24 research outputs found
Die Charakterisierung der Funktion des Lipidtransporters ABCA3 in der Milchdrüse (am Mausmodell)
ABCA3 ist als Phospholipidtransporter der ABC-Transporterfamilie wesentlich an der Synthese von Lungensurfactant beteiligt. Diese wichtige Rolle von ABCA3 in der Lunge ist mittlerweile bekannt und wird weiterhin näher erforscht. Des Weiteren wird ABCA3 auch in anderen Geweben exprimiert, darunter Leber, Niere, Gehirn [Stahlman et al. 2007]. ABCA3 wurde daneben auch in humanem Milchdrüsengewebe entdeckt und stellt in Mammakarzinomen einen Marker für eine gute Prognose dar [Schimanski 2010].
In der murinen Milchdrüse ist die Abca3-Expression molekularbiologisch auf Ebene der mRNA nachgewiesen worden [Hammel 2007]. Des Weiteren ist ABCA3 in immunhistochemischen Färbungen von humaner und muriner Milch darstellbar. Dort ist es auf der Außenseite der Milchfetttröpfchen-Membran lokalisiert [bislang nicht veröffentlichte Daten der eigenen Arbeitsgruppe]. Milchfetttröpfchen werden in Milchdrüsen-Epithelzellen gebildet, indem Lipidtransporter (unter anderem ABC-Transporter der ABCA-Subklasse wie ABCA1 oder ABCA7) Lipide importieren.
In der Milchdrüse ist über den Mechanismus, mit dem ABCA3 an der Milchsekretion beteiligt sein könnte, nicht viel bekannt. Es kann aber analog zu der Rolle in der Lunge davon ausgegangen werden, dass ABCA3 auch in der Milchdrüse Phospholipide transportiert. Phospholipide verfügen über wichtige Eigenschaften in der Milch als Emulgatoren und als protektive Faktoren für das Neugeborene. Es ist nachgewiesen, dass ein Einschnitt in der Phospholipid-Sekretion und eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide in der Milch zu nachteiligen Auswirkungen auf das Neugeborene führen [Isaacs 2005].
Es stellt sich die Frage, ob und inwieweit ABCA3 in der Brustdrüse an der Milchbildung und – sekretion beteiligt ist.
Dazu wurde ein Mausmodell mit spezifischer Deletion des ABCA3 Gens in der Milchdrüse generiert. Eine Mauslinie mit Cre-Expression unter dem während der Laktation spezifisch im Mammagewebe aktiven Lactoglobulin-Promotor wurde mit einer Mauslinie gekreuzt, welche im ABCA3-Gen LoxP Stellen enthielt. Es kommt zur Cre-getriggerten Deletion von ABCA3 im Mammagewebe. Das andere Allel wurde durch Einkreuzen einer klassischen Knockout-Linie gänzlich inaktiviert. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Zur quantitativen Bestimmung der Expression von Abca3 im Mammagewebe wurde die Methode der quantitativen RT-PCR angewendet.
Der Melkvorgang erfolgte mittels einer eigens konzipierten Melkvorrichtung. Diese beinhaltet eine Flüssigkeitsfalle, wodurch ein besseres Handling beim Melkvorgang erreicht wurde. So konnte unter anderem eine höhere Milchmenge pro Maus gewonnen werden mit weniger technisch bedingten Schwankungen. Die Milchproben an Tag 5, 10 und 15 der Laktation wurden massenspektrometrisch auf den Gehalt der einzelnen Phospholipide analysiert.
Es ergab sich eine Reduktion des Abca3-Gens im Milchdrüsengewebe der gefloxten Mäuse von 95% im Vergleich zum Wildtyp. Die Analyse der Phospholipide zeigte eine Verminderung von Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin, während innerhalb der Phosphatidylcholin-Spezies kurzkettige Moleküle (PC30:0, PC32:0) signifikant vermindert waren. Die Milchmenge der ABCA3 defizienten Linie an Tag 15 der Laktation war signifikant vermindert im Vergleich zur Wildtyp Gruppe (p = 0,005).
Der Nachweis von ABCA3 in Milchfetttröpfchen und die Verminderung der Milchmenge bei dessen Fehlen weist auf eine Rolle dieses Transporters für die Milchsekretion hin. Da Phospholipide nur einen geringen Anteil der Milchfette darstellen, aber vor allem in der Membran der Milchfetttröpfchen enthalten sind, könnte ABCA3 möglicherweise durch Bereitstellung von Phospholipiden für die Bildung der Membran von Milchfetttröpfchen an der Milchbildung beteiligt sein. Am Höhepunkt der Laktation kann das Phospholipid-Defizit in den Milchfetttröpfchen nicht meht kompensiert werden und die Milchmenge nimmt durch die verminderte Bildung von Milchfetttröpfchen signifikant ab. Dabei ändert sich die Gesamtzusammensetzung der Milch nur unbedeutend, da jeweils das gesamte Organell „Milchfetttröpfchen“ mitsamt Inhalt fehlt. Dies muss im Rahmen dieser Studie allerdings hypothetisch bleiben
Funktionelle Untersuchungen der Multidrug-Resistance-Associated Proteins (MRP) 1 und 2
Die Multidrug-Resistenz (MDR) stellt ein ernstzunehmendes Problem in der Therapie maligner Tumore dar. Eine Ursache dieses MDR-Phänotyps ist die Überexpression von Multidrug resistance associated proteins (MRPs), insbesondere MRP1 und MRP2. MRP1 und MRP2 sind in der Lage eine Vielzahl an konjugierten und unkonjugierten Verbindungen, darunter viele Zytostatika, unter ATP-Verbrauch aus der Zelle zu entfernen und so eine Resistenz auszulösen. Ziel dieser Arbeit war es neue Modulatoren zur Aufhebung der MRP1 und MRP2 induzierten MDR zu finden und zu charakterisieren. Dazu wurden verschiedene auf überexprimierenden Zellen basierende Akkumulations-Assays entwickelt, etabliert oder bereits bestehende modifiziert und angewendet, um die Eigenschaften neuer Modulatoren zu charakterisieren. Als besonders effektiv erwies sich der neu etablierte und modifizierte Calcein-AM-Assay für MRP1 und MRP2 durch den einige neue Modulatoren identifiziert werden konnten. Um die Selektivität der neu entdeckten Modulatoren zu untersuchen, wurde zusätzlich der bereits etablierte Calcein-AM-Assay für P-gp angewendet. Als neue Klasse von Inhibitoren wurden unter anderem Benzimidazolderivate entdeckt. Sie hemmen den Transport durch MRP1, MRP2 und P-gp, wobei eine hohe Korrelation der Effektivitätsdaten zwischen den Transportern nachgewiesen werden konnte. Dies weist auf einen hohen Verwandtschaftsgrad aller drei Transporter hin. Die inhibitorisch aktivsten Substanzen sind im unteren mikromolaren Bereich an allen Resistenzproteinen wirksam. Durch Einsatz der 3D-QSAR-Methoden CoMFA und CoMSIA konnten zusätzlich aussagekräftige Modelle zur Beschreibung der Strukturwirkungsbeziehungen für MRP1, MRP2 und P-gp generiert werden. Die Strukturwirkungsbeziehungen ließen sich am besten durch sterische bzw. hydrophobe Wechselwirkungen beschreiben und zeigten einen hohen Verwandtschaftsgrad der drei Resistenzproteine. Als weitere Klasse von neuen Modulatoren erwiesen sich die ortho-Thioureidocarbonsäuren und deren Harnstoffderivate sowie die entsprechenden Benzoesäurederivate. Sie zeigten keine Aktivität an P-gp und sind damit selektive Modulatoren von MRP1. Die besten Substanzen sind mit einem IC50-Wert unter 1 µmol/l an MRP1 hochpotent. Für diese Modulatorklasse konnte ein einfaches Pharmakophormodell erstellt werden. Im Calcein-AM-Assay für MRP2 wirkte dies Substanzklasse hingegen aktivierend und erst in hohen Konzentrationen inhibierend. Als dritte neue Klasse an Modulatoren für MRP1 und MRP2 erwiesen sich p-Aminobenzoesäure-Derivate. Sie inhibierten sowohl den MRP1 als auch MRP2 vermittelten Calcein-AM-Transport. Die aktivste Substanz war mit einem IC50-Wert von etwa 1 µmol/l an MRP1 und um die 20 µmol/l an MRP2 potenter als alle gängigen Standardsubstanzen. Die neu entwickelten und charakterisierten Verbindungen wurden mit bekannten Modulatoren aus der Literatur verglichen. Es zeigte sich, dass sie häufig äquipotent oder, insbesondere an MRP2, sogar besser wirksam waren als die in der Literatur beschriebenen. Da MRP1 und MRP2 dafür bekannt sind auch Glutathion und Glutathionkonjugate zu transportieren, wurden neue fluoreszenzbasierte Assays zur Quantifizierung des intrazellulären und des hinaus transportierten Glutathions entwickelt und etabliert. Die Bestimmung des intrazellulären Glutathions ergab mit entsprechenden Daten aus Veröffentlichungen vergleichbare Ergebnisse. Im Assay zur Bestimmung des hinaus transportierten Glutathions wurde exemplarisch aus jeder der neu entdeckten Modulatorklassen eine Verbindung ausgewählt und untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass keine der Substanzen mit Glutathion assoziiert transportiert wird. Neben den neuen Modulatoren wurde auch die für MRP2 diskutierte Cisplatinresistenz mittels Atom-Absorptions-Spektroskopie genauer untersucht. Es konnte demonstriert werden, dass der Resistenzfaktor von den MRP2 exprimierenden Zellen gegenüber Cisplatin mit der Differenz in der Platinakkumulation nahezu identisch ist. Die Resistenz war unter Einsatz eines MRP2-Inhibitors reversibel, wohingegen ein künstlich ausgelöster Glutathion-Mangelphänotyp keinen Einfluss auf die Cisplatinaufnahme zeigte. Ebenso konnte demonstriert werden, dass Cisplatin nicht mit Glutathion assoziiert aus den Zellen hinaus transportiert wird, sodass die in der Literatur diskutierte Rolle von Glutathion bei der Detoxifikation von Cisplatin über MRP2 widerlegt werden konnte. In einem letzten Schritt wurden Kombinations-Experimente für MRP2 jeweils mit einem Aktivator und einem Inhibitor durchgeführt. Es wurde eine Dose-Ratio-Auswertung, Untersuchungen zur Anzahl von interagierenden Bindungsstellen und eine enzymkinetische Auswertung vorgenommen. Es konnte unter anderem gezeigt werden, dass zur Inhibition des MRP2 vermittelten Calcein-AM-Transportes zwei Bindungsstellen blockiert werden müssen, während zur Aktivierung des Transportes die Bindung an einer Bindungsstelle ausreicht. Bei der enzymkinetischen Auswertung konnten über die durch den Inhibitor und den Aktivator ausgelöste Änderung der Transportgeschwindigkeit, Rückschlüsse auf deren Interaktion gezogen werden. So konnten die zwei bekannten Bindungsstellen für β-Estradiol-17-β-D-Glukuronid und Indometacin an MRP2 unterschieden werden. Des Weiteren zeigte sich, dass sowohl die ortho-Thioureidocarbonsäuren als auch die Benzimidazolderivate mit β-Estradiol-17-β-D-Glukuronid um die Steroidbindungsstelle konkurrieren. Das p-Aminobenzoesäure-Derivat Gü 83 scheint weder an die Steroidbindungsstelle noch an die Bindungsstelle des Indometacins zu binden, was auf eine mögliche dritte Bindungsstelle schließen lässt. Die in dieser Arbeit entwickelten und eingesetzten Methoden können zur Charakterisierung der MRP1 und MRP2 induzierten Multidrug-Resistenz herangezogen werden und somit Einblicke in die Funktion dieser Resistenzproteine geben. Dissertation Bonn 200
Die Charakterisierung der Funktion des Lipidtransporters ABCA3 in der Milchdrüse (am Mausmodell)
ABCA3 ist als Phospholipidtransporter der ABC-Transporterfamilie wesentlich an der Synthese von Lungensurfactant beteiligt. Diese wichtige Rolle von ABCA3 in der Lunge ist mittlerweile bekannt und wird weiterhin näher erforscht. Des Weiteren wird ABCA3 auch in anderen Geweben exprimiert, darunter Leber, Niere, Gehirn [Stahlman et al. 2007]. ABCA3 wurde daneben auch in humanem Milchdrüsengewebe entdeckt und stellt in Mammakarzinomen einen Marker für eine gute Prognose dar [Schimanski 2010].
In der murinen Milchdrüse ist die Abca3-Expression molekularbiologisch auf Ebene der mRNA nachgewiesen worden [Hammel 2007]. Des Weiteren ist ABCA3 in immunhistochemischen Färbungen von humaner und muriner Milch darstellbar. Dort ist es auf der Außenseite der Milchfetttröpfchen-Membran lokalisiert [bislang nicht veröffentlichte Daten der eigenen Arbeitsgruppe]. Milchfetttröpfchen werden in Milchdrüsen-Epithelzellen gebildet, indem Lipidtransporter (unter anderem ABC-Transporter der ABCA-Subklasse wie ABCA1 oder ABCA7) Lipide importieren.
In der Milchdrüse ist über den Mechanismus, mit dem ABCA3 an der Milchsekretion beteiligt sein könnte, nicht viel bekannt. Es kann aber analog zu der Rolle in der Lunge davon ausgegangen werden, dass ABCA3 auch in der Milchdrüse Phospholipide transportiert. Phospholipide verfügen über wichtige Eigenschaften in der Milch als Emulgatoren und als protektive Faktoren für das Neugeborene. Es ist nachgewiesen, dass ein Einschnitt in der Phospholipid-Sekretion und eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide in der Milch zu nachteiligen Auswirkungen auf das Neugeborene führen [Isaacs 2005].
Es stellt sich die Frage, ob und inwieweit ABCA3 in der Brustdrüse an der Milchbildung und – sekretion beteiligt ist.
Dazu wurde ein Mausmodell mit spezifischer Deletion des ABCA3 Gens in der Milchdrüse generiert. Eine Mauslinie mit Cre-Expression unter dem während der Laktation spezifisch im Mammagewebe aktiven Lactoglobulin-Promotor wurde mit einer Mauslinie gekreuzt, welche im ABCA3-Gen LoxP Stellen enthielt. Es kommt zur Cre-getriggerten Deletion von ABCA3 im Mammagewebe. Das andere Allel wurde durch Einkreuzen einer klassischen Knockout-Linie gänzlich inaktiviert. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Zur quantitativen Bestimmung der Expression von Abca3 im Mammagewebe wurde die Methode der quantitativen RT-PCR angewendet.
Der Melkvorgang erfolgte mittels einer eigens konzipierten Melkvorrichtung. Diese beinhaltet eine Flüssigkeitsfalle, wodurch ein besseres Handling beim Melkvorgang erreicht wurde. So konnte unter anderem eine höhere Milchmenge pro Maus gewonnen werden mit weniger technisch bedingten Schwankungen. Die Milchproben an Tag 5, 10 und 15 der Laktation wurden massenspektrometrisch auf den Gehalt der einzelnen Phospholipide analysiert.
Es ergab sich eine Reduktion des Abca3-Gens im Milchdrüsengewebe der gefloxten Mäuse von 95% im Vergleich zum Wildtyp. Die Analyse der Phospholipide zeigte eine Verminderung von Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin, während innerhalb der Phosphatidylcholin-Spezies kurzkettige Moleküle (PC30:0, PC32:0) signifikant vermindert waren. Die Milchmenge der ABCA3 defizienten Linie an Tag 15 der Laktation war signifikant vermindert im Vergleich zur Wildtyp Gruppe (p = 0,005).
Der Nachweis von ABCA3 in Milchfetttröpfchen und die Verminderung der Milchmenge bei dessen Fehlen weist auf eine Rolle dieses Transporters für die Milchsekretion hin. Da Phospholipide nur einen geringen Anteil der Milchfette darstellen, aber vor allem in der Membran der Milchfetttröpfchen enthalten sind, könnte ABCA3 möglicherweise durch Bereitstellung von Phospholipiden für die Bildung der Membran von Milchfetttröpfchen an der Milchbildung beteiligt sein. Am Höhepunkt der Laktation kann das Phospholipid-Defizit in den Milchfetttröpfchen nicht meht kompensiert werden und die Milchmenge nimmt durch die verminderte Bildung von Milchfetttröpfchen signifikant ab. Dabei ändert sich die Gesamtzusammensetzung der Milch nur unbedeutend, da jeweils das gesamte Organell „Milchfetttröpfchen“ mitsamt Inhalt fehlt. Dies muss im Rahmen dieser Studie allerdings hypothetisch bleiben
Funktionelle Untersuchungen des ABC-Transporters Breast Cancer Resistance Protein (BCRP)
Die Multidrug Resistenz (MDR) von Krebszellen stellt ein bedeutendes Problem bei der Behandlung von Tumoren mit Chemotherapeutika dar. Vor allem die Expression der drei ABC-Transporter P-gp (ABCB1), MRP1 (ABCC1) und BCRP (ABCG2) spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der MDR. Als membranständige Effluxpumpen nutzen diese Transportproteine die durch ATP Hydrolyse freigesetzte Energie, um Substanzen entgegen eines Konzentrationsgradienten aus den Zellen hinaus zu transportieren. Bei Krebszellen führt dies zu einer Verringerung der intrazellulären Zytostatikakonzentration und in Folge zum Versagen der Chemotherapie. Sowohl die Hemmung der Effluxpumpen mit spezifischen hoch affinen Modulatoren als auch die Inhibition von Schlüsselsignaltransduktionskaskaden, die die Genregulation der Transporter beeinflussen, stellen mögliche Ansatzpunkte dar, die Entwicklung der Transporter-basieren MDR zu bekämpfen. Im Fokus dieser Arbeit steht die funktionelle Untersuchung des ABC-Transporters BCRP. Um ein besseres Verständnis der Funktionsweise von BCRP zu erlangen, wurden unterschiedliche zellbasierte Akkumulations-Assays entwickelt, etabliert oder bereits bestehende modifiziert und angewendet, um die Interaktion von bekannten und neuen Modulatoren mit BCRP näher zu charakterisieren. Mit Hilfe dieser Testsysteme wurden diverse im Arbeitskreis synthetisierte Tariquidar-Analoga (WK-Verbindungen) bezüglich ihrer Hemmwirkung gegenüber BCRP untersucht. Durch den Vergleich der erhaltenen Aktivitätswerte an BCRP mit denen an P-gp wurden Strukturmerkmale identifiziert, welche die Interaktion mit P-gp und/oder BCRP hervorrufen. Für 30 WK-Modulatoren wurden 2D- und 3D-Struktur-Wirkungsbeziehungen abgeleitet. Dabei konnten CoMFA- und CoMSIA-Modelle erstellt werden, die eine gute Vorhersage der biologischen Aktivitätswerte ermöglichen. In dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass auch Verbindungen, die ein geringes Molekulargewicht besitzen und teilweise nicht-basisch sind, zu einer bemerkenswerten Hemmung von ABCG2 führen. Im Zuge dieser Untersuchungen wurde eine neue Klasse spezifischer BCRP Modulatoren mit geringer Toxizität identifiziert. Die Resultate dieser Untersuchungen liefern essentielle Ideen für die zielgerichtete Synthese weiterer strukturell ähnlicher spezifischer BCRP Inhibitoren. Die Interaktion von Tyrosinkinaseinhibitoren mit BCRP konnte erfolgreich näher charakterisiert werden. Es wurde demonstriert, dass die EGFR Inhibitoren Gefitinib und PD158780 und der PI3K/Akt Inhibitor LY294002 in der Lage sind, den Expressionsstatus von ABCG2 via PI3K/Akt-Signaltransduktionskaskade zu verringern. Zusätzlich kam es zu einer Internalisierung von BCRP. Die BCR-ABL Inhibitoren Imatinib und Nilotinib - Verbindungen, die nicht mit EGFR interagieren - zeigten keinen Einfluss auf den BCRP Expressionslevel. Mit Hilfe des Pheophorbid A-Assays konnte die verminderte BCRP Expression auch auf funktioneller Ebene nachgewiesen werden. Die Funktion des in der Plasmamembran exprimierten Proteins blieb dabei erhalten. Die Aktivität der PI3K/Akt-Signaltransduktionskaskade spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der BCRP Expression. Ein zentrales Motiv dieser Arbeit bestand in der Intention, potentielle Bindungsstellen von BCRP mit Hilfe der etablierten funktionellen Assays zu untersuchen und einen Einblick zu gewinnen, ob sich diese Bindungsstellen gegenseitig beeinflussen. Die Identifizierung der Interaktionsform von insgesamt 12 Verbindungen aus unterschiedlichen Substanzklassen konnte durch die Bestimmung der Hemmwirkung im Hoechst 33342- und im Pheophorbid A-Assay bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen erreicht werden. Auf Basis der aus diesen Untersuchungen gewonnenen Erkenntnisse wurde ein Modell über drei mögliche Bindungsstellen von BCRP erstellt, die sich gegenseitig, im Sinne einer positiven Kooperativität, beeinflussen
Funktionelle Untersuchung von Benzimidazolen und Acridonsäureamiden als Modulatoren des ABC-Transporters ABCB1
Die humanen ABC-Transporter ABCB1 (P-Glykoprotein) und ABCG2 (Breast Cancer Resistance Protein) besitzen aufgrund ihrer ubiquitären Expression und ihrer Polyspezifität ein Vielzahl physiologischer Funktionen. Dabei beeinflussen sie insbesondere in Geweben mit einer Barrierefunktion die Absorption, Distribution, Metabolisierung und Elimination (ADME) einer Vielzahl von Arzneistoffen. Daneben sind beide Transporter an der Entwicklung der multiplen Zytostatikaresistenz (Multidrug Resistance, MDR) von Tumoren beteiligt. Die Inhibition oder Stimulation dieser ABC-Transporter stellt somit einen potentiellen Ansatz zur Aufhebung der MDR und zur gezielten Beeinflussung der Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen dar. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit ist die funktionelle Charakterisierung von Derivaten des QB11, eines Aktivators von ABCB1, mittels Durchflusszytometrie basierter Verfahren. Die betrachteten 9H-Imidazobenzimidazole und 2-Aryl-1H-benzimidazole sind wie die Ausgangsverbindung in der Lage, den ABCB1 vermittelten Transport der Substrate Rhodamin 123 und Daunorubicin zu stimulieren, während der Efflux anderer Substanzen inhibiert wird. Einige strukturelle Modifikationen führen jedoch zum vollständigen Verlust der aktivierenden Wirksamkeit. Basierend auf den erhaltenen Aktivitätsdaten wurde ein Pharmakophormodell erstellt, um die für die Aktivierung von ABCB1 essentiellen Strukturmerkmale zu identifizieren. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit ist die funktionelle Untersuchung von Acridonsäureamiden, die sich strukturell vom potenten ABCB1 und ABCG2 Inhibitor GF120918 (Elacridar) ableiten. Die inhibitorische Wirksamkeit der Verbindungen gegenüber ABCB1 ist dabei ebenfalls stark vom betrachteten Substrat abhängig (Rhodamin 123, Hoechst 33342). Eine Präferenz der Inhibitoren gegenüber einer der beiden Bindungsstellen konnte in einem enzymkinetischen Ansatz jedoch nicht festgestellt werden; sie greifen vermutlich an einer dritten Bindungsstelle des Proteins an. Im Gegensatz dazu ist die inhibitorische Wirkung gegenüber ABCG2 nicht vom betrachteten Substrat (Hoechst 33342, Pheophorbid A) abhängig. Für ausgewählte Derivate konnte aber eine kompetitive Interaktion mit Pheophorbid A nachgewiesen werden, welche darauf hindeutet, dass die Acridonsäureamide ebenfalls an dessen Bindungsstelle an ABCG2 binden. Eine Reihe von "kleinen" Acridonsäureamiden, die sich strukturell vom ABCG2 Inhibitor MBLI-87 ableiten, besitzt ebenfalls gute inhibitorische Aktivität gegenüber ABCG2. Diese Verbindungen wirken hingegen an ABCB1 aktivierend und stellen somit eine neuartige Klasse von Aktivatoren dieses ABC-Transporters dar. Die teils ausgeprägte Substratabhängigkeit der Wirkung von Modulatoren des ABCB1 besitzt eine enorme Relevanz für die Entwicklung neuer Arzneistoffe. So könnten zukünftig unter anderem Inhibitoren zur Überwindung der MDR entwickelt werden, die gezielt den Transport bestimmter Substrate hemmen. Im Falle anderer Arzneistoffe hingegen ist eine Interaktion mit ABC-Transportern meist nicht erwünscht, da sie zu schwerwiegenden Interaktionen mit weiteren Pharmaka führen kann. Um eine Interaktion z.B. mit ABCB1 sicher ausschließen zu können, ist daher in den frühen Entwicklungsphasen neuer Wirkstoffe eine Testung unter Verwendung unterschiedlicher Substrate sinnvoll
Charakterisierung der Funktion des Lipidtransporters ABCA3 im Milchdrüsen- und Lebergewebe am heterozygoten Mausmodell
Charakterisierung der Funktion des Lipidtransporters ABCA3 im Milchdrüsen- und Lebergewebe am heterozygoten Mausmodell
Etablierung und Anwendung unterschiedlicher kolorimetrischer Detektionsmethoden zur Aktivitätsbestimmung von Modulatoren der ABC-Transporter ABCB1, ABCC1 und ABCG2
Die Überexpression von ABC-Transportproteinen in Krebszellen führt zu Resistenzen gegenüber einem großen Spektrum antineoplastischer Substanzen. ABCB1, ABCC1 und ABCG2 sind die wichtigsten Vertreter, welche zu dieser sogenannten Multidrug Resistenz führen, was ein Versagen von Chemotherapien zur Folge hat. In dieser Arbeit wurden in unterschiedlichen Projekten bekannte und neue Modulatoren der ABC-Transportproteine ABCB1, ABCC1 und ABCG2 mit kolorimetrischen Messmethoden charakterisiert.
Im ersten Projekt wurden die Substanzklassen der Pyrrolo- und Indolopyrimidine näher untersucht. Die Hemmwirkung dieser Verbindungen gegenüber ABCC1 wurde unter Verwendung des neu etablierten Daunorubicin Akkumulationsassays bestimmt, wodurch potente und selektive Inhibitoren entdeckt werden konnten. Niedermolekulare Pyrrolopyrimidine und einige Purinderivate hatten überdies einen stimulierenden Effekt auf den ABCC1-vermittelten Daunorubicin Transport. Überdies wurden innerhalb der Substanzklassen der Pyrrolo- und Indolopyrimidine Dualinhibitoren von ABCB1/ABCC1 bzw. ABCG2/ABCC1, aber auch hochpotente ABCB1/ABCC1/ABCG2 Dreifachinhibitoren entdeckt.
Im zweiten Projekt wurden die zwei bereits erfolgreich als ABCG2 Inhibitoren angewandten Substanzklassen der Chinazoline und Chalkone zu heterodimeren Chinazolin-Chalkonen vereint und detailliert analysiert. Die potenteste Verbindung zeigte eine etwa 25-fach höhere Hemmwirkung gegenüber ABCG2 im Vergleich zu den Einzelverbindungen.
Das dritte Projekt konzentrierte sich auf Untersuchungen zu stimulierenden und inhibierenden Effekten auf die ABCC1 und ABCG2 ATPasen. Zunächst wurde der Einfluss intrinsischer ABCC1 Substrate, insbesondere oxidiertem Glutathion (GSSG), auf die Stimulation der ABCC1 ATPase durch ABCC1 Modulatoren bestimmt. Ein synergistischer Effekt konnte für eine Vielzahl dieser Verbindungen gezeigt werden. Des Weiteren wurde der Effekt von ABCG2 Inhibitoren auf die ABCG2 ATPase untersucht. Im Falle der Tetrahydro-ß-carboline wurde der inhibierende Effekt auf die basale sowie die Quercetin-stimulierte ABCG2 ATPase-Aktivität analysiert. Im Gegensatz dazu stand der aktivierende Effekt von Acryloylphenylcarboxylaten auf die ABCG2 ATPase im Fokus, welcher in der Anzahl und Position bestimmter Methoxygruppen begründet war.
Nach erfolgreicher Etablierung des für diese Untersuchungen verwendeten Natriumorthovanadat-sensitiven ATPase Assays wurde dieser durch Verwendung einer 96er Mikrotiterplatte optimiert. Nicht im Zusammenhang mit ABC Transportern stehende Detektionsmittel für anorganisches Phosphat wurden analysiert. Die anschließende Etablierung der Phophatdetektion mit Chinaldin Rot wurde erfolgreich mit ABCC1- und ABCG2-enthaltenen Membranpräparationen durchgeführt und verifiziert