96 research outputs found

    Role of novel nuclear envelope proteins involved in nuclear positioning during cell migration

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    Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Gen√©tica). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ci√™ncias, 2010Centrosome reorientation is defined as the positioning of the centrosome in a region between the nucleus and the leading edge and is important for cell polarization and directional cell migration. Cdc42 is the key regulator on this process and two main pathways are involved in centrosome reorientation; on one side, centrosome centration by a mechanism dependent of Par complex and dynein/dynactin, and for other side, a rearward nuclear movement dependent on Cdc42-effector MRCK and actin-myosin retrograde flow. Recently, the LINC complex was found to be involved in the rearward nuclear movement pathway. This complex spans the nuclear envelope and involves a SUN domain-containing protein which interacts with a KASH domain-containing protein, localized in the inner and in the outer nuclear membrane, respectively. SUN proteins bind to lamins and KASH proteins to actin filaments; in this way, the LINC complex makes the connection between actin retrograde flow and the nucleus. In fibroblasts, Sun2 and Nesprin-2 co-localize with dorsal actin cables on TAN lines; actin dorsal cables move back by actin retrograde flow and the nucleus moves with them. Other proteins can be involved in the nuclear movement. In a siRNA screen for nuclear envelope proteins, a putative role for Tmem201 in nuclear movement was identified. In S.pombe, Tmem201 homolog connects the heterochromatin with the LINC complex. A connection with LINC complex in mammalians was never reported so far. Tmem201is a nuclear envelope protein and is localized in TAN lines in fibroblasts. The TMEM201depletion by RNA interference inhibited centrosome reorientation. Tmem201 is involved in nuclear movement, probably by the stabilization of the LINC complex in the nuclear membrane. However, Tmem201 might also be involved in centrosome positioning and could act as a key regulator of both pathways.Durante muito tempo, o papel do inv√≥lucro nuclear foi desvalorizado, sendo visto como um mero compartimento de armazenamento de cromossomas. Hoje em dia, ap√≥s a descoberta de uma nova categoria de prote√≠nas que permitiram criar o elo entre os componentes nucleares e o citosqueleto, o seu papel como organizador essencial √© lhe amplamente reconhecido. De facto, a din√Ęmica entre citosqueleto e inv√≥lucro nuclear √© fundamental para um correcto posicionamento do n√ļcleo, que depende, por sua vez, de uma correcta migra√ß√£o e ancoragem do n√ļcleo. O posicionamento nuclear √© importante em fen√≥menos t√£o diversificados como a fertiliza√ß√£o, a forma√ß√£o de fibras musculares, a oog√©nese e a migra√ß√£o celular. A reorienta√ß√£o do centrossoma √© um processo que ocorre em fibroblastos, c√©lulas endoteliais, c√©lulas epiteliais, astr√≥citos, c√©lulas T e neur√≥nios e que leva √† polariza√ß√£o celular. Considera-se que o centrossoma est√° orientado quando este se encontra posicionado entre o n√ļcleo e a frente condutora da c√©lula na migra√ß√£o. Pensa-se que a polariza√ß√£o do centrossoma √© um fen√≥meno pr√©vio √† migra√ß√£o celular, importante para a orienta√ß√£o do Golgi, possibilitando a secre√ß√£o polarizada de precursores membranares e de factores importantes para a frente da c√©lula, possibilitando a migra√ß√£o. Durante muito tempo, pensou-se que seria o centrossoma a mover-se para uma posi√ß√£o anterior ao n√ļcleo. Hoje em dia, sabe-se que √© o n√ļcleo que se move, adquirindo uma posi√ß√£o posterior ao centrossoma. A prote√≠na Cdc42 tem um papel fundamental neste processo, conduzindo √† activa√ß√£o dos dois mecanismos necess√°rios √† reorienta√ß√£o do centrossoma: por um lado, o centrossoma √© mantido no centro da c√©lula. Este mecanismo √© dependente do complexo Par (Par6, Par3 e aPKC), da dine√≠na e de dinactina. Por outro lado, MRCK, um efector de Cdc42, activa o movimento retr√≥grado do n√ļcleo. Este movimento aparece aliado ao movimento retr√≥grado da actina, dependendo da contrac√ß√£o da miosina. Recentemente, um complexo de prote√≠nas transmembranares do inv√≥lucro nuclear foi identificado como fundamental para este movimento nuclear. Este complexo √© constitu√≠do por duas prote√≠nas, uma com um dom√≠nio SUN e a outra com um dom√≠nio KASH, ambos localizados na extremidade C-terminal da prote√≠na. Este dom√≠nio C-terminal √© altamente conservado em todos os Metazoa e em leveduras. A prote√≠na com dom√≠nio SUN localiza-se na membrana interna e interage com a lamina nuclear pela sua extremidade N-terminal. A prote√≠na com dom√≠nio KASH localiza-se na membrana externa; algumas prote√≠nas que cont√™m este dom√≠nio podem atingir dimens√Ķes de mais de 800kDa e podem interagir com a actina pelo seu dom√≠nio N-terminal. A localiza√ß√£o da prote√≠na com o dom√≠nio KASH na membrana externa √© absolutamente dependente da prote√≠na com o dom√≠nio SUN. Uma grande especula√ß√£o existe ainda em torno da reten√ß√£o da prote√≠na com o dom√≠nio SUN na membrana nuclear. Em mam√≠feros, por exemplo, a localiza√ß√£o de Sun2 parece ser parcialmente dependente da lamina nuclear, enquanto que Sun1 n√£o depende da lamina para se localizar na membrana nuclear interna. Este complexo atravessa assim todo a membrana nuclear e estabelece assim a liga√ß√£o entre o n√ļcleo e a actina. Este par proteico √© assim chamado de Complexo ‚ÄúLINC‚ÄĚ ‚Äď LIga√ß√£o entre o N√ļcleo e o Citosqueleto (LInkers of Nucleoskeleton and Cytoskeleton). Um estudo recente reporta a implica√ß√£o directa do complexo ‚ÄúLINC‚ÄĚ na reorienta√ß√£o do centrossoma em fibroblastos de ratinho. Neste caso, o par de prote√≠nas que est√° envolvido no movimento nuclear √© Sun2/Nesprin-2. Este estudo descreve pela primeira vez a exist√™ncia de cabos act√≠nicos, organizados numa posi√ß√£o dorsal em rela√ß√£o ao n√ļcleo, que se movem retrogradamente ao mesmo tempo do que o n√ļcleo. Estes cabos, e logo tamb√©m o movimento retr√≥grado de actina a eles associados, parecem ser o motor para o movimento nuclear. O envolvimento de Sun2 e Nesprin-2 √© reportado, quando se observa que ambas as prote√≠nas se co-localizam com estes cabos de actina e que a deple√ß√£o destas prote√≠nas inibe o movimento nuclear. Esta associa√ß√£o das prote√≠nas do complexo LINC com os cabos dorsais de actina define uma nova estrutura nuclear denominada de ‚Äúlinhas TAN‚ÄĚ ‚Äď linhas Nucleares Transmembranares associadas a Actina (Transmembrane Actin-associated Nuclear). A for√ßa gerada pelo movimento retr√≥grado de actina √© assim transmitida ao n√ļcleo atrav√©s destas estruturas, conduzindo ao movimento. Sabe-se que Sun2 e Nesprin-2 interagem no espa√ßo perinuclear, mas pouco ainda se sabe sobre esta interac√ß√£o. Para al√©m do mais, a localiza√ß√£o de Sun2 no inv√≥lucro nuclear continua mal elucidada. Para al√©m disso, as for√ßas aplicadas sobre estas prote√≠nas durante o movimento nuclear, sugerem o envolvimento de outras prote√≠na na estabiliza√ß√£o, organiza√ß√£o e interac√ß√£o deste complexo. Num screen de siRNA para prote√≠nas do inv√≥lucro nuclear, algumas prote√≠nas revelaram um potencial papel no movimento nuclear, entre estas a prote√≠na Tmem201. Esta prote√≠na √© conservada evolutivamente, estando presente em todos os Metazoa e ainda em S.pombe. Pouco se sabe ainda sobre esta prote√≠na, havendo apenas dois estudos realizados at√© ao momento, um em S.pombe e outro em c√©lulas humanas. Em S.pombe, o hom√≥logo de Tmem201, Ima1, participa na associa√ß√£o da heterocromatina com o complexo LINC. Ima1 √© importante para a estabiliza√ß√£o do complexo, e de facto, quando √© eliminada do sistema, observam-se deforma√ß√Ķes do inv√≥lucro nuclear e quebras no complexo LINC. Ima1 funcionar√° assim como estabilizador do complexo LINC √† membrana, fun√ß√£o ainda n√£o atribu√≠da a nenhuma outra prote√≠na em mam√≠feros. Em c√©lulas humanas, a prote√≠na hom√≥loga Samp1 aparece associada com estruturas membranares que se sobrep√Ķem ao fuso mit√≥tico. √Č tamb√©m sugerido um poss√≠vel papel desta prote√≠na na liga√ß√£o entre centrossoma e n√ļcleo. Este trabalho prop√Ķe-se elucidar o envolvimento da prote√≠na Tmem201 no movimento nuclear e na reorienta√ß√£o do centrossoma. Infelizmente, um anticorpo eficaz para a marca√ß√£o de Tmem201 n√£o est√° dispon√≠vel no mercado e assim, um dos passos fundamentais deste trabalho passou pela produ√ß√£o de um anticorpo capaz de reconhecer eficazmente as tr√™s isoformas da prote√≠na. Tal foi conseguido com sucesso, sendo poss√≠vel visualizar perfeitamente uma marca√ß√£o nuclear da prote√≠na. Uma marca√ß√£o a n√≠vel dos centrossomas, provavelmente n√£o espec√≠fica, foi tamb√©m observada. Esta prote√≠na tamb√©m foi observada em associa√ß√£o aos cabos dorsais de actina que fazem parte das linhas TAN. Este fen√≥meno √© particularmente interessante, se considerarmos que Sun2 e Nesprin-2 s√£o as duas √ļnicas prote√≠nas que foram identificadas at√© ao momento com localiza√ß√£o nestas estruturas. Tendo em conta que as laminas n√£o se encontram nas linhas TAN, Tmem201 poderia funcionar como estabilizador do complexo LINC a este n√≠vel, num papel evolutivamente conservado ao papel de Ima1 em S.pombe. O movimento nuclear e da reorienta√ß√£o do centrossoma pode ser estudado facilmente atrav√©s de um ensaio experimental em fibroblastos em cultura. Neste ensaio, √© efectuado uma les√£o linear (atrav√©s de uma ponta de pipeta) numa monocamda confluente de c√©lulas aderentes (em meio desprovido de soro). A reorienta√ß√£o do centrossoma √© depois estimulada por adi√ß√£o de um factor espec√≠fico (LPA). Atrav√©s deste ensaio, procurou-se estudar os efeitos da deple√ß√£o da prote√≠na, por siRNA, na reorienta√ß√£o do centrossoma. Verificou-se uma inibi√ß√£o da reorienta√ß√£o do centrossoma quando a prote√≠na n√£o est√° presente, o que corrobora o resultado inicial do screen efectuado. Analisando a posi√ß√£o do centrossoma e do n√ļcleo, uma forte inibi√ß√£o do movimento nuclear √© visualizada, enquanto que a posi√ß√£o do centrossoma n√£o √© afectada. Os efeitos de deple√ß√£o podem ser parcialmente recuperados aquando da microinjec√ß√£o de um plasm√≠deo que codifica para a mais pequena isoforma de Tmem201 (Tmem201 B-GFP). Os resultados obtidos implicam o envolvimento de Tmem201 no movimento nuclear. Contudo, um resultado inesperado foi obtido, aquando da microinjec√ß√£o do primeiro dom√≠nio da prote√≠na: uma deslocaliza√ß√£o do centrossoma. Este resultado sugere um poss√≠vel envolvimento tamb√©m no posicionamento do centrossoma. Atrav√©s dos ensaios de microinjec√ß√£o, foi tamb√©m poss√≠vel concluir que o primeiro dom√≠nio da prote√≠na parece estar envolvido na localiza√ß√£o nuclear da prote√≠na (visto que Tmem201 628-GFP tem uma localiza√ß√£o nuclear), enquanto que o segundo dom√≠nio da prote√≠na dever√° ter um papel no movimento do n√ļcleo (visto que apenas a Tmem201 B-GFP √© capaz de recuperar a reorienta√ß√£o do centrossoma). A inibi√ß√£o do movimento nuclear pode dever-se a diversos factores: se Tmem201 for importante na localiza√ß√£o nuclear de prote√≠nas envolvidas no movimento do n√ļcleo, ou se por acaso levar √† inibi√ß√£o do movimento retr√≥grado de actina. Verificou-se que a deple√ß√£o de Tmem201 n√£o afecta a reten√ß√£o de Sun2, Nesprin-2, lamin A/C, lamin B e Emerin. Quanto √† actina, n√£o parece haver uma altera√ß√£o do citosqueleto act√≠nico. Em suma, Tmem201 aparece implicada na reorienta√ß√£o do centrossoma, mais precisamente no movimento nuclear. Tendo em conta que n√£o afecta a localiza√ß√£o de outras prote√≠nas na membrana nuclear e n√£o altera o citosqueleto act√≠nico, Tmem201 poder√° ter um papel como estabilizador do complexo LINC na membrana nuclear, sendo importante para o movimento nuclear. Contudo, poder√° tamb√©m estar envolvida no posicionamento do centrossoma. Tmem201 poder√° assim actuar como prote√≠na reguladora das duas vias

    Estudo da proteína humana centrossomal TBCCD1: determinação de domínios funcionais

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    Tese de mestrado em Bioqu√≠mica, apresentada √† Universidade de Lisboa, atrav√©s da Faculdade de Ci√™ncias, 2011O centrossoma √© o principal centro organizador de microt√ļbulos das c√©lulas animais, desempenhando fun√ß√Ķes celulares essenciais no processo de divis√£o celular, uma vez que regula a nuclea√ß√£o e organiza√ß√£o espacial dos microt√ļbulos, estando tamb√©m implicado no posicionamento de organelos na c√©lula, como o complexo de Golgi, no estabelecimento da polaridade celular, na migra√ß√£o e ades√£o celulares e na ciliog√©nese. Nas c√©lulas animais o centrossoma encontra-se posicionado no centro da c√©lula em estreita associa√ß√£o com o n√ļcleo. Os cofactores da tubulina (TBCA-E) s√£o prote√≠nas que participam na via de folding da tubulina e possuem fun√ß√Ķes relacionadas com o citoesqueleto, desempenhando pap√©is essenciais nas c√©lulas eucariotas. A prote√≠na TBCCD1 (TBCC-domain containing protein 1) √© uma prote√≠na centrossomal relacionada com o TBCC e com a prote√≠na RP2, uma vez que possui os dom√≠nios funcionais TBCC e CARP, por√©m n√£o parece possuir actividade de GAP para a tubulina. O TBCCD1 √© um potencial regulador do posicionamento do centrossoma em estreita interac√ß√£o com o n√ļcleo e da organiza√ß√£o citoplasm√°tica. Neste trabalho descrevemos a identifica√ß√£o do dom√≠nio respons√°vel pela localiza√ß√£o centrossomal da prote√≠na TBCCD1 humana, constitu√≠do pelos primeiros 20 res√≠duos de amino√°cidos da sua regi√£o N-terminal. Em c√©lulas humanas observ√°mos que a express√£o da prote√≠na TBCCD1 com uma muta√ß√£o pontual no res√≠duo de prolina na posi√ß√£o 24 leva √† deslocaliza√ß√£o da ő≥-tubulina do centrossoma. Verific√°mos tamb√©m que tr√™s muta√ß√Ķes pontuais distintas nos motivos VxPX e KRAK da prote√≠na causam uma menor efici√™ncia na forma√ß√£o de c√≠lios prim√°rios. Concluindo, a prote√≠na centrossomal TBCCD1 humana parece ter uma liga√ß√£o √† ő≥-tubulina, contudo ainda n√£o est√° esclarecido se esta interac√ß√£o √© directa ou indirecta, podendo a ő≥-tubulina ser um parceiro molecular do TBCCD1. O TBCCD1 dever√° tamb√©m ter um papel essencial in vivo resultante do seu envolvimento na manuten√ß√£o da liga√ß√£o do centrossoma ao n√ļcleo e no processo de ciliog√©nese.The centrosome is the major microtubule organizing center in animal cells, playing an essential role in cellular processes such cell division, since it regulates the nucleation and spatial organization of microtubules, and is also implicated in organelle positioning in the cell, such as the Golgi apparatus, cell polarity establishment, cell migration and adhesion and ciliogenesis. In animal cells, the centrosome is positioned in the center of the cell in close association with the nucleus. The tubulin cofactors (TBCA-E) are proteins involved in tubulin folding pathway that have emerged as proteins with crucial roles in eukaryotic cells related to the cytoskeleton. The TBCCD1 protein (TBCC domain-containing protein 1) is a centrossomal protein related to TBCC and RP2 protein, since it contains the TBCC and CARP domains. However, TBCCD1 probably doesn‚Äôt have a GAP activity towards tubulin. The TBCCD1 is a potential regulator of the positioning of the centrosome and cytoplasmic organization. In this work we described the identification of the centrosome targeting motif of the human TBCCD1, corresponding to the first 20 amino acid residues of its N-terminus region. Our studies performed in mammalian cell lines revealed that the expression of TBCCD1 with a point mutation in the proline residue at position 24 leads to the mis-localization of ő≥-tubulin from the centrosome. Furthermore, we also found that three distinct point mutations in the motifs VxPX and KRAK lead to a lower efficiency of transfected cells to assemble primary cilia. Also, the obtained results clearly show that the human centrossomal TBCCD1 protein seems to have an interaction with ő≥-tubulin, but whether this is direct or indirect is still not clear. However, our results support the idea that ő≥-tubulin will probably be a molecular partner of TBCCD1. The TBCCD1 should also have an essential role in vivo resulting from their involvement in maintaining the nucleus-centrosome association and its involvement in ciliogenesis

    Estudo da fun√ß√£o das prote√≠nas variantes da TBCCD1 humana, uma prote√≠na chave na liga√ß√£o do centrossoma ao n√ļcleo

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    Tese de mestrado em Bioqu√≠mica, apresentada √† Universidade de Lisboa, atrav√©s da Faculdade de Ci√™ncias, 2015Com a identifica√ß√£o e o estudo do gene humano tbccd1, foi identificada uma prote√≠na, a TBCCD1, por ele codificada. Esta prote√≠na foi ent√£o descrita como sendo uma prote√≠na centrossomal, que se localiza tamb√©m nos corpos basais de c√≠lios prim√°rios e no corpo m√©dio. Foram identificados dois novos transcritos do tbccd1 resultantes de splicing alternativo, nomeadamente, variante 2 e variante 3, sendo que o transcrito variante 1 codifica a prote√≠na TBCCD1 variante 1 inicialmente descrita. O knockdown do tbccd1 utilizando siRNAs provoca v√°rios fen√≥tipos em c√©lulas hTERT RPE-1, como o aumento da dist√Ęncia centrossoma-n√ļcleo, a fragmenta√ß√£o do complexo de Golgi e a diminui√ß√£o na velocidade de migra√ß√£o em ensaios de fecho da ferida. Assim, este trabalho teve como principal objetivo o estudo da fun√ß√£o biol√≥gica de cada uma das variantes identificadas. Estudou-se a localiza√ß√£o celular de cada uma das variantes identificadas em diferentes linhas celulares humanas. Observou-se que as prote√≠nas TBCCD1 variante 2 e TBCCD1 variante 3 t√™m uma localiza√ß√£o citoplasm√°tica em todas as situa√ß√Ķes analisadas. Pelo contr√°rio, como tinha j√° sido observado, a prote√≠na TBCCD1 variante 1 localiza-se no centrossoma, no corpo m√©dio e nos corpos basais de c√≠lios prim√°rios. Curiosamente, observou-se que a localiza√ß√£o desta prote√≠na no corpo m√©dio √© dependente dos microt√ļbulos, ao contr√°rio do que acontece com a sua localiza√ß√£o centrossomal. Esta observa√ß√£o sugere ent√£o uma intera√ß√£o com microt√ļbulos do corpo m√©dio onde existe uma acumula√ß√£o de microt√ļbulos acetilados. Observou-se tamb√©m que a sobre express√£o das prote√≠nas TBCCD1 variante 1 ou TBCCD1 variante 2 provoca uma diminui√ß√£o nos n√≠veis de őĪ-tubulina acetilada, assim como de ő≥-tubulina e de ő≤-actina. J√° a sobre express√£o da prote√≠na TBCCD1 variante 3 n√£o parece afetar os n√≠veis dos componentes do citoesqueleto analisados. Estudou-se tamb√©m se o fen√≥tipo do aumento da dist√Ęncia centrossoma-n√ļcleo pode ser provocado por apenas uma das variantes ou resulta da a√ß√£o combinada de mais do que uma variante. Para isso, realizaram-se ensaios de recupera√ß√£o do fen√≥tipo, tendo-se observado que as prote√≠nas TBCCD1 variante 1 e TBCCD1 variante 2 revertem parcialmente o fen√≥tipo em estudo. Para al√©m disso, realizou-se um estudo recorrendo a RT-qPCR no qual se observou que as variantes t√™m uma fun√ß√£o de regula√ß√£o entre si. A sobre express√£o das prote√≠nas TBCCD1 variante 1 ou TBCCD1 variante 2 leva √Ä altera√ß√£o dos n√≠veis dos transcritos das variantes 1, 2 e 3. J√° a sobre express√£o da prote√≠na TBCCD1 variante 3 afeta apenas os n√≠veis do transcrito variante 3 end√≥geno. Em conjunto, os resultados obtidos neste estudo indicam que as prote√≠nas codificadas pelos tr√™s transcritos identificados dever√£o ter diferentes fun√ß√Ķes celulares. Para al√©m disso, as prote√≠nas TBCCD1 variante 1 e TBCCD1 variante 2 afetam os n√≠veis de őĪ-tubulina acetilada, ő≥-tubulina e ő≤-actina, o que pode afetar, por exemplo, a organiza√ß√£o do complexo de Golgi e a migra√ß√£o celular, atrav√©s da regula√ß√£o da din√Ęmica dos microt√ļbulos. Assim, estes resultados contribuem de forma decisiva para a compreens√£o dos fen√≥tipos observados nas experi√™ncias do knockdown do tbccd1.When the human gene tbccd1 was identified and studied, a protein, TBCCD1, that it encoded was also identified. This protein was then described as a centrossomal protein that also localizes at the basal bodies of primary cilia and to the midbody. Two new transcripts of tbccd1 originated by alternative splicing were identified, namely, variant 2 and variant 3, and it is now known that variant 1 encodes the TBCCD1 protein initially described. The knockdown of tbccd1 using siRNAs causes several phenotypes in hTERT RPE-1 cells, such as the increase in centrosome-nucleus distance, fragmentation of the Golgi apparatus and a decrease of the cell migration in wound healing assays. The main goal of this work was to study the biological function of each of the identified tbccd1 variants. In this study, the cellular localization of each of the variants in different human cell lines was accessed. TBCCD1 variant 2 and TBCCD1 variant 3 proteins have a cytoplasmic localization in all the situations analyzed. As it has already been described, TBCCD1 variant 1 protein localizes at the centrosome, the basal bodies of primary cilia and to the midbody. Interestingly, it was shown that the midbody localization of this protein is dependent on microtubules, while its centrossomal localization is not. This observation suggested an interaction of this protein with a population of microtubules in the midbody where they are highly acetylated. Overexpression of TBCCD1 variant 1 or TBCCD1 variant 2 causes a decrease on acetylated őĪ-tubulin levels, and also on ő≥-tubulin and ő≤-actin levels. The overexpression of TBCCD1 variant 3 does not seem to affect the levels of any of the cytoskeleton components analyzed. It was also studied if the increased centrosome. Nucleus distance phenotype is caused by only one or a combination of the identified variants. In order to do this, we performed phenotype rescue assays, and it was shown that overexpression of TBCCD1 variant 1 or TBCCD1 variant 2 can partially rescue this phenotype. Moreover, we used RT-qPCR to study whether the identified variants have a regulatory function between them, and showed that TBCCD1 variant 1 or TBCCD1 variant 2 overexpression affects the levels of the three transcripts. On the other hand, the overexpression of TBCCD1 variant 3 only affects variant 3 endogenous transcript levels. Taken together, the results obtained in this study indicate that the proteins encoded by the three transcripts might have different cellular functions. Furthermore, TBCCD1 variant 1 and TBCCD1 variant 2 affect acetylated őĪ-tubulin, ő≥-tubulin and ő≤-actin levels which may be implicated on, for example, Golgi apparatus organization and cell migration by the regulation of microtubules dynamics. Therefore, this results contributed to the comprehension of the causes of the tbccd1 knockdown phenotypes

    Estudo de padr√Ķes de express√£o de transcritos alternativos do gene tbccd1 em tecidos humanos e linhas celulares cancer√≠genas

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    Disserta√ß√£o para obten√ß√£o do grau de Mestre em Biologia Molecular em Sa√ļdeO centrossoma √© um organito essencial nos eucariotas sendo o principal centro organizador de microt√ļbulos nas c√©lulas animais. √Č composto por um par de centr√≠olos e rodeado por uma matriz pericentriolar. Em c√©lulas em interfase, os centrossomas est√£o envolvidos na nuclea√ß√£o/organiza√ß√£o dos microt√ļbulos, no posicionamento dos organitos, e.g. o complexo de Golgi, no estabelecimento da polaridade e ainda na migra√ß√£o e ades√£o, por sua vez em mitose facilitam a forma√ß√£o dos fusos mit√≥ticos.Estudos realizados pelo nosso grupo, identificaram uma nova prote√≠na humana, que contem o dom√≠nio TBCC (TBCCD1), a qual est√° relacionada com o cofator C da tubulina, o qual participa na via de folding da tubulina apresentando uma atividade GAP (GTPase activating protein) para a ő≤-tubulina. O TBCCD1 √© um componente centrossomal, localizando-se tamb√©m na zona mediana do fuso, corpo m√©dio e corpos basais/zona de transi√ß√£o de c√≠lios prim√°rios e m√≥veis. O silenciamento do TBCCD1 em c√©lulas RPE-1 provocou um aumento acentuado da dist√Ęncia n√ļcleo-centrossoma, um atraso no ciclo celular, desorganiza√ß√£o do complexo de Golgi e baixa efici√™ncia para formar c√≠lios prim√°rios. Atrav√©s de t√©cnicas de an√°lise mutacional identificou-se o dom√≠nio m√≠nimo necess√°rio √† localiza√ß√£o do TBCCD1 no centrossoma, o qual corresponde aos 20 primeiros res√≠duos de amino√°cidos da sua regi√£o N-terminal.O splicing alternativo do pr√©-mRNA √© um passo cr√≠tico para a express√£o de genes sendo a principal fonte para a diversidade de prote√≠nas nos eucariotas superiores. Atualmente pensa-se que ocorre em mais de 90% dos genes humanos. A prote√≠na TBCCD1 humana √© codificada por um gene localizado no cromossoma 3 (3q27.3) e apresenta a sua regi√£o codificante interrompida por 7 intr√Ķes. O presente estudo permitiu verificar que este gene origina tr√™s transcritos diferentes pelo processo de splicing alternativo. Um destes transcritos resulta do facto que existem dois primeiros ex√Ķes alternativos, que originam duas prote√≠nas putativas diferindo nos primeiros res√≠duos de amino√°cidos da sua N-terminal. Esta sequ√™ncia de amino√°cidos alternativos corresponde no TBCCD1 ao dom√≠nio envolvido na sua localiza√ß√£o centrossomal. De facto, as duas novas variantes apresentam uma localiza√ß√£o citoplasm√°tica n√£o se localizando no centrossoma

    Fun√ß√Ķes celulares da prote√≠na centrossomal humana TBCCD1: prote√≠nas interatuantes e papel na din√Ęmica dos microt√ļbulos

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    Tese de mestrado em Bioqu√≠mica, apresentada √† Universidade de Lisboa, atrav√©s da Faculdade de Ci√™ncias, 2015A prote√≠na humana centrossomal TBCCD1 est√° envolvida na liga√ß√£o do centrossoma ao n√ļcleo. A diminui√ß√£o dos n√≠veis do TBCCD1 causa a quebra do eixo de polaridade intr√≠nseca ‚ÄúN√ļcleo-Centrossoma-Complexo de Golgi‚ÄĚ em consequ√™ncia da anormal localiza√ß√£o do centrossoma na periferia da c√©lula a qual √© acompanhada por uma desorganiza√ß√£o do complexo de Golgi. Recentemente, foram identificadas variantes de splicing alternativo desta prote√≠na que se localizam exclusivamente no citoplasma. Neste trabalho pretendeu-se esclarecer as fun√ß√Ķes da prote√≠na TBCCD1 e da TBCCD1 variante 2, atrav√©s i) do estudo do efeito da deple√ß√£o da TBCCD1 na din√Ęmica dos microt√ļbulos e no citoesqueleto de actina e ii) da identifica√ß√£o das suas prote√≠nas interatuantes, recorrendo ao m√©todo de BioID. Apesar de a TBCCD1 ter um dom√≠nio que a associa com a actina e interagir com v√°rias prote√≠nas que t√™m como fun√ß√Ķes polimerizar os filamentos de actina, em particular nas jun√ß√Ķes c√©lula-c√©lula e de ades√£o, n√£o foi poss√≠vel identificar nenhuma rela√ß√£o clara entre a TBCCD1 e os filamentos de actina nas c√©lulas depletadas de TBCCD1. Este trabalho permitiu concluir que a TBCCD1 tem um papel importante na estabiliza√ß√£o dos microt√ļbulos em c√©lulas hTERT-RPE-1, em particular de uma subpopula√ß√£o de microt√ļbulos que rodeia o n√ļcleo e que se localiza preferencialmente do lado do centrossoma. Esta subpopula√ß√£o de microt√ļbulos regula parcialmente o posicionamento do centrossoma em rela√ß√£o ao n√ļcleo nestas c√©lulas. Observou-se ainda que a deple√ß√£o da TBCCD1 causa a dispers√£o da prote√≠na centrossomal CEP170, que se associa a esta subpopula√ß√£o de microt√ļbulos, e fica dispersa no citoplasma das c√©lulas depletadas de TBCCD1. Neste trabalho foi tamb√©m poss√≠vel estabelecer o interatoma da TBCCD1 e da TBCCD1 variante 2. Assim, observou-se que a TBCCD1 interatua com prote√≠nas com distintas fun√ß√Ķes celulares, estando principalmente envolvida na din√Ęmica dos microt√ļbulos, com a integridade do centrossoma e na polaridade celular, particularmente no estabelecimento e manuten√ß√£o das jun√ß√Ķes celulares. A an√°lise do interatoma, conjuntamente com os resultados obtidos no estudo da din√Ęmica dos microt√ļbulos, sugere que a TBCCD1 seja uma prote√≠na adaptadora que promove a intera√ß√£o entre diferentes prote√≠nas. A TBCCD1 variante 2, por outro lado, interage sobretudo com chaperones moleculares, prote√≠nas mitocondriais e centrom√©ricas. Embora √† primeira vista estas intera√ß√Ķes possam parecer n√£o estar relacionadas, uma an√°lise mais detalhada mostra que a TBCCD1 variante 2 poder√° estar envolvida na montagem e organiza√ß√£o de estruturas complexas como os cinetocoros e a organiza√ß√£o do genoma mitocondrial atrav√©s da intera√ß√£o direta com os diferentes componentes ou atrav√©s da intera√ß√£o com chaperones moleculares.The human centrosomal protein TBCCD is involved in the connection between the centrosome and the nucleus. Lower TBCCD1 levels lead to a disrupture of the intrinsic cell polarity axis ‚ÄúNucleus-Centrosome-Golgi Apparatus‚ÄĚ due to an abnormal localization of the centrosome in the cell periphery, which is accompanied by the fragmentation of the Golgi apparatus. Recently, TBCCD1 splicing variants that localize exclusively in the cytoplasm have been identified. In this work we aimed at clarifying what are the cellular functions of TBCCD1 and TBCCD1 variant 2 by i) studying the effect of TBCCD1 depletion in the microtubule network and actin cytoskeletons dynamics and ii) identifying their interacting proteins using the BioID method. Although TBCCD1 has a domain able to associate this protein with actin and TBCCD1 interacts with several proteins that have a role in actin polymerization, particularly in cell-cell and adhesion junctions, it was not possible to identify a clear relationship between TBCCD1 and the actin filaments in TBCCD1-depleted cells. This work allowed us to conclude that TBCCD1 has an important role in microtubule stabilization in hTERT-RPE-1 cells, in particularly in a microtubule subpopulation surrounding the nucleus which is localized preferentially near the centrosome. This microtubule subpopulation partially regulates the centrosome-nucleus positioning. We also observed that TBCCD1 depletion causes cytoplasmic dispersion of the centrosomal protein CEP170, which is associated with this microtubule subpopulation. In this work we also established the TBCCD1 and TBCCD1 variant 2 interactomes. TBCCD1 interacts with several proteins with distinct functions, mainly involved in microtubule dynamics, centrosome integrity and cell polarity, and also in the establishment and maintenance of cell junctions. Both the interactome analysis and the results obtained with the microtubule dynamic studies suggest that TBCCD1 may function as a promoter of the interaction between distinct proteins. TBCCD1 variant 2, in other hand, interacts mainly with molecular chaperones and mitochondrial and centromeric proteins. Although it may seem that these interactions are not related with which other, a more detailed analysis shows that TBCCD1 variant 2 protein can be involved in the assembly and organization of complex structures, such as the kinetochores and the organization of the mitochondrial genome either through the direct interaction with the different components or through the interaction with molecular chaperones

    Estudo da prote√≠na humana centrossomal TBCCD1 em condi√ß√Ķes de stress oxidativo causadas por H202 em estado estacion√°rio

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    Tese de mestrado, Bioqu√≠mica (Bioqu√≠mica M√©dica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ci√™ncias, 2010O per√≥xido de hidrog√©nio (H2O2) embora seja um oxidante relativamente fraco, √© capaz de alterar o n√≠vel de oxida√ß√£o dos grupos ti√≥is ao reagir com res√≠duos de ciste√≠nas. Essas propriedades tornam o H2O2 uma das esp√©cies reactivas de oxig√©nio (ERO) com potencialidade para participar em vias de sinaliza√ß√£o. Deste modo, o desencadeamento de uma determinada via de sinaliza√ß√£o, ou a sua modula√ß√£o, dever√° ocorrer pelo aumento tempor√°rio das concentra√ß√Ķes de H2O2, como por exemplo, durante a resposta inflamat√≥ria. Por outro lado, a exposi√ß√£o prolongada a algumas ERO t√™m vindo a ser relacionada com o in√≠cio, progress√£o e desenvolvimento tumoral. Muitos dos tumores s√£o caracterizados por aneuploidia e anormalidades centrossomais. Por exemplo, c√©lulas de mam√≠fero expostas a H2O2, por bolus addition, apresentam centrossomas supra-numer√°rios. Neste contexto iniciou-se o estudo da influ√™ncia de concentra√ß√Ķes sinalizadoras de H2O2 nos n√≠veis de duas prote√≠nas centrossomais, a prote√≠na TBCCD1 (TBCC-domain containing protein 1) e a y‚ąítubulina nas linhas celulares humanas HeLa e hTERT-RPE-1. O TBCCD1 √© um potencial regulador do posicionamento do centrossoma e da organiza√ß√£o citoplasm√°tica, a y‚ąítubulina √© uma prote√≠na chave na nuclea√ß√£o dos microt√ļbulos nos centros organizadores de microt√ļbulos, como o centrossoma. Por western blot mostrou-se, em ambas as linhas celulares, o aumento dos n√≠veis de TBCCD1 ao longo do tempo de exposi√ß√£o de H2O2 em estado estacion√°rio. A an√°lise da velocidade de consumo de H2O2 em c√©lulas hTERT-RPE-1 que sobre-expressam a prote√≠na de fus√£o TBCCD1-GFP mostrou um rela√ß√£o directa desta com o aumento dos n√≠veis de TBCCD1-GFP. Esta prote√≠na, na presen√ßa de H2O2, varia de modo an√°logo √† prote√≠na end√≥gena. Estudos similares mostraram a diminui√ß√£o dos n√≠veis de y‚ąítubulina ao longo do tempo de exposi√ß√£o de H2O2. Por microscopia de imunofluoresc√™ncia indirecta observou-se tamb√©m a diminui√ß√£o dos n√≠veis desta prote√≠na no centrossoma em c√©lulas HeLa. Observou-se ainda uma altera√ß√£o da capacidade de nuclea√ß√£o dos microt√ļbulos pelo centrossoma e uma modifica√ß√£o na organiza√ß√£o destes ap√≥s repolimeriza√ß√£o em c√©lulas previamente tratadas com nocodazole e ap√≥s remo√ß√£o desta. No conjunto, estes resultados mostram que ambos os n√≠veis destas prote√≠nas variam na presen√ßa de baixos concentra√ß√Ķes de H2O2, constituindo este trabalho uma abordagem inicial do efeito do H2O2 em concentra√ß√Ķes reguladoras no centrossoma.The hydrogen peroxide (H2O2) although a relatively weak oxidant, is highly reactive with sulfhydryl groups. These properties make the H2O2 a reactive oxygen species (ROS) with the potential to participate as a regulator in signaling pathways. Thus, the temporary increase in the concentrations of H2O2 should trigger or modulate a signal pathway, such as during the inflammatory response. Moreover, prolonged exposure to some ROS has been related with the initiation, progression and tumor development. Many tumors are characterized by aneuploidy and centrosomal abnormalities. For example, mammalian cells exposed to H2O2 by bolus addition showed supra-numerary centrosomes. In this context we began the study of the influence of signaling concentrations of H2O2 in the levels of two centrosomal proteins, protein TBCCD1 (TBCC domain-containing protein 1) and y ‚ąí tubulin in HeLa and hTERT-RPE-1 human cell lines. The TBCCD1 is a potential regulator of the positioning of the centrosome and cytoplasmic organization and the y ‚ąí tubulin is a key protein in the nucleation of microtubules on microtubule organizing centers, such as the centrosome. By western blot, we detected in both cell lines, increased levels of TBCCD1 over time of exposure to a steady state of H2O2. The analysis of H2O2 consumption by intact hTERT-RPE-1 cells that over-expresses the fusion protein TBCCD1-GFP showed a direct relationship of this with increased levels of TBCCD1-GFP. Noteworthy, in the presence of H2O2, the TBCCD1-GFP levels, showed the same variation that those of the endogenous protein. Similar studies showed that ‚ąítubulin levels decreased of upon an exposition to H2O2. By immunolocalization microscopy we observed in HeLa cells a decrease of y ‚ąí tubulin‚Äôs levels at the centrosome. To investigate if this observation has an impact in the ability of centrosomes to nucleate microtubules we have treated HeLa cells, previously exposed to steady-state levels of H2O2, with the antimitotic drug nocodozole. After washing out this microtubule depolymerizing agent we follow microtubule repolymerization by immunofluorescence microscopy. We observed that cells treated with H2O2 present a different ability to nucleate microtubules in comparison to control cells. At end these cells presented a distinct organization of the microtubule cytoskeleton. Taken together the results presented in this work show that a low concentration of H2O2 promotes a variation of the TBCCD1 and y ‚ąí tubulin‚Äôs levels. Therefore, this work constitutes an initial approach to the study of the impact at the centrosome of H2O2 at levels expected for a signaling role

    Identification and characterization of new players involved in the centriole maintenance program

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    Tese de mestrado em Bioqu√≠mica, apresentada √† Universidade de Lisboa, atrav√©s da Faculdade de Ci√™ncias, 2017O centrossoma √©, em c√©lulas animais, o principal centro organizador de microt√ļbulos (COMT). Em interfase regula a mobilidade, ades√£o e polaridade celulares, enquanto que em mitose participa na forma√ß√£o e organiza√ß√£o do fuso mit√≥tico. Cada centrossoma √© composto por dois centr√≠olos. Os centr√≠olos s√£o estruturas cil√≠ndricas formadas por nove microt√ļbulos (organizados em singletos, dupletos ou tripletos) dispostos de forma radial em redor de uma estrutura central (a cartwheel). Um dos centr√≠olos do par √© denominado de centr√≠olo-m√£e, enquanto que o outro, ortogonalmente disposto em rela√ß√£o ao primeiro √© denominado de centr√≠olo-filho. Um centr√≠olo tem aproximadamente 200nm de largura e pode possuir entre 200 a 500nm de comprimento, dependendo do tipo de c√©lula. Em conjunto ambos os centr√≠olos recrutam e participam na organiza√ß√£o de uma matriz proteica densa - o material pericentriolar ‚Äď que os rodeia e √© respons√°vel pela nuclea√ß√£o de microt√ļbulos. Finalmente, em fases espec√≠ficas de diferencia√ß√£o, os centr√≠olos associam-se √† membrana celular para formar a corpo basal, a partir do qual crescer√° o c√≠lio ou flagelo da c√©lula. A simetria radial dos centr√≠olos √© extremamente conservada nos diferentes ramos da √°rvore filogen√©tica, por√©m a estrutura centriolar pode variar ligeiramente de esp√©cie para esp√©cie. Em Humanos os centr√≠olos s√£o compostos por nove tripletos de microt√ļbulos, ao passo que os centr√≠olos em Drosophila melanogaster s√£o formados por nove dupletos de microt√ļbulos. Em algumas esp√©cies os centr√≠olos-m√£e possuem ap√™ndices distais e sub-distais que permitem a liga√ß√£o do centr√≠olo √† membrana celular e a ancoragem de microt√ļbulos, respetivamente. O n√ļmero de centr√≠olos presente nas c√©lulas √© altamente controlado, e a sua duplica√ß√£o √© regulada tanto temporalmente - em coordena√ß√£o com a replica√ß√£o do DNA - como espacialmente - apenas um centr√≠olo-filho se forma junto a cada centr√≠olo-m√£e por cada novo ciclo celular. Dependendo da fase do ciclo celular em que se encontra, a maioria das c√©lulas tem um (fase G1) a dois centrossomas (fase S, G2 e M) (dois a quatro centr√≠olos). Altera√ß√Ķes no n√ļmero de centr√≠olos est√£o associadas a diversas doen√ßas como o cancro, microcefalia ou ciliopatias. Diferentes estudos demonstram que os centrossomas s√£o resistentes a tratamentos de despolimeriza√ß√£o de microt√ļbulos. Consequentemente, estes organelos s√£o descritos como estruturas altamente est√°veis; no entanto, v√°rias observa√ß√Ķes t√™m demonstrado que os centrossomas n√£o s√£o estruturas intrinsecamente est√°veis como inicialmente se pensava. Em diversos sistemas celulares estes organelos podem ser eliminados ou inativados, como na gametog√©nese feminina ou em c√©lulas diferenciadas, respetivamente. A elimina√ß√£o de centrossomas durante a oog√©nese √© comum na maioria dos metazo√°rios, equinodermes e mol√ļsculos. Por√©m, enquanto que no caso dos metazo√°rios a elimina√ß√£o dos centrossomas ocorre antes das divis√Ķes mei√≥ticas, em equinodermes e mol√ļsculos estas estruturas s√≥ desaparecem durante as divis√Ķes mei√≥ticas. A elimina√ß√£o dos centrossomas durante a gametog√©nese feminina implica que o embri√£o dependa do centr√≠olo fornecido pelo esperma para que ocorram as primeiras divis√Ķes celulares no embri√£o, ap√≥s a fertiliza√ß√£o. A elimina√ß√£o de centrossomas na oog√©nese √© um processo biol√≥gico muito importante e o conhecimento dos mecanismos que o regulam √© ainda muito esca√ßo. Um estudo publicado recentemente pelo nosso grupo desvendou um mecanismo de regula√ß√£o da elimina√ß√£o de centrossomas durante a oog√©nese em Drosophila. Em Drosophila a oog√©nese inicia-se no germ√°rio com a divis√£o assim√©trica de uma c√©lula estaminal que d√° origem a uma nova c√©lula estaminal e um cistoblasto. O cistoblasto sofre quatro divis√Ķes consecutivas com citocinese incompleta formando um grande cisto composto por dezasseis c√©lulas em que apenas uma dar√° origem ao o√≥cito, sendo que as restantes s√£o denominadas de nurse cells. Nesta fase, os centrossomas das nurse cells agrupam-se e migram para o o√≥cito, formando um grande COMT que se desintegra ao longo da oog√©nese, e que portanto, n√£o participa na forma√ß√£o do fuso mei√≥tico. No referido estudo observou-se que durante a oog√©nese a cinase Polo (Polo like kinase em humanos) √© deslocalizada do centrosoma. Sendo a Polo respons√°vel pelo recrutamento do material pericentriolar, tamb√©m este √© perdido durante o processo. Consistentemente, a remo√ß√£o da Polo dos centr√≠olos do o√≥cito, leva √† perda prematura de centrossomas durante a oog√©nese, ao passo que a express√£o ect√≥pica desta prote√≠na com a sua localiza√ß√£o for√ßada nos centr√≠olos do o√≥cito, leva √† reten√ß√£o de centrossomas at√© √† fase de divis√£o mei√≥tica, com acumula√ß√£o de prote√≠nas do material perientriolar. Esta reten√ß√£o anormal de centrossomas nos √≥ocitos levou √† falha do desenvolvimento embrion√°rio ap√≥s a fertiliza√ß√£o. Os resultados obtidos neste estudo e reproduzidos com sucesso em c√©lulas de Drosophila, sugerem que as prote√≠nas que formam o material pericentriolar, auxiliadas pela Polo, funcionam como um escudo protetor √† volta dos centr√≠olos impedindo a sua destabiliza√ß√£o, o que pressup√Ķe a exist√™ncia de um mecanismo de manuten√ß√£o da estabilidade dos centr√≠olos. Em situa√ß√Ķes em que os centrossomas s√£o eliminados, como nos o√≥citos, este mecanismo de estabiliza√ß√£o √© desativado: a Polo e as prote√≠nas do material pericentriolar deixam de ser acumuladas no centrossoma, levando √† sua destabiliza√ß√£o e consequente elimina√ß√£o. De forma semelhante ao que acontece na oog√©nese em Drosophila, em c√©lulas diferenciadas - como o m√ļsculo esquel√©tico, neur√≥nios ou c√©lulas epiteliais - a inativa√ß√£o dos centrossomas tamb√©m parece ser realizada atrav√©s da remo√ß√£o das prote√≠nas do material percientriolar, sugerindo que o mecanismo de estabilidade de centrossomas n√£o √© exclusivo para a oog√©nese, mas sim universal. Paralelamente, o mecanismo que permite a estabiliza√ß√£o dos centrossomas mediado pelas prote√≠nas do material pericentriolar e pela Polo permanece pouco claro. As prote√≠nas do material pericentriolar poder√£o funcionar como um escudo que impede: (1) o acesso de prote√≠nas que possam destabilizar os centr√≠olos; ou (2) a sa√≠da de prote√≠nas que contribuem para a estabilidade dos centr√≠olos. De forma a identificar prote√≠nas envolvidas no mecanismo de estabiliza√ß√£o dos centr√≠olos foi realizado um rastreio (screen) por RNA de interfer√™ncia (RNAi) em c√©lulas de Drosophila melanogaster bloqueadas na fase S durante oito dias. O bloqueio nas c√©lulas em fase S impede o funcionamento do ciclo de duplica√ß√£o de centr√≠olos permitindo desacoplar estabilidade e biog√©nese centrossomal. Desta forma, o numero de centr√≠olos √© mantido constante, o que permite tirar vantagem para analisar o efeito (d)estabilizador das diferentes prote√≠nas testadas. As c√©lulas foram transfectadas com RNAi‚Äôs espec√≠ficos para diferentes prote√≠nas (prote√≠nas candidatas) que foram descritas como fazendo parte da estrutura do centrossoma. Foram depletadas prote√≠nas do material pericentriolar, prote√≠nas centriolares como as da cartwheel, da parede centriolar e da zona distal do centr√≠olo (cap) e ainda a Polo like kinase 4 (Plk4), a principal reguladora da biog√©nese dos centrossomas. O efeito que a remo√ß√£o destas prote√≠nas provocou na estabilidade dos centrossomas foi analisado atrav√©s do n√ļmero de centr√≠olos por c√©lula utilizando ensaios de imunofluoresc√™ncia, no qual os centrossomas foram detetados utilizando anticorpos espec√≠ficos para diferentes prote√≠nas de diferentes partes/m√≥dulos do centrossoma. Os resultados obtidos foram comparados com um controlo (mCherry RNAi) e sempre que o n√ļmero de centr√≠olos era reduzido comparativamente ao controlo foi considerado que a prote√≠na era importante para a estabiliza√ß√£o do centrossoma. Os nossos estudos sugerem que os m√≥dulos que contribuem significativamente para a estabilidade dos centrosomas incluem prote√≠nas do material pericentriolar, da parede centriolar e da cartwheel. Por outro lado, as prote√≠nas da cap e Plk4 n√£o parecem apresentar um papel relevante na estabilidade do centrossoma. De todas as prote√≠nas candidatas testadas, a prote√≠na da parede centriolar Ana1 revelou um dos fen√≥tipos de perda de centr√≠olos mais forte. Assim, prosseguimos com o estudo desta prote√≠na in vivo. Simultaneamente, express√°mos ectopicamente a Polo e deplet√°mos a Ana1 nos centrossomas de √≥ocitos de Drosophila. Observ√°mos uma redu√ß√£o na manuten√ß√£o dos centr√≠olos em est√°dios avan√ßados da oog√©nese sugerindo que a Ana1 apresenta um papel extremamente importante na estabilidade dos mesmos. Em conjunto, este estudo demonstra a import√Ęncia das prote√≠nas do material pericentriolar, da cartwheel e da parede centriolar para a manuten√ß√£o e estabiliza√ß√£o do centrossoma. Foi ainda poss√≠vel identificar uma prote√≠na que poder√° ter um papel preponderante no mecanismo de estabiliza√ß√£o dos centr√≠olos. Contudo, √© necess√°rio investigar qual o papel dos diferentes m√≥dulos do centrossoma (o material pericentriolar, a cartwheel e a parede centriolar) na sua estabiliza√ß√£o e compreender se estes t√™m fun√ß√Ķes espec√≠ficas ou redundantes. √Č igualmente importante perceber qual o papel da Ana1 no mecanismo de estabiliza√ß√£o dos centr√≠olos, assim como a sua rela√ß√£o com a Polo e com as prote√≠nas do material pericentriolar. Apenas o conhecimento detalhado do mecanismo que confere estabilidade aos centrossomas nos permitir√° atuar sobre este mecanismo quando desregulado em doen√ßas como o cancro.Organelle inheritance and its persistence is essential not only upon cell division, but also differentiation, fertilization and disease. Amongst those, a structure that always raised much interest is the centrosome. The centrosome is the primary microtubule-organizing centre (MTOC) in animal cells, regulating cell shape and polarity in interphase, and spindle pole organization during mitosis. The centrosome is formed by two orthogonally arranged centrioles that are surrounded by a matrix of proteins called the pericentriolar material (PCM), which is essential for microtubule (MT) nucleation. Control of centriole number and function is very important, and dysfunction of these organelles is associated with a variety of human diseases. Despite being resistant to MT depolymerization and instability, centrosomes are eliminated from the oocytes from most metazoan species and can be inactivated in differentiated cells, suggesting that centrosomes are not intrinsically stable. It is not completely understood how centrosomes are eliminated or inactivated. However, a recent study in Drosophila melanogaster proved the existence of a centriole maintenance program. This program ensures centriole stability through PCM maintenance, which protects the centrosome, and is mediated by Polo kinase. To allow centriole elimination in the oocyte, this program is ‚Äúshut down‚ÄĚ. Perturbing this program prevents centriole loss and leads to female sterility. In order to identify new players involved in the centriole maintenance program, we performed a RNAi screen in Drosophila cultured cells. We chose candidate proteins that were described as components of the different modules of the centrosome and depleted them in S-phase arrested cells. We showed that while removal of some of the modules of the centrosome strongly destabilize the centrosome, others do not have a major effect in centrosome destabilization. Out of all the candidate proteins tested, the centriolar wall protein Ana1 showed the strongest effect on centrosome destabilization. We show that depletion of Ana1 in Drosophila oogenesis impairs PCM accumulation mediated by Polo, suggesting that this protein has a key role in the centriole maintenance program. Together, these results allowed us to identify the principal structural features that contribute to centrosome stability and also brought us new insights into the centriole maintenance program. However, further studies are needed to understand how this program is regulated which is important not only for successful sexual reproduction, but also for centriole life span and its impact on different tissues in homeostasis and disease, shaping the cytoskeleton

    Unravelling the role of Ctdnep1-Eps8L2 interaction during nuclear positioning in migrating fibroblasts

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    Tese de mestrado, Biologia Molecular e Gen√©tica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ci√™ncias, 2019As c√©lulas eucari√≥ticas posicionam ativamente e de forma precisa o seu n√ļcleo no citoplasma. Este posicionamento √© crucial para processos como a divis√£o, diferencia√ß√£o e migra√ß√£o celulares. Durante a migra√ß√£o celular, o n√ļcleo torna-se particularmente importante ao estar envolvido no estabelecimento de polaridade, integra√ß√£o de for√ßas intracelulares e deforma√ß√£o nuclear para permitir o movimento da c√©lula por constri√ß√Ķes reduzidas. Estes processos dependem largamente do tipo de c√©lula e do substrato de migra√ß√£o. Diferentes c√©lulas iniciam a sua motilidade com o posicionamento do n√ļcleo na zona posterior da c√©lula, enquanto o centrossoma (est√°tico) assume uma localiza√ß√£o entre a frente migrante e o n√ļcleo (onde o centrossoma se diz reorientado). Logo, surge na c√©lula uma polariza√ß√£o frente migrante-centrossoma-n√ļcleo na dire√ß√£o de migra√ß√£o. Este movimento nuclear √© promovido por cabos dorsais de actina em movimento retr√≥grado que se ligam a prote√≠nas do inv√≥lucro nuclear provenientes do complexo de Liga√ß√£o do Nucleoesqueleto e Citoesqueleto (LINC), formando linhas Nucleares Transmembranares associadas a Actina (TAN). Apesar do complexo LINC ser o protagonista no modelo atual de acoplamento entre o n√ļcleo e o citoesqueleto, outras prote√≠nas t√™m sido identificadas na regula√ß√£o do complexo LINC para a forma√ß√£o das linhas TAN. Contudo, o conhecimento sobre como a actina √© organizada ou se existe outro mecanismo independente do complexo LINC √© escasso. Recentemente no laborat√≥rio Gomes, foram identificadas duas novas prote√≠nas envolvidas no movimento nuclear. S√£o elas a Fosfatase 1 do Inv√≥lucro Nuclear de Dom√≠nio C-terminal (Ctdnep1) e a Prote√≠na 2 de Substrato Tipo 8 de Recetor Cinase do Fator de Crescimento Epid√©rmico (Eps8L2). A Ctdnep1 (previamente designada por Dullard) √© uma fosfatase localizada no inv√≥lucro nuclear e no ret√≠culo endoplasm√°tico. Esta prote√≠na foi descrita pela primeira vez em Xenopus laevis por participar no desenvolvimento do tubo neuronal. Atualmente, a Ctdnep1 √© mais conhecida pelo seu papel na desfosforila√ß√£o e ativa√ß√£o das Lipinas-1 e -2 em mam√≠feros e, consequentemente, na regula√ß√£o do metabolismo global de √°cidos gordos. Para esta desfosforila√ß√£o ocorrer, √© requerida a presen√ßa da Subunidade Reguladora da Fosfatase 1 do Inv√≥lucro Nuclear (Nep1-r1). A Eps8L2 √© uma prote√≠na do citoesqueleto pertencente √† fam√≠lia de prote√≠nas Eps8. Funcionalmente, a Eps8L2 √© mais conhecida pelo seu papel no complexo Sos1-Abi1-PI3K-Eps8L2, necess√°rio para a ativa√ß√£o da GTPase Rac, resultando na remodela√ß√£o da actina no citoesqueleto. Adicionalmente, para regular a din√Ęmica da actina, a Eps8L2 √© capaz de limitar a polariza√ß√£o dos filamentos de actina atrav√©s do bloqueio dos terminais de r√°pido crescimento (atividade conhecida como capping da actina) e promover liga√ß√Ķes cruzadas entre filamentos de actina formando estruturas mecanicamente mais resistentes (atividade conhecida como bundling da actina). A atividade de bundling da actina encontra-se amplamente descrita na manuten√ß√£o dos estereoc√≠lios na c√≥clea. Previamente no laborat√≥rio Gomes, demonstrou-se que, em fibroblastos migrantes, o knockdown de Ctdnep1 ou Eps8L2 resulta numa defici√™ncia no movimento retr√≥grado do n√ļcleo e na reorienta√ß√£o do centrossoma, fen√≥menos relacionados com uma poss√≠vel regula√ß√£o da organiza√ß√£o dos cabos dorsais de actina por Ctdnep1 e Eps8L2. Assim, na aus√™ncia destas prote√≠nas, o principal mecanismo de posicionamento nuclear e migra√ß√£o celular em fibroblastos encontra-se danificado. Adicionalmente, foi identificada uma intera√ß√£o f√≠sica e direta entre Ctdnep1 e Eps8L2. Contudo, n√£o tinha sido totalmente explorado o modo como esta intera√ß√£o est√° relacionada com o posicionamento nuclear. Neste trabalho, caracteriza-se a intera√ß√£o entre Ctdnep1 e Eps8L2 relativamente √† sua localiza√ß√£o subcelular, mecanismo e papel durante a migra√ß√£o celular. Para estudar a localiza√ß√£o subcelular da Ctdnep1 e da Eps8L2 em fibroblastos migrantes, realizou-se o knockin de marcadores (GFP e miRFP670, respetivamente) nas prote√≠nas end√≥genas em c√©lulas NIH 3T3, utilizando o sistema de Repeti√ß√Ķes Palindr√≥micas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespa√ßadas (CRISPR)/Prote√≠na 9 Associada a CRISPR (Cas9). Para enriquecer a popula√ß√£o celular em c√©lulas positivas para GFP ou miRFP670, realizou-se Separa√ß√£o Celular Ativada por Fluoresc√™ncia (FACS). Contudo, apesar de serem recolhidas entre 1000 e 2000 c√©lulas positivas por knockin, n√£o foi poss√≠vel observar c√©lulas positivas ao microsc√≥pio, sendo frequentemente observada uma morte celular extensa ap√≥s um curto per√≠odo em cultura. Adicionalmente, uma segunda sele√ß√£o por FACS n√£o enriqueceu o n√ļmero de c√©lulas positivas. Para testar se a Cas9 n√£o estava a realizar o corte em dupla cadeia na sequ√™ncia-alvo e, consequentemente, as c√©lulas n√£o apresentavam a edi√ß√£o desejada, c√©lulas NIH 3T3 foram transduzidas com as sequ√™ncias codificantes para a Cas9 e os gRNAs utilizados anteriormente. Por sequencia√ß√£o do DNA gen√≥mico, observou-se que a Cas9 estava efetivamente a cortar as sequ√™ncias gen√≥micas na regi√£o pretendida, validando os gRNAs utilizados. Adicionalmente, para investigar se as localiza√ß√Ķes subcelulares da Ctdnep1 e da Eps8L2 s√£o influenciadas entre si, est√£o a ser geradas linhas celulares com knockouts para EPS8L2 ou CTDNEP1 em c√©lulas transduzidas com gRNAs que t√™m como alvo a regi√£o do cod√£o de inicia√ß√£o. Numa segunda abordagem ao estudo da localiza√ß√£o subcelular, geraram-se linhas celulares NIH 3T3 a expressar estavelmente sequ√™ncias codificantes para Ctdnep1-GFP, Ctdnep1_D67E-GFP (a variante mutada sem atividade de fosfatase) ou Eps8L2-GFP. Utilizando estas linhas celulares, demonstrou-se que a Ctdnep1 se localiza no inv√≥lucro nuclear e no ret√≠culo endoplasm√°tico, independentemente da sua atividade de fosfatase. J√° a Eps8L2 apresenta uma localiza√ß√£o distribu√≠da pelo citoplasma. Assim, tendo em conta a restri√ß√£o da localiza√ß√£o da Ctdnep1 ao inv√≥lucro nuclear e ao ret√≠culo endoplasm√°tico, especialmente perto do n√ļcleo, sugere-se que esta seja a regi√£o de intera√ß√£o entre a Ctdnep1 e a Eps8L2. Contudo, algumas c√©lulas n√£o apresentavam os mesmos padr√Ķes de express√£o, sendo esta visivelmente mais baixa, traduzindo a perda da express√£o das prote√≠nas marcadas ao longo do tempo. Consequentemente, as linhas celulares n√£o se encontravam totalmente est√°veis, sendo necess√°ria uma sele√ß√£o mais restrita de c√©lulas positivas para GFP. Adicionalmente, questionou-se sobre a natureza da intera√ß√£o direta entre Ctdnep1 e Eps8L2. Tendo em considera√ß√£o a atividade de fosfatase da Ctdnep1, colocou-se a hip√≥tese de que a Ctdnep1 desfosforila a Eps8L2, o que resulta na ativa√ß√£o da capacidade da Eps8L2 para promover o bundling da actina. Consequentemente, formam-se cabos de actina espessos o suficiente para uma liga√ß√£o eficiente ao complexo LINC, promovendo o movimento do n√ļcleo. Para testar esta hip√≥tese, Eps8L2 e Ctdnep1 (wild type ou D67E) exclusivamente ou na presen√ßa da subunidade reguladora Nep1-r1 foram co-expressas em c√©lulas U2OS. Por espetrometria de massa, foi poss√≠vel identificar os fosfores√≠duos em Eps8L2 e estudar diferen√ßas no estado de fosforila√ß√£o entre condi√ß√Ķes. Mais especificamente, os fosfores√≠duos S479 e S480 apresentaram um sinal de fosforila√ß√£o significantemente inferior na presen√ßa de Ctdnep1 e Nep1-r1, comparativamente a Ctdnep1_D67E. Assim, estas serinas apresentam-se como poss√≠veis substratos para a desfosforila√ß√£o da Eps8L2 pela Ctdnep1. Quanto ao seu papel na migra√ß√£o celular, atrav√©s de ensaios de cicatriza√ß√£o de feridas, demonstrou-se que aquando do knockdown de Ctdnep1 ou Eps8L2, n√£o existe um impacto na migra√ß√£o celular em 2D. Contudo, esta observa√ß√£o n√£o descarta a hip√≥tese de Ctdnep1 e Eps8L2 desempenharem pap√©is determinantes para a migra√ß√£o celular em 3D. De facto, em substratos 3D as propriedades da matriz extracelular podem impor constri√ß√Ķes √ļnicas na migra√ß√£o celular, com a consequente utiliza√ß√£o de vias moleculares fundamentalmente diferentes da migra√ß√£o em 2D, para deformar ou posicionar o n√ļcleo. Assim, a possibilidade da intera√ß√£o Ctdnep1-Eps8L2 ser determinante para a migra√ß√£o em matrizes 3D dever√° ser explorada. Coletivamente, neste trabalho aprofunda-se o papel da intera√ß√£o entre Ctdnep1 e Eps8L2 na organiza√ß√£o da actina, bem como, as suas implica√ß√Ķes durante o posicionamento nuclear. Outros pormenores necessitam de ser explorados, tais como, a poss√≠vel fun√ß√£o desta intera√ß√£o na mecano-transdu√ß√£o e express√£o g√©nica, a coordena√ß√£o entre a intera√ß√£o Ctdnep1-Eps8L2 e outras previamente descritas para a regula√ß√£o da din√Ęmica do complexo LINC e linhas TAN ou o papel da intera√ß√£o na migra√ß√£o em matrizes 3D. Em √ļltima inst√Ęncia, este estudo refor√ßa a necessidade de identificar novos intervenientes na complexa e refinada rede molecular que regula o posicionamento nuclear. A identifica√ß√£o e caracteriza√ß√£o destes intervenientes √© crucial para uma melhor compreens√£o de correla√ß√Ķes fisiol√≥gicas importantes, particularmente entre posicionamento nuclear e doen√ßa.Positioning the nucleus within the cell is crucial for cell division, differentiation and proper migration. Different cells initiate their motility by positioning the nucleus to the cell rear, setting up a leading edge-centrosome-nucleus polarization in the direction of migration. This nuclear movement is promoted by retrograde moving dorsal actin cables that bind to the Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC) complex at the nuclear envelope, forming what is known as Transmembrane Actin-associated Nuclear (TAN) lines. In the last years, several proteins have been identified as regulators of the LINC complex for TAN lines formation. However, little is known about how actin is organized or if there is any other LINC complex-independent mechanism in this process. Recently in Gomes lab, two proteins were identified as novel players in nuclear movement: the C-Terminal Domain Nuclear Envelope Phosphatase 1 (Ctdnep1) and the Epidermal Growth Factor Receptor Kinase Substrate 8-Like Protein 2 (Eps8L2). These proteins were shown to physically and directly interact, being determinant for TAN line-dependent nuclear positioning in migrating fibroblasts by regulating dorsal actin cables organization. However, is not yet well understood how Ctdnep1-Eps8L2 interaction is coupled to nuclear positioning. Here, we further characterize this interaction regarding its subcellular localization, mechanistic basis and role in cell migration. Through the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR Associated Protein 9 (Cas9) system, it is attempted to tag the endogenous Ctdnep1 and Eps8L2 in NIH 3T3 cells to study its subcellular localization. However, this approach was unsuccessful, since no positively tagged cells were observed after Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) selection. As an alternative, using NIH 3T3 stable cell lines expressing tagged versions of Ctdnep1 or Eps8L2, it is demonstrated that Ctdnep1 localizes to the nuclear envelope and endoplasmic reticulum (regardless of its phosphatase activity), while Eps8L2 localizes to the cytoplasm. Given that Ctdnep1 localization is restricted to the nuclear envelope and endoplasmic reticulum, especially near the nucleus, it is suggested that this should be the region where Ctdnep1 and Eps8L2 interact. Taking advantage of the CRISPR/Cas9 tools developed, currently, Eps8L2 and Ctdnep1 knockout cell lines are being generated to further inquire if the subcellular localization of the two proteins influences one another. Furthermore, it is hypothesized that Ctdnep1 may control Eps8L2 activity by dephosphorylation, regulating perinuclear actin organization and, thus, affecting nuclear positioning and cell migration. Through mass spectrometry analysis, S479 and S480 are identified as possible phosphorylation sites for Eps8L2 and, thus, potential substrates for Ctdnep1 phosphatase activity. Additionally, wound-healing assays were performed to further enquire about Ctdnep1 and Eps8L2 role in cell migration. In the present experimental conditions, Ctdnep1-Eps8L2 interaction did not present a role in 2D-cell migration. Collectively, this work provides data that further pursues the role of Ctdnep1 and Eps8L2 interaction in actin organization as well as its implications during nuclear positioning. Other details regarding this interaction should also be explored, such as its possible function in mechanotransduction and gene expression, its coordination with other previously reported mechanisms for regulating LINC complex and TAN lines dynamics or its role in 3D cell migration. Ultimately, this work sheds light on the importance of identifying new players in the complex and refined network that regulates nuclear positioning. Deciphering the mechanisms connecting the nucleus to the cytoskeleton is valuable to better understand important physiological correlations between nuclear positioning and disease

    Development of non viral vectors for gene delivery based on dynein light chain Rp3

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    Orientadores: Adriano Rodrigues Azzoni, Anete Pereira de SouzaTexto em portugu√™s e ingl√™sDisserta√ß√£o (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Entrega g√™nica √© uma estrat√©gia muito promissora com grande potencial m√©dico, que consiste na introdu√ß√£o de √°cidos nucl√©icos ex√≥genos, e pode ser aplicada tanto para terapia g√™nica quanto para vacina de DNA. Contudo seu uso ainda √© limitado pela falta de um vetor de entrega ideal, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora muito mais eficientes, os vetores virais ainda despertam preocupa√ß√Ķes a respeito de sua seguran√ßa. Por outro lado, vetores n√£o-virais s√£o muito mais seguros e facilmente manipul√°veis, ainda que menos eficientes. Neste contexto, "v√≠rus artificiais" s√£o uma op√ß√£o interessante, uma vez que s√£o vetores n√£o-virais desenvolvidos para explorar a arquitetura celular de uma forma eficiente, superando uma s√©rie de barreiras f√≠sicas, enzim√°ticas e difusionais, mas mantendo a seguran√ßa do DNA plasmidial (pDNA). O principal objetivo da abordagem estudada √© explorar os motores moleculares, como dine√≠na, para transportar cargas da periferia para o centrossoma de c√©lulas de mam√≠feros atrav√©s da rede de microt√ļbulos. Para isso, a cadeia leve Rp3 da dine√≠na foi fusionada a um dom√≠nio de intera√ß√£o com DNA (DNA-binding) no N-terminal, e ao pept√≠deo membrano-ativo TAT no C-terminal. A prote√≠na, nomeada T-Rp3, tem ainda um His-Tag. Esta prote√≠na recombinante constru√≠da cont√©m ent√£o diferentes dom√≠nios para promover condensa√ß√£o do pDNA (DNA binding), para facilitar a entrada na c√©lula e no n√ļcleo (TAT) e para aumentar o escape endossomal (His- Tag), al√©m da pr√≥pria Rp3 que deve assistir no tr√°fego intracelular, agindo assim diretamente na maioria dos principais obst√°culos intracelulares enfrentados pelos vetores. Estudos de express√£o indicam que a prote√≠na recombinante √© corretamente expressa em E. coli BL21(DE3). Experimentos de mobilidade em gel de agarose ("gel retardation assay") combinados com estudos de espalhamento de luz e potencial zeta indicam que a prote√≠na efetivamente interage com o pDNA, formando complexos que s√£o pequenos (~95 nm) e positivamente carregados (+28 mV na rela√ß√£o molar de pDNA:prote√≠na 1:8000). Ensaios de transfec√ß√£o em cultura de c√©lulas HeLa indicam que T-Rp3 atinge uma efici√™ncia de transfec√ß√£o muito maior que a prote√≠na nuclear Protamina (aqui usada como controle), chegando a ser 900 vezes maior a express√£o relativa do gene rep√≥rter na rela√ß√£o molar de pDNA:prote√≠na 1:8000. Na compara√ß√£o com Lipofectamina 2000TM, um reagente bem caracterizado de transfec√ß√£o aqui usado como controle positivo, a T-Rp3 demonstrou atingir n√≠veis similares de efici√™ncia, com a vantagem adicional de ser menos citot√≥xica, conforme evidenciado em ensaios de viabilidade celular. Transfec√ß√Ķes realizadas na presen√ßa da droga Nocodazol indicam que a efici√™ncia da T-Rp3 depende fortemente da rede de microt√ļbulos, uma vez que a efici√™ncia √© reduzida em 92% quando os microt√ļbulos est√£o despolimerizados. A partir das transfec√ß√Ķes na presen√ßa da droga Cloroquina, pudemos observar que o aprisionamento no endossomo ainda √© um fator limitante. Finalmente, ensaios de cromatografia de afinidade realizados com o dom√≠nio da cadeia intermedi√°ria de dine√≠na imobilizado indicam que a cadeia leve recombinante T-Rp3 mant√©m a capacidade de interagir com o complexo da dine√≠na. Analisados em conjunto, os resultados apontam para uma grande participa√ß√£o da rede de microt√ļbulos na efici√™ncia de transfec√ß√£o de T-Rp3, objetivo inicial deste trabalhoAbstract: Gene delivery is a promising technique with great medical potential that consists in the introduction of exogenous nucleic acids, and can be applied for gene therapy as well as DNA vaccination. However, its use is still limited by the lack of an ideal delivery vector, which is both safe and efficient. Although much more effective, viral vectors still raise several concerns about its safety. On the other hand, non-viral vectors are safer and easier to manipulate, but less efficient. In this context "artificial viruses" are an interesting option, since they are non-viral vectors intended to explore the cell's architecture in an efficient way, to overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers, while still preserving the safety of plasmid DNA (pDNA) vectors. The main objective herein is to exploit molecular motors, like dynein, to transport cargoes from the periphery to the centrosome of mammalian cells via the microtubule network. For that, human dynein light chain Rp3 was fusioned to a N-terminal DNA binding domain and a C-terminal membrane active peptide, TAT. The protein, named T-Rp3, has additionally a His.Tag. The shuttle protein built contains therefore different domains to promote pDNA condensation (DNA binding), to increase cell and nucleus penetration (TAT) and to enhance endosomal escape (His.Tag), besides the Rp3 to assist in the cytosol trafficking, thus covering most of the major obstacles to the vectors in intracellular level. Expression studies indicate that the fusion protein was correctly expressed in soluble form using E. coli BL21(DE3) strain. Gel retardation assays, dynamic light scattering and zeta potential studies indicate an efficient complex formation between pDNA and the fusion protein, resulting in a particle that is both small (~95 nm) and potivelly charged (+28 mV in the molar ratio of pDNA:protein 1:8000) Transfection of cultured HeLa cells indicates that T-Rp3 has a much higher transfection efficiency when compared to the nuclear protein Protamine (here used as a control), reaching a 900-fold increase in expression of transfected reporter gene, both in the same molar ratio of pDNA:protein 1:8000. When compared to Lipofectamine 2000TM, a well-known transfection reagent here used as a control, T-Rp3 showed to reach similar levels of efficiency, but with the further advantage of being less cytotoxic, as observed in cell viability assays. Transfections performed in the presence of the drug Nocodazole indicate that T-Rp3 efficiency largely depends on the microtubule network, since its efficiency is reduced by 92% when microtubules are depolymerized. From transfections in the presence of Choroquine we can deduce that endosomal entrapment remains a limiting factor. Finally, affinity chromatography experiments performed with the immobilized domain of dynein intermediate chain demonstrate that the recombinant light chain T-Rp3 retains the ability to interact with the dynein complex. Taken together, these results point to a strong participation of the microtubule network in the enhanced efficiency of T-Rp3MestradoGenetica de MicroorganismosMestre em Gen√©tica e Biologia Molecula
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