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    Caracterizaci贸n de la funci贸n de Mhf1/2 (CENP-S/X) en la segregaci贸n y en la reparaci贸n del DNA de Schizosaccharomyces pombe

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    [ES] En este estudio se ha analizado la funci贸n de dos prote铆nas de plegamiento tipo histona que interaccionan f铆sicamente entre s铆 formando complejos implicados en dos procesos de gran relevancia fisiol贸gica como son la segregaci贸n y la reparaci贸n del DNA. Estas prote铆nas fueron identificadas inicialmente en c茅lulas de mam铆feros como componentes constitutivos de la regi贸n interna del cinetocoro y se las denomin贸 CENP-S y CENP-X (centromeric protein). En trabajos posteriores, realizados tambi茅n en c茅lulas de mam铆feros, se identificaron formando un complejo con la DNA helicasa FANCM que participa en la ruta de reparaci贸n de la Anemia de Fanconi, denomin谩ndose MHF1 y MHF2 (FANCM- associated histone-fold protein). As铆 pues en eucariotas superiores hablamos de estas prote铆nas como CENP-S y -X si tratamos sobre la segregaci贸n del material gen茅tico o como MHF1 y 2, respectivamente, si nos referimos a su actividad en la reparaci贸n del DNA. La estructura de estas prote铆nas, su interacci贸n f铆sica y su implicaci贸n en los procesos mencionados est谩n altamente conservados desde humanos hasta levaduras indicando su importancia fisiol贸gica. Sin embargo, muchos datos acerca de su regulaci贸n y actividad son a煤n desconocidos. Debido a su alto grado de conservaci贸n, su estudio en eucariotas unicelulares como las levaduras facilitar谩 la disecci贸n y el entendimiento de su funci贸n

    Consecuencias de las alteraciones en la expresi贸n de aurora quinasa B sobre la segregaci贸n cromos贸mica y la progresi贸n del ciclo celular

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    Para garantizar una correcta segregaci贸n cromos贸mica, no s贸lo es importante asegurarse de que todos los cinetocorosde los cromosomasest茅n unidosal huso por medio de microt煤bulos, sino que tambi茅n es esencial que lo hagan de forma que ambas crom谩tidashermanasde cada par se encuentrenunidasa un polo diferente del huso mit贸tico. Esto es lo que se denominabi-orientaci贸n de las crom谩tidas hermanas, y se consigue gracias a un mecanismo de correcci贸n en el que est谩 implicada la quinasa Aurora B, subunidad catal铆tica del Complejo Pasajero del Cromosoma (CPC). Para llevar a cabo esta funci贸n, Aurora B colabora con el punto de control de ensamblaje delhuso (SAC). Debido a que Aurora B juega un papel fundamental en el mantenimiento dela estabilidad cromos贸mica en las c茅lulas, sus niveles de expresi贸n est谩n estrechamente regulados,ytanto la sobreexpresi贸n como la p茅rdida de dicho gen pueden causar errores de segregaci贸n cromos贸mica y aneuploid铆a. Curiosamente, aunque tanto Aurora B como el SAC participan en el mantenimiento de la ploid铆a, la falta de actividad Aurora B y la inactivaci贸n del SAC tienenconsecuencias muydiferentessobrela segregaci贸n de los cromosomas. Este hecho es especialmente evidente en S. cerevisiae, ya que en este organismo la falta de Ipl1 (el hom贸logo de Aurora B) es letal y conduce a problemas de aneuploid铆a, mientras que el SAC es dispensable bajo condiciones normales de crecimiento y los mutantes en este punto de control no muestran problemas evidentes de segregaci贸n cromos贸mica. Los resultados recogidos en esta Tesis Doctoraldemuestran que la reparaci贸n eficiente de las uniones microt煤bulo-cinetocoro incorrectas por Ipl1 durante las etapas iniciales del ensamblaje del huso en levaduras de gemaci贸n es la que determina la falta de defectos de segregaci贸n en los mutantes en el SAC. Adem谩s,proponemos que el factor clave que explica por qu茅 unas c茅lulas son m谩s dependientes de la funcionalidad del SAC que otras es la ventana temporal que la quinasa Aurora B requiereen cada casopara establecer la bi-orientaci贸n de los cromosomas. De manera interesante, el incremento de actividad Aurora B tambi茅n conduce a problemas de segregaci贸n cromos贸mica, y la sobreexpresi贸n de esta quinasa se ha observado en varios tipos de c谩ncer. Sin embargo, al inicio de esta Tesis Doctoral, se desconoc铆anlos mecanismosmolecularesmediante los que un incremento en la actividad quinasa de Aurora B puede perjudicarla progresi贸n mit贸tica y la viabilidad celular. Aunque pareceevidente explicar c贸mo la falta de una prote铆na que corrige las uniones microt煤bulo-cinetocoro incorrectas conduce a defectos severos de segregaci贸n cromos贸mica, es m谩s complicado imaginar c贸mo unincremento en la actividad Aurora B tambi茅n es delet茅reo para las c茅lulas. En esta Tesis Doctoral demostramosque, en S. cerevisiae, el incremento de actividad quinasa Ipl1,como resultado de la sobreexpresi贸n de dicha quinasa y su subunidad reguladora Sli15(el hom贸logo de INCENP, otro componente del CPC),desencadena defectos en la segregaci贸n de los cromosomassimilares a los descritos para c茅lulas de eucariotas superiores tras la sobreexpresi贸n de Aurora B. Haciendo uso de este modelo,proponemos que la generaci贸n de problemas de segregaci贸n cromos贸mica se debe a que una actividad Aurora B incrementada promueve la desestabilizaci贸n de las uniones microt煤bulo-cinetocoro incluso cuando estas se establecende manera correcta. Esto, a su vez,provoca la activaci贸n constitutiva del SAC, que bloquea la citocinesis a pesar de que la elongaci贸n del huso y la distribuci贸n del material gen茅tico hayan tenido lugar. Adicionalmente, nuestros resultados demuestranque el exceso de actividad Ipl1 promueve el colapso prematuro del husomit贸ticoa trav茅s de la inestabilidad de su zona media. Finalmente, y empleando l铆neas celulares humanas, demostramosque la sobreexpresi贸n de Aurora B y su subunidad reguladora INCENP conduce aun aumento sinerg铆stico de la actividad quinasa Aurora Btambi茅n en eucariotas superiores. Al igual que los resultados obtenidos en el caso de S. cerevisiae, este incremento de actividad provoca una alta tasa de inestabilidad gen贸mica que, en 煤ltima instancia, da lugar a letalidad celular, probablemente desencadenando en este caso un proceso apopt贸tico. En conjunto, los resultados mostrados en esta tesis resaltanla importancia de la regulaci贸n de la actividad Aurora B para el mantenimiento de la ploid铆ay la viabilidad celular

    La inestabilidad gen茅tica asociada a un puente de anafase formado por un cromosoma dic茅ntrico: Aspectos te贸ricos y estudio preliminar de un caso pr谩ctico.

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    Los cromosomas se estructuran en distintas partes, siendo estas los brazos, los tel贸meros y el centr贸mero. Lo com煤n es que cada cromosoma disponga de un 煤nico centr贸mero, pero puede darse el caso de que presente dos, pasando a ser un cromosoma dic茅ntrico. El ciclo rotura-fusi贸n-puente (BFB, en ingl茅s) es uno de los principales mecanismos de inestabilidad gen茅tica. Los cromosomas dic茅ntricos son intermediarios de este ciclo, ocasionando la formaci贸n de puentes de anafase que se resuelven con una rotura y posterior fusi贸n restableciendo el dic茅ntrico y realimentando el ciclo. Gracias a distintos tipos de modelos de dic茅ntricos en especies como la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha podido recabar informaci贸n sobre este ciclo. El presente trabajo re煤ne y organiza la informaci贸n referente a la estructura, funcionamiento y m茅todos de estudio de los cromosomas dic茅ntricos. Tambi茅n se han llevado a cabo estudios preliminares sobre un modelo de dic茅ntrico en Saccharomyces cerevisiae en el que el cromosoma dic茅ntrico afecta a regiones repetitivas en t谩ndem.Chromosomes are structured in different parts. These are arms, telomeres and a centromere. The most common situation, as a rule normally, is that each chromosome has a single centromere, however it can be found some cases where the chromosome presents two centromeres, becoming a dicentric chromosome. The breakage-fusionbridge cycle (BFB) is one of the main mechanisms of genetic instability. Dicentric chromosomes are intermediaries of this cycle, causing the formation of anaphase bridges that are resolved with a break and subsequent fusion, restoring the dicentric and feeding the cycle back. Thanks to different types of dicentric models in species such as the yeast Saccharomyces cerevisiae, information on this cycle has been collected. This project aims to gather and organize information regarding the structure, functioning and study methods of the dicentric chromosomes. Preliminary studies on a dicentric model have been also carried out in Saccharomyces cerevisiae in which the dicentric chromosome affects repetitive tandem regions

    Checkpoint mit贸tico como alvo terap锚utico para sensibilizar c茅lulas cancer铆genas a agentes antimit贸ticos

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    Disserta莽茫o de Mestrado, Oncobiologia 鈥 Mecanismos Moleculares do Cancro, Departamento de Ci锚ncias Biom茅dicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015Muitos cancros s茫o tratados com agentes antimit贸ticos, como o taxol. Estes agentes param as c茅lulas em mitose ao danificarem os microt煤bulos, ativando o checkpoint mit贸tico (SAC), mecanismo que controla a correta segrega莽茫o dos cromossomas durante a mitose. Contudo, c茅lulas resistentes conseguem contornar esses danos e prosseguir com a mitose, emergindo assim o SAC como potencial alvo terap锚utico no tratamento do cancro. Desta forma surgiu o primeiro objetivo deste trabalho: identificar potenciais inibidores da prote铆na BubR1, envolvida na ativa莽茫o do SAC e na estabiliza莽茫o das liga莽玫es entre microt煤bulos e cinetocoros, numa linha celular de cancro cervical. Dos compostos testados houve um que se destacou pela sua interfer锚ncia na viabilidade celular e revelou ser um potencial inibidor desta prote铆na. O objetivo principal deste trabalho foi sensibilizar duas linhas celulares de glioblastoma e uma linha celular de cancro do pulm茫o ao taxol atrav茅s da deple莽茫o das prote铆nas Cdc20 ou Spindly, envolvidas na sa铆da da mitose e no silenciamento do SAC, respetivamente. Para isso, estas prote铆nas foram depletadas por RNAi e foi adicionado taxol 脿s mesmas c茅lulas. Esta deple莽茫o provocou uma redu莽茫o da viabilidade celular e da capacidade clonog茅nica, tendo este efeito sido mais pronunciado quando se adicionou taxol, sugerindo que a deple莽茫o das prote铆nas Cdc20 ou Spindly sensibiliza estas c茅lulas 脿 a莽茫o do taxol.Many cancers are treated with antimitotic agents, such as taxol. These agents stop cells in mitosis by damaging microtubules, activating the mitotic checkpoint (SAC), which controls the correct chromosome segregation during mitosis. However, resistant cells can bypass these damages and proceed with mitosis, emerging thus the SAC as a potential therapeutic target in the treatment of cancer. In this way arose the first aim of this work: to identify potential BubR1 inhibitors, a protein involved in SAC activation and in the stabilization of the bindings between microtubules and kinetochores, in a cervical cancer cell line. Of the compounds tested there was one that stood out for its interference on cell viability and revealed to be a potential inhibitor of this protein. The main goal of this work was to sensitize two glioblastoma cell lines and a lung cancer cell line to taxol by depleting Cdc20 or Spindly, involved in the mitotic exit and in SAC silencing, respectively. To achieve this goal, these proteins were depleted by RNAi, and taxol was added to cells lacking these proteins. These depletions caused a reduction in cell viability and in clonogenic ability, which was more evident when taxol was added, suggesting that depletion of Cdc20 or Spindly sensitizes these cells to the action of taxol.CESPU 鈥 Cooperativa de Ensino Polit茅cnico e Universit谩rio (Refer锚ncia do projeto: CheckTax-CESPU-2014

    An谩lise da actividade do checkpoint mit贸tico em linhas celulares do cancro da cavidade oral

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    A instabilidade cromoss贸mica 茅 uma caracter铆stica frequente nas c茅lulas do carcinoma escamoso da cavidade oral (OSCC, Oral Squamous Cell Carcinoma), pensando-se estar associada a defeitos no checkpoint mit贸tico, mecanismo de controlo e de monitoriza莽茫o crucial para a correcta segrega莽茫o dos cromossomas durante a divis茫o celular. Neste contexto, tem sido sugerido que altera莽玫es nas prote铆nas reguladoras deste mecanismo s茫o respons谩veis pela promo莽茫o da aneuploidia que se verifica habitualmente no cancro. Tendo em conta, a necessidade de solidificar e complementar resultados anteriormente obtidos no nosso laborat贸rio, este trabalho teve como objectivo a an谩lise funcional e molecular do checkpoint mit贸tico nas linhas celulares tumorais, SCC04 e SCC09, utilizando-se como controlo uma linha celular normal da cavidade oral, a linha celular prim谩ria de queratin贸citos normais humanos, HOK (Human Oral Keratinocytes). Nestas linhas foi avaliada actividade do checkpoint mit贸tico atrav茅s da an谩lise da resposta das c茅lulas 脿 exposi莽茫o a um f谩rmaco anti-mit贸tico, o nocodazole, verificando-se que as linhas SCC, quando expostas por per铆odos prolongados ao f谩rmaco apresentam um baixo 铆ndice mit贸tico revelando-se assim incapazes de sustentar uma paragem prolongada em mitose. As altera莽玫es moleculares subjacentes a esta defici锚ncia na actividade do checkpoint mit贸tico foram avaliadas atrav茅s de estudos de express茫o de genes do checkpoint mit贸tico. Verificou-se que os genes codificantes para as prote铆nas do checkpoint (Mad2, Bub1, BubR1, Bub3 e Cdc20) encontram-se sobre-expressos nas linhas SCC em estudo. Verificou-se tamb茅m a exist锚ncia de varia莽玫es na express茫o do gene codificante da prote铆na Chfr, entre as linhas celulares tumorais em estudo. Na linha celular tumoral SCC09 este gene 茅 sobre-expresso, enquanto, na linha celular tumoral SCC04 se encontra sub-expresso. Na linha celular tumoral SCC25, a altera莽茫o na express茫o do gene, Chfr, n茫o 茅 significativa, comparativamente 脿 linha controlo. Assim, os resultados obtidos demonstram que as linhas celulares tumorais SCC09 e SCC04 apresentam uma actividade reduzida do checkpoint mit贸tico, bem como, altera莽玫es na express茫o dos genes envolvidos na via de sinaliza莽茫o do checkpoint, sugerindo uma rela莽茫o de causa-efeito

    Estudio de las fosfatasas hCdc14 en el ciclo de divisi贸n celular y en la respuesta al da帽o en el DNA

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    [ES]El ciclo celular es el conjunto de procesos por los que, a partir de una c茅lula madre, se obtienen dos c茅lulas hijas con id茅ntica informaci贸n gen茅tica. Dentro del ciclo, la fase de mitosis resulta especialmente importante ya que regula la transmisi贸n de la informaci贸n gen茅tica a las c茅lulas hijas, de modo que alteraciones en esta fase pueden conducir a aneuploid铆as o inestabilidad gen贸mica. Para iniciar el proceso de mitosis se requiere de alta actividad CDK responsable de diversos procesos como condensaci贸n de los cromosomas, ruptura de la envuelta nuclear y ensamblaje del huso mit贸tico. Sin embargo, para finalizar la mitosis es necesario inactivar estos complejos y revertir los procesos de fosforilaci贸n.Otra parte de este trabajo de tesis doctoral ha consistido en estudiar la posible participaci贸n de la fosfatasa hCdc14B en la Respuesta al Da帽o en el DNA. Para mantener la integridad del genoma, las c茅lulas necesitan responder adecuadamente a distintos tipos de da帽o que se producen en el DNA, mediante activaci贸n de las v铆as de se帽alizaci贸n que se conocen como "Respuesta a Da帽o en el DNA" (DDR). Esta respuesta implica la activaci贸n del checkpoint de da帽o, cuya finalidad es parar la progresi贸n por el ciclo celular, y la activaci贸n de mecanismos de reparaci贸n del da帽o generado
    corecore