The Role of Non-Coding RNAs in the Human Placenta

Non-coding RNAs (ncRNAs) play a central and regulatory role in almost all cells, organs, and species, which has been broadly recognized since the human ENCODE project and several other genome projects. Nevertheless, a small fraction of ncRNAs have been identified, and in the placenta they have been investigated very marginally. To date, most examples of ncRNAs which have been identified to be specific for fetal tissues, including placenta, are members of the group of microRNAs (miRNAs). Due to their quantity, it can be expected that the fairly larger group of other ncRNAs exerts far stronger effects than miRNAs. The syncytiotrophoblast of fetal origin forms the interface between fetus and mother, and releases permanently extracellular vesicles (EVs) into the maternal circulation which contain fetal proteins and RNA, including ncRNA, for communication with neighboring and distant maternal cells. Disorders of ncRNA in placental tissue, especially in trophoblast cells, and in EVs seem to be involved in pregnancy disorders, potentially as a cause or consequence. This review summarizes the current knowledge on placental ncRNA, their transport in EVs, and their involvement and pregnancy pathologies, as well as their potential for novel diagnostic tools

Molecular and Cellular Mechanisms of Preeclampsia

This Special Issue on the “Molecular and Cellular Mechanisms of Preeclampsia” belongs to the section “Molecular Pathology, Diagnostics, and Therapeutics” of the International Journal of Molecular Sciences. It was a very successful Special Issue as it contains 20 published papers, including one editorial, nine original research papers, and ten reviews on the topic. The original publications cover a wide spectrum of topics, including alterations and involvement of specific factors during preeclampsia, new non-invasive technologies to identify changes, new treatment options, animal models, gender aspects, and effects of the pregnancy pathology later in life. The review publications again cover a wide spectrum of topics, including factors and pathways involved in preeclampsia, effects on the maternal vascular and immune systems, effects on the placenta and the trophoblast, epigenetic changes, new preventive strategies, and new views on the current hypotheses on preeclampsia. Taken together, this Special Issue gives a fantastic overview on a broad spectrum of topics, all of which are important to identify the real etiology of preeclampsia and to finally develop real treatment options

IDENTIFICATION OF HYPOXIA-REGULATED MICRORNAs IN MATERNAL BLOOD AS EARLY PERIPHERAL BIOMARKERS FOR FETAL GROWTH RESTRICTION

Current tests available to diagnose fetal hypoxia in-utero lack sensitivity thus failing to identify many fetuses at risk. Emerging evidence suggests that microRNAs derived from the placenta circulate in the maternal blood during pregnancy and may be used as non-invasive biomarkers for pregnancy complications. With the intent to identify putative markers of fetal growth restriction(FGR) and new therapeutic druggable targets, we examined, in maternal blood samples, the expression of a group of microRNAs, known to be regulated by hypoxia. The expression of microRNAs was evaluated in maternal plasma samples collected from (1) women carrying a preterm FGR fetus(FGR group) or (2) women with an appropriately grown fetus matched at the same gestational age (Control group). To discriminate between early- and late-onset FGR, the study population was divided into two subgroups according to the gestational age at delivery. Four microRNAs were identified as possible candidate for the diagnosis of FGR: miR-16-5p, miR-103-3p, miR-107-3p, and miR-27b-3p that were upregulated in FGR blood samples before the 32nd week of gestation as compared to aged matched control group. By contrast, miRNA103-3p and miRNA107-3p analyzed between the 32nd and 37th week of gestation showed lower expression in the FGR group compared to aged matched controls. Notably, the expression of all miRNAs was increased through gestation in healthy control group. Our results showed that measurement of miRNAs in maternal blood may form the basis for a future diagnostic test to determine the degree of fetal hypoxia in FGR, thus allowing the start of appropriate therapeutic strategies in order to alleviate the burden of this disease

Genetic Susceptibility to Preeclampsia: Studies on the Nord-Trøndelag Health Study (HUNT) Cohort, an Australian/New Zealand Family Cohort and Decidua Basalis Tissue

Genetisk disposisjon for utvikling av svangerskapsforgiftning : Studier fra Helseundersøkelsen i Nord-Trøndelag, en familiekohort fra Australia/New Zealand og decidua basalis vev Svangerskapsforgiftning er en alvorlig komplikasjon ved graviditet, og på verdensbasis bidrar tilstanden til økt sykelighet og dødelighet for både mor og foster. Både arvelige og miljø-/livsstilsfaktorer kan påvirke risikoen for utvikling av svangerskapsforgiftning. Selv om det fortsatt er uklart hva som forårsaker sykdommen, har forståelsen økt de siste årene, og genetisk forskning har vært en viktig bidragsyter i dette. Når morkaken fester seg til livmorveggen, bryter morkakens celler ned muskellaget i livmorens forsynende blodårer, slik at morkaken etter hvert får god blodgjennomstrømning med tilgang på surstoff og næring til fosteret. Et uheldig samspill mellom fosteret og mors immunsystem ser ut til å være sentralt i sykdomsutviklingen ved svangerskapsforgiftning. Det kliniske bildet er preget av en overdrevet betennelsesreaksjon og sirkulatoriske forandringer. Dette sees også ved hjerte-kar lidelser, og svangerskapsforgiftning deler mange risikofaktorer med disse sykdommene. Kvinner som har hatt svangerskapsforgiftning har dessuten økt risiko for hjerte-kar lidelser senere i livet. Svangerskapsforgiftning viser en klar opphopning i familier, og ulike modeller for det genetiske bakteppet er blitt foreslått. Etter at man kartla hele den menneskelige arvestoffsekvensen (2003) kunne man begynne å analysere markører som er spredt i hele arvestoffet for å finne områder som påvirker risikoen for komplekse sykdommer som kreft, hjerte-kar sykdom og svangerskapsforgiftning. Da man begynte dette arbeidet trodde man at man i fremtiden ville kunne forutse sykdom hos enkeltpersoner ved å lese arvestoffsekvensen deres. Nå, syv år senere, har den teknologiske utviklingen snart gjort det mulig å lese hele arvestoffsekvensen til en person relativt raskt og til en overkommelig pris. Den genetiske forskningen som er gjort i løpet av disse årene har imidlertid endret vårt syn både på hvor stabilt og upåvirkelig arvestoffet er, og på hvor allmenn variasjonen som kan gi sykdom er. Med utgangspunkt i den andre Helseundersøkelsen i Nord-Trøndelag (HUNT2) og Norsk Fødselsregister, har vi identifisert en relativt stor populasjonskohort av kvinner som har hatt svangerskapsforgiftning og kvinner som har hatt normale svangerskap. Kohorten er godt kartlagt med epidemiologiske data og vi har tilgang til blodprøver med mulighet for analyse av biokjemiske markører og isolering av arvestoff. Dette har gjort det mulig for oss å evaluere genetiske funn gjort i andre populasjoner. Vi har også undersøkt det globale genuttrykket i en samling av prøver tatt fra decidua basalis, møtepunktet for morkake og livmorvegg/mors blodårer, hos kvinner med kompliserte og normale svangerskap. De funnene som presenteres i artiklene inkludert i denne tesen må sees i sammenheng med annen forskning for å kunne bidra til en økt forståelse av det genetiske og biologiske grunnlaget for svangerskapsforgiftning. Resultatene støtter teorien om at en forstyrret immunbalanse har betydning. Vi har knyttet TNFSF13B, et gen som er med på å regulere immuncellers aktiveringsgrad og funksjon, til svangerskapsforgiftning i den australske familiekohorten. Tidligere har dette genet vært vist å disponere for spontanabort. Vi viser også at en av de biologiske prosessene som ser ut til å være mest forstyrret ved svangerskapsforgiftning, er tryptofan metabolismen, som har betydning for normal utvikling av immunceller. Både STOX1 og notch signalveier er involvert i nydannelse av blodårer og har vært knyttet til både svangerskapsforgiftning og nevrodegenerative sykdommer. Det er derfor fremsatt en teori om at disse tilstandene kan ha et felles genetisk grunnlag, og våre observasjoner støtter betydningen av disse prosessene for utvikling av svangerskapsforgiftning. Variasjon i COMT  genet har vært vist å ha betydning både for utvikling av hjerte-kar sykdom og svangerskapsforgiftning, via regulering av cellens respons på lav oksygentilførsel. Vi bekrefter at dette genet kan bidra til risiko for svangerskapsforgiftning. Flere av forandringen som vi finner i genuttrykks studien bekrefter også den tette forbindelsen mellom oksygenering-reoksygenerings skader og svangerskapsforgiftning. Oppsummert har vi i løpet av de årene dette prosjektet har pågått opplevd en revolusjon i hvordan vi ser på genetisk variasjon som grunnlag for sykdomsutvikling. Vi har også opplevd en økende forståelse for de biologiske mekanismene som ligger bak utvikling av svangerskapsforgiftning. De funnene som presenteres her bidrar til noe av denne økte forståelsen og åpner for flere nye spørsmål. Videre forskning på dette feltet er nødvendig.  PhD i molekylærmedisi

Quantification of Placental Dysfunction in Pregnancy Complications

Background The pathogenetic mechanisms behind placental dysfunction-related complications like preeclampsia and intrauterine growth restriction have remained perplexing till now, in part because of lack of well-defined structural and functional molecular characterisation. There is growing evidence that links trophoblast debris and the existence of syncytial nuclear aggregates (SNA) to the pathogenesis of gestational diseases. Characterisation and quantification of structural and functional parameters of placental dysfunction may give researchers a clearer picture of the mechanisms underlying the development of high risk pregnancy. Methods Placental samples were obtained from normal term pregnancies, preterm controls, as well as from pregnancies complicated by preeclampsia (PET), intrauterine growth restriction (IUGR) and PET-IUGR. Formalin-fixed, paraffin-embedded sections were visualised with H&E, stained using immunohistochemistry (IHC) and digitally scanned. Using stereological methodology, volumes of placental SNAs, trophoblasts, villi and capillaries were measured. Three dimensional (3D) volume reconstructions of terminal placental villi with SNAs and fibrinoid degenerations were created. IHC-labelled slides were analysed by image analysis algorithms. Differential expression of placental genes and miRNAs, hypothesised to regulate cell death in placental dysfunction, were quantified using RT-qPCR. BeWo cell lines were carried out for in vitro validation of the effects miRNAs regulating programmed cell death (PCD) using flow cytometry and western blotting. Results Specific morphometric patterns of villous, trophoblasts, SNA and capillary volumes were demonstrated with characteristic higher SNAs and lower capillary volumes in PET placentae with reciprocal patterns in IUGR placentae showing a negative correlation pattern between nuclear aggregates and capillary volumes. Image analysis of immune-labelled slides showed a higher autophagy marker expression in PET and a positive correlation to SNAs as well as a balanced reciprocal expression patterns with apoptosis. Moreover, miR-204 transfected BeWo cells showed a similar balanced reciprocal regulation of autophagy and apoptosis expressions. Conclusion We have demonstrated that applying stereology-based and image analysis on digitised placental sections can be useful in quantifying and dissecting structural and functional patterns in normal and abnormal placental function. 3D reconstruction model are a novel approach towards placental characterisation in normal and complicated pregnancies. The study also showed that miR-204 plays a vital role in the regulation of placental autophagy and apoptosis, critical in the pathophysiology of placental dysfunction

Quantification of Placental Dysfunction in Pregnancy Complications

Background The pathogenetic mechanisms behind placental dysfunction-related complications like preeclampsia and intrauterine growth restriction have remained perplexing till now, in part because of lack of well-defined structural and functional molecular characterisation. There is growing evidence that links trophoblast debris and the existence of syncytial nuclear aggregates (SNA) to the pathogenesis of gestational diseases. Characterisation and quantification of structural and functional parameters of placental dysfunction may give researchers a clearer picture of the mechanisms underlying the development of high risk pregnancy. Methods Placental samples were obtained from normal term pregnancies, preterm controls, as well as from pregnancies complicated by preeclampsia (PET), intrauterine growth restriction (IUGR) and PET-IUGR. Formalin-fixed, paraffin-embedded sections were visualised with H&E, stained using immunohistochemistry (IHC) and digitally scanned. Using stereological methodology, volumes of placental SNAs, trophoblasts, villi and capillaries were measured. Three dimensional (3D) volume reconstructions of terminal placental villi with SNAs and fibrinoid degenerations were created. IHC-labelled slides were analysed by image analysis algorithms. Differential expression of placental genes and miRNAs, hypothesised to regulate cell death in placental dysfunction, were quantified using RT-qPCR. BeWo cell lines were carried out for in vitro validation of the effects miRNAs regulating programmed cell death (PCD) using flow cytometry and western blotting. Results Specific morphometric patterns of villous, trophoblasts, SNA and capillary volumes were demonstrated with characteristic higher SNAs and lower capillary volumes in PET placentae with reciprocal patterns in IUGR placentae showing a negative correlation pattern between nuclear aggregates and capillary volumes. Image analysis of immune-labelled slides showed a higher autophagy marker expression in PET and a positive correlation to SNAs as well as a balanced reciprocal expression patterns with apoptosis. Moreover, miR-204 transfected BeWo cells showed a similar balanced reciprocal regulation of autophagy and apoptosis expressions. Conclusion We have demonstrated that applying stereology-based and image analysis on digitised placental sections can be useful in quantifying and dissecting structural and functional patterns in normal and abnormal placental function. 3D reconstruction model are a novel approach towards placental characterisation in normal and complicated pregnancies. The study also showed that miR-204 plays a vital role in the regulation of placental autophagy and apoptosis, critical in the pathophysiology of placental dysfunction

Characterization of cellular signalling pathways involved in the regulation of trophoblast cell functions

This publication based doctoral thesis comprises six manuscripts covering the intracellular signaling pathways activated by LIF and OSM and the functional analysis of miR-21 in trophoblastic cells. The aim of this thesis was to elucidate the signaling pathways activated by the cytokines LIF and OSM as well as the role of specific miRNAs in the control of trophoblast cell functions. The results demonstrate that LIF and OSM have similar functions in activating STAT3 and ERK1/2 by changing their phosphorylation status in four trophoblastic cell lines. However, LIF but not OSM significantly increases invasion of trophoblastic cell lines. Inhibition of STAT3 decreases the invasiveness of trophoblastic cell lines by inhibiting the secretion of matrix metalloproteinases (MMPs). These results suggest that LIF shares STAT3 and ERK1/2 activation with OSM but their resulting responses are cell type dependent. The second part of this dissertation is focused on placenta-specific miRNAs and their function on trophoblast cells. The miRNA profile of primary cells includes the expression of at three clusters which are specifically expressed in placenta tissue: C19MC, C14MC and the miR-371-3 cluster. C19MC is highly expressed in third trimester trophoblast cells and in choriocarcinoma cell lines. C14MC is highest expressed in first trimester trophoblast cells as well as in HTR-8/SVneo cells and its plasma concentration decreases with the gestational age. Both miRNA clusters are evolutionary related to the appearance of placenta and their dysregulation can be associated with pregnancy pathologies. In conclusion, this work describes the intercellular signaling pathways activated by OSM and LIF, as well as the function of miR-21 in trophoblastic cells. Moreover, it may provide novel information on their involvement in the pathogenesis of pregnancy-related disorders which may be useful for the design of future non-invasive diagnostic tools or for the development of new therapeutic approaches

Mechanisms involved in the pathogenesis of pre-eclampsia and fetal growth restriction: Transcriptional analyses of placental and decidual tissue

Mekanismer relatert til utvikling av svangerskapsforgiftning og føtal veksthemming Genekspresjonsanalyser av placenta og decidua vev Svangerskapsforgiftning (preeklampsi) og føtal veksthemming er alvorlige svangerskapskomplikasjoner og viktige årsaker til økt sykelighet og død hos gravide kvinner og deres avkom. Selv om forståelsen av hvordan disse tilstandene oppstår har økt de siste årene, er det fortsatt manglende kunnskap rundt mekanismene som bidrar. En rekke observasjoner tyder på at en mangelfull utvikling av morkaken (placenta) kan ligge til grunn. I et normalt svangerskap vil trofoblaster (morkakeceller) invadere og omdanne morkakens tilførende blodkar for å sørge for stabil blodtilførsel til morkaken og fosteret under graviditeten. Ved preeklampsi og føtal veksthemming er denne prosessen ufullstendig, noe som kan resultere i utilstrekkelig tilførsel av blod og næringsstoffer til fosteret, morkaken og det underliggende vevet (decidua). Videre vil en ”syk” morkake respondere på redusert blodtilførsel ved å skille ut faktorer til kvinnens sirkulasjon som kan forårsake skade på karendotelet, og føre til høyt blodtrykk og protein i urinen (tegn på preeklampsi) hos affiserte kvinner. Hensikten med arbeidet som presenteres i denne avhandlingen har vært å kartlegge hvilke molekylære mekanismer som er assosiert med mangelfull morkakedannelse ved preeklampsi og føtal veksthemming. For å gjøre dette, har vi blant annet tatt i bruk genekspresjonsanalyser, hvor det er mulig å måle uttrykket av titalls tusen gener i én analyse. Resultatene fra disse analysene viste at kvinner med preeklampsi i kombinasjon med føtal veksthemming har økt genuttrykk av faktorer som påvirker kardannelse negativt i morkaken sammenlignet med kvinner med isolert preeklampsi eller føtal veksthemming (studie I). Når disse faktorene skilles ut til mors sirkulasjon kan de bidra til utvikling av preeklampsi. Nivået av disse faktorene i morkakevevet ser ut til å ha sammenheng med alvorlighetsgrad av sykdom. Videre fant vi nedsatt gen- og protein uttrykk av matrix metalloproteinase 1 (MMP1) i decidua fra kvinner med preeklampsi og/eller føtal veksthemming (studie II). MMP1 er et viktig enzym for nedbrytning av bindevevet i decidua, og lave nivåer av MMP1 kan være en mulig mekanisme bak nedsatt trofoblastinvasjon ved disse tilstandene. I arbeidet som inngår i denne avhandlingen ble også utrykket av alle gener i decidua fra kvinner med preeklampsi og/eller føtal veksthemming sammenlignet med friske gravide. Denne sammenligningen viste at kvinner med preeklampsi og føtal veksthemming hadde forstyrrelser i flere biologiske prosesser som tidligere har vært assosiert med nedsatt oksygentilførsel til vev, som for eksempel endoplasmatisk retikulum (ER) stress, forsvar mot oksidativt stress og fettsyremetabolisme (studie III). I videre analyser fant vi at av ER stress responsen var aktivert ved føtal veksthemming, isolert eller i kombinasjon med preeklampsi. Ved isolert preeklampsi så ER stress ut til å være mindre fremtredende (studie IV). Dette kan være med på å forklare noen av de kliniske forskjellene som sees ved preeklampsi og føtal veksthemming. Samlet sett har arbeidet i denne avhandlingen bidratt til å kartlegge sentrale mekanismer knyttet til utvikling av preeklampsi og føtal veksthemming, samt skapt noen nye hypoteser som bør undersøkes videre.PhD i molekylærmedisinPhD in Molecular Medicin

Genetic Predisposition to Preeclampsia: Genetic Association Studies on Population-Based Cohorts and Transcriptional Studies on Decidua Basalis Tissue

PhD i molekylærmedisinPhD in Molecular Medicin