extractos seleccionados en el estudio,se lesaplicó un protocolo de estandarización propuesto por el grupo de investigación y publicado en el 2014,que contempla tres etapasadicionales a las incluidas en las normas fitosanitarias y de producción agronómicas establecidas por USDA.Estas etapasfueron: 1) Análisis físico:Se determinó la densidad y cantidad de materia seca. 2) Análisis químico: Se realizaron ensayos cualitativos para determinar la presencia de algunos grupos fitoquímicos(taninos, saponinas, cumarinas, antraquinonas y alcaloides), así como la determinación de algunos constituyentes específicos relacionados con las propiedades funcionales como son fenólicos totales, flavonoides totales, ácido cafeico, ácido clorogénico,azúcares yalquilamidas. 3) Análisis biológico: Se determinó la capacidad antioxidante yantiproliferativain vitro, así como el efecto antiinflamatorio, hipoglucemiante y de termotoleranciain vivo. Finalmente, se asoció la presencia de los compuestos químicos con algunos efectos biológicos.Resultados:El estudio mostródiferencias en los tres parámetros de estandarización.Seobservó que tanto la cantidad de materia secacomo la densidad fueron significativamente mayoresen el extracto C. En la segunda etapa se encontró queel extracto A presentóla mayor cantidad de compuestos fenólicos totales (975.5 mg EAG/gps) y flavonoides totales (6.8 mg EQ/gps), en base seca, tendencia que se modifica al analizarlo por mL de extracto hidroalcohólico, en queel extracto C mostró los valores más altos comparado con los otros dos extractos estudiados, lo cual es de suma importancia ya que este tipo de compuestos se dosifican por mL de extracto.La presencia del ácido cafeico sólo se encontró en el extracto C (0.048 ppm).Del análisis de la fracción no polar del extracto hidroalcohólico seencontraron11 alquilamidas para los extractos A y B, y 14 para el extracto C. En relación a la tercera etapa, la capacidad antioxidante fue mayor en el extracto C cuando se determinó por el método de DPPH (19.97 mM/ gps; 4.77 mM/ mL extracto)y cuando se determinó por ABTS, la capacidad antioxidantefue mayor en el extracto A (70.09 mM/ gps);sin embargo, la tendencia cambiócuando se expresó por mL de extracto, en que se observóla mayor capacidad antioxidanteen el extracto C (10.45 mM/mL extracto).Se observó también efecto antiinflamatorio para el extracto B, efecto antiproliferativo para el extracto C y efecto hipoglucemiante para los extractos A y C. Discusión. Se puedenobservar ciertas tendencias que nos permiten asociar algunos componentes químicos con los efectos biológicos, tales como mayores cantidades de compuestos fenólicos totales y flavonoides totales para el extracto Cexpresado por mL de extracto,esto se puede asociar con lo observado en la determinación de capacidad antioxidantes por los métodos deDPPH y ABTSen los que el extracto C mostró la mayor capacidad antioxidante.Aunque la cantidad de fenoles totales fue abundante, la cantidad de ácido cafeico fue muy baja, quedando la incógnita de qué tipo de compuestos polifenólicos están presentes en el extracto. Por otra parte, en el extracto C se encontró elmayor número dealquilamidas, lo cual podría asociarse al efecto antiproliferativo observado en este extracto.Tres de estas alquilamidas sólo se observaron en el extracto C que es el único que contiene E. angustifolia lo que podría indicar que pueden ser utilizadas como marcadores de especie. El efecto antiinflamatorio que se observó para el extracto B se podría correlacionar con la presencia de saponinas existiendo evidencia en la literatura de compuestos de este tipo asociados a procesos antiinflamatorios, aunque es importante mencionar que las saponinas son un grupo muy diverso lo cual sería interesante evaluar este grupo de compuestos de manera específica iniciando por parte aéreas donde observó la mayor cantidad y centrándonos en terpenoides que dentro de las saponinas son los que se asocian frecuentemente a este tipo de efecto farmacológico. Conclusiones. Se observaron diferencias en los parámetros físicos, químicos y biológicos en los tres extractos evaluados, mostrando la necesidad de plantear estrategias de estandarización llevando a cabo estudios que establezcan una correlación de una manera más fina y que permitan concluir la propuesta de asociación planteada en este estudio, avanzando con ello en el uso adecuado de los medicamentos herbales generando datos de composición química y efecto biológico, datos que se deben sumar a los protocolos actuales que se basan en su mayoría en garantizar la inocuidad e identidad del producto

Efecto antiinflamatorio comparativo de la emulsión dérmica conteniendo extracto etanólico de peperomia choroniana D.CD. (ipintaqui, corazón), con diclofenaco y dexametasona sobre la inflamación auricular inducida en ratones

Determina el efecto antiinflamatorio de la emulsión dérmica conteniendo extracto etanólico de la parte aérea Peperomia choroniana (ipintaqui, corazón) al 0,1 %, 0,5 % y 1 % sobre la inflamación auricular inducida en ratones comparado al efecto del diclofenaco gel 1% y dexametasona crema 0,05%. Se elaboró un edema auricular inducido por Xilol, en 48 ratones Swiss machos (27±2.5g), aleatoriamente se dividieron en 6 grupos; indicadores: 1) edema auricular (mg); 2) cambio de color (ausente, leve, moderado e intensa); 3) temperatura auricular (º C) y 4) estudio histopatológico (número elementos formes pro inflamatorios presentes o ausentes). Resultados: la dexametasona, diclofenaco, emulsión 0,1%, emulsión 0,5%, emulsión 1.0% mostraron cifras de 81.6%, 48.2%, 39.4%, 54.6%, 51.1% correspondientemente (todos a p<0.05); con reducción de elementos inflamatorios al estudio histopatológico. Se concluye que en las condiciones experimentales se ha demostrado que la emulsión dérmica con extracto de Peperomia choroniana presenta efecto antiinflamatorio, siendo menor que dexametasona y a mayor concentración es mejor que diclofenaco sobre el edema auricular inducido con Xilol en ratones