140 research outputs found

    Antibodies immobilization

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    Human Cytomegalovirus (HCMV) is a herpes virus that establishes a lifelong latent infection which, in most of the immunocompetent individuals is normally subclinical. Severe infections occur more frequently in immunocompromised ones, or those with immature immune system, for which can be fatal. Glycoprotein B (gB) is the dominant antigen of HCMV envelope being regarded as a promising component in the establishment of new diagnostic tests. Nowadays there are several diagnosis methods, however, these are expensive, or/and require long time to perform, or/and need skilled operators, or even leads to the possibility of false results. So, in previously work, a disposable immunosensor was developed based on electrochemical silver oxidation as response for gB concentration increasing, using screen-printing carbon electrodes. This method allows a faster and inexpensive way to detect that viral protein. Despite that, a lack on device reproducibility and sensitivity, due to the randomly antibody adsorption was found. It is known that the oriented immobilization has become critical for optimized antigen detection on solid surfaces; therefore, those results lead us to employ other immobilization techniques to improve the immunosensor performance. In this work the immobilization of antibodies was carried out through glutaraldehyde cross-linking, by covalent immobilization using diazonium salts and finally by using the boronic acid affinity towards the carbohydrate present on the antibody molecules. The results were conclusive only for the cross-linking, which has disadvantages when compared with adsorption. Additionally, the importance of the gB on diagnosis tests for HCMV, lead us to study its isolated electrochemical behavior. Questionable results were found demonstrating the impossibility of its use in the determination of gB in biological samples.O Citomegalov√≠rus humano (HCMV) √© um herpes v√≠rus que pode originar infe√ß√Ķes prim√°rias, a partir das quais a reativa√ß√£o poder√° ser frequente. Quando os hospedeiros deste agente viral s√£o indiv√≠duos imunocompetentes, √© geralmente associada uma lat√™ncia do HCMV que eventualmente poder√° resultar em sintomas subcl√≠nicos. No entanto, em indiv√≠duos imunocomprometidos, tais como os portadores do v√≠rus da imunodefici√™ncia humana (HIV) e os sujeitos a terap√™uticas imunossupressoras ou ainda em indiv√≠duos cujo sistema imune √© imaturo, como √© o caso de fetos e rec√©m-nascidos, a infe√ß√£o adquire propor√ß√Ķes graves, podendo resultar na morte dos mesmos. Este v√≠rus apresenta um inv√≥lucro rico em prote√≠nas virais das quais a glicoprote√≠na B (gB) se destaca, pois est√° presente em aproximadamente 100% dos indiv√≠duos infetados, sendo tamb√©m reconhecida por desencadear a produ√ß√£o de anticorpos neutralizantes que levam √† elimina√ß√£o das c√©lulas infetadas. Assim, esta prote√≠na pode ser vista como um componente essencial no diagn√≥stico da infe√ß√£o por HCMV. A defini√ß√£o de um diagn√≥stico ideal para o HCMV tem sido dif√≠cil de implementar devido √†s desvantagens apresentadas pelos m√©todos existentes, que se baseiam em informa√ß√Ķes clinicas e imunol√≥gicas. Definido como m√©todo convencional, o isolamento do v√≠rus em culturas de fibroblastos, obtido a partir de bi√≥psias ou de fluidos dos hospedeiros, tem associadas as desvantagens de exigir assepsia total e longos per√≠odos de tempo para a sua execu√ß√£o. Para contrapor as dificuldades desta t√©cnica, um m√©todo id√™ntico, o ‚ÄúShell-vial‚ÄĚ, reduz o tempo do ensaio atrav√©s de um passo de centrifuga√ß√£o que aumenta a penetra√ß√£o do HCMV nos fibroblastos, que por sua vez pode ser avaliada por imunofluoresc√™ncia. No entanto, o sucesso deste m√©todo continua a depender das condi√ß√Ķes ass√©pticas usadas. Por outro lado, o PCR (‚ÄúPolimerase Chain Reaction‚ÄĚ), analisa amostras cl√≠nicas com uma r√°pida performance e elevada sensibilidade, conseguida na amplifica√ß√£o de ADN viral. Contudo, o elevado custo e a dificuldade de realiza√ß√£o contrap√Ķem-se ao seu uso como t√©cnica de diagn√≥stico corrente. Outra t√©cnica, ELISA (‚ÄúEnzyme-Linked Immunosorbent Assay‚ÄĚ), deteta a presen√ßa de anticorpos espec√≠ficos no sangue, o que pode levar a falsos positivos devido a rea√ß√Ķes cruzadas com o fator reumatoide, anticorpos antinucleares e outros membros da fam√≠lia herpesviridae. Usado para medir a afinidade e avidez do anticorpo para o antig√©nio viral, o ‚ÄúWestern Blotting‚ÄĚ apresenta uma baixa disponibilidade comercial conjugada tamb√©m com a possibilidade de falsos positivos. Por √ļltimo, testes citol√≥gicos/histol√≥gicos permitem observar inclus√Ķes virais em bi√≥psias de tecidos do hospedeiro, contudo apresentam igualmente uma baixa sensibilidade tendo apenas 50% de sucesso na identifica√ß√£o de falsos negativos. Todos os m√©todos t√™m associadas desvantagens quanto a falsos resultados, ou equipamentos e/ou procedimentos caros, que podem estar ou n√£o relacionados a uma dif√≠cil manipula√ß√£o e elevado tempo de realiza√ß√£o. Desta forma, para contrariar estes inconvenientes, num estudo anteriormente realizado neste grupo de investiga√ß√£o, foi desenvolvido um imunossensor eletroqu√≠mico descart√°vel para a dete√ß√£o do HCMV, tendo por base uma imunorrea√ß√£o do tipo sandwich na qual o anticorpo secund√°rio estava marcado com nanopart√≠culas de ouro (AbNPs). Esta marca√ß√£o permitiu a posterior deposi√ß√£o catal√≠tica de nanopart√≠culas de prata (AgNPs), que geraram um sinal eletroqu√≠mico na sua redissolu√ß√£o an√≥dica por voltametria de pulso diferencial. O uso de el√©trodos serigrafados (SPEs) como base para o immunosensor, acrescenta vantagens tais como a miniaturiza√ß√£o, baixo custo, versatilidade e principalmente a possibilidade de uso como ‚Äúpoint of care‚ÄĚ. Adicionalmente, a facilidade de produ√ß√£o destes dispositivos por impress√£o sequencial de camadas de tintas, oferece vantagens na manipula√ß√£o de padr√Ķes e geometrias conforme o pretendido. O maior desafio na constru√ß√£o deste tipo de biossensores, passa pela imobiliza√ß√£o dos anticorpos na superf√≠cie dos el√©trodos. Est√° descrito na literatura que a imobiliza√ß√£o de anticorpos de forma orientada resulta numa melhor exposi√ß√£o dos locais de liga√ß√£o aos antig√©nios, exibindo melhores capacidades de liga√ß√£o e posterior dete√ß√£o dos mesmos. De facto, foram detetadas algumas limita√ß√Ķes relacionadas com este passo de constru√ß√£o do imunossensor, uma vez que os anticorpos anti-HCMV se encontravam adsorvidos de uma forma aleat√≥ria na superf√≠cie do el√©trodo de trabalho. Desta forma, as mol√©culas de anticorpo apresentam uma orienta√ß√£o nem sempre ideal afetando a reprodutibilidade e a sensibilidade do dispositivo na resposta a concentra√ß√Ķes de gB do HCMV. Assim, com o objetivo de melhorar as caracter√≠sticas do immunosensor descart√°vel, neste trabalho foram aplicadas v√°rias t√©cnicas para a imobiliza√ß√£o dos anticorpos anti-HCMV, tais como a reticula√ß√£o, imobiliza√ß√£o covalente atrav√©s de sais de diaz√≥nio e por √ļltimo usando a afinidade do √°cido bor√≥nico para os a√ß√ļcares presentes nas mol√©culas de anticorpo. O glutaralde√≠do, usado como agente reticulante, permitiu a imobiliza√ß√£o das mol√©culas de anticorpo anti-HCMV na superf√≠cie dos SPEs. O sistema mostrou responder √†s concentra√ß√Ķes incubadas de gB, levando a respostas dependentes das mesmas. Comparativamente aos resultados obtidos para a adsor√ß√£o, a reticula√ß√£o demonstrou ter associadas algumas desvantagens em termos de reprodutibilidade e de sensibilidade, devido √† imposi√ß√£o da liga√ß√£o dos anticorpos pelos dom√≠nios de liga√ß√£o ao antig√©nio. Por outro lado, em condi√ß√Ķes favor√°veis, a adsor√ß√£o pode resultar numa orienta√ß√£o favor√°vel dos anticorpos, uma vez que as mol√©culas t√™m a liberdade para se adaptarem √† superf√≠cie pela conjuga√ß√£o de diversos fatores, nomeadamente a sua reorienta√ß√£o favor√°vel na zona de satura√ß√£o. Quanto √† imobiliza√ß√£o covalente foram encontradas interfer√™ncias na ativa√ß√£o da superf√≠cie dos el√©trodos. As vias condutoras de prata presentes nos el√©trodos serigrafados geram uma esp√©cie desconhecida de prata que impossibilita o estudo da efici√™ncia de imobiliza√ß√£o, levando a uma incompatibilidade com o m√©todo de dete√ß√£o usado no imunossensor. Por fim, uma primeira abordagem foi realizada para a imobiliza√ß√£o dos anti-HCMV atrav√©s da afinidade do √°cido bor√≥nico para os res√≠duos de a√ß√ļcar presentes na estrutura dos anticorpos. Os resultados preliminares demonstraram ser promissores para uma futura aplica√ß√£o neste imunossensor. Finalmente, a reconhecida import√Ęncia da gB no diagn√≥stico do HCMV remeteu-nos para o estudo do seu comportamento eletroqu√≠mico. Este estudo permitiu ainda inferir sobre a possibilidade de esta prote√≠na viral interferir no sinal obtido durante a redissolu√ß√£o an√≥dica das AgNPs no immunosensor. A an√°lise foi primeiramente conduzida em SPE, os quais n√£o possibilitaram a procura de um sinal associado √† gB, permitindo no entanto concluir que n√£o h√° interfer√™ncia desta mol√©cula no imunoensaio. Quando aplicado num sistema eletroqu√≠mico convencional, a gB gerou um sinal em meio tamponado, o que n√£o se confirmou quando aplicado a amostras reais (urina)

    Nanocrystalline diamond film for biosensor applications

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    In this study, we have developed a novel capacitive biosensor based oil interdigitated gold nanodiamond (GID-NCD) electrode for detection of C-reactive protein (CRP) antigen. CRP is one of the plasma proteins known as acute-phase proteins and its levels rise dramatically during inflammatory processes occurring in the body. It has been reported that CRP in serum can be used for risk assessment of cardiovascular diseases. The antibodies immobilization were confirmed by Fourier transform spectroscopy (FTIR) and contact angle measurements. In this capacitive biosensor, nanocrystalline diamond acting as a dielectric layer between the electrodes. The CRP antigen detection was performed by capacitive/dielectric-constant measurements. Our results showed that the response of NCD-based capacitive-based biosensor for CRP antigen was dependent on both concentration (25-800 ng/ml) as well as frequency (50-350 MHz). Furthermore, using optimized conditions, the biosensors developed in this study can be potentially used for detection of elevated level of risk markers protein in suspected subjects for early diagnosis of disease

    Paper based analytical device modified with nanoporous material for the fluorescent sensing of gliadin content in different food samples

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    A novel fluorescent paper based immunosensor for the quantification of gliadin content in different food samples was constructed. The device consists of a paper platform modified with amino functionalized mesoporous material. The nanoporous structure and the aminofunctionality increased the anti-gliadin antibodies immobilization capacity of the sensing surface, conferring high sensitivity to the system. The detection limit reached by the described system allowed us to address the control of gluten free foods, which is extremely important to maintain the food safe consumption by patients with celiac disease, wheat allergy measured by immunoglobulin E, non-celiac gluten intolerance and Dermatitis herpetiformis or Duhring disease. The gliadin determination was performed by applying a noncompetitive immunoassay format, where gliadin present in food samples was recognized by anti-gliadin antibodies immobilized on the mesoporous material and quantified by the addition of anti-gliadin antibody labelled with peroxidase, its substrate: hydrogen peroxide and a mediator: 10-acetyl-3,7-dihydrofenoxacin. This mediator by the action of the enzyme generates resorufin, which was excited by a light emitting diode at 550 nm and emitted a signal at 580 nm. The calibration curve obtained for gliadin exhibited a linear range between 0 and 160 őľg Kg‚ąí1 and a method detection limit of 0.025 mg Kg‚ąí1. The obtained values for relative recovery varied between 98.65% and 102.33% for samples enriched with gliadin. Also, the results suggested that the developed fluorescent paper based immunosensor showed good reproducibility and stability, indicating its applicability for high-sensitive gluten free food control analysis.Fil: Marin Barroso, Evelyn del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; Argentina; ArgentinaFil: Moreira, Cristian Matias. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; Argentina; ArgentinaFil: Messina, Germ√°n Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; Argentina; ArgentinaFil: Bertolino, Franco Adri√°n. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; Argentina; ArgentinaFil: Alderete, Mara. Universidad Nacional de San Martin. Instituto de Nanosistemas; ArgentinaFil: Soler Illia, Galo Juan de Avila Arturo. Universidad Nacional de San Martin. Instituto de Nanosistemas; ArgentinaFil: Raba, Julio. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; Argentina; ArgentinaFil: Pereira, Sirley Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; Argentina; Argentin

    Covalent Immobilization of Antibodies through Tetrazine-TCO Reaction to Improve Sensitivity of ELISA Technique

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    This research was funded by Compra Publica Precomercial, Reference 2012/000069, Ministerio de Economia y Competitividad, Espana. ONCOVER project: Volatile compound detection system for early cancer diagnosis.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is routinely used to detect biomolecules related to several diseases facilitating diagnosis and monitoring of these, as well as the possibility of decreasing their mortality rate. Several methods have been carried out to improve the ELISA sensitivity through antibodies immobilization on the microtiter plates. Here, we have developed a strategy of antibodies immobilization to improve the ELISA sensitivity increasing the antibody density surface through the tetrazine (Tz)-trans-cyclooctene (TCO) reaction. For this, we prepared surfaces with tetrazine groups while the captured antibody was conjugated with TCO. The tetrazine surfaces were prepared in two different ways: (1) from aminated plates and (2) from Tz-BSA-coated plates. The surfaces were evaluated using two sandwich ELISA models, one of them using the low-affinity antibody anti-c-myc as a capture antibody to detect the c-myc-GST-IL8h recombinant protein, and the other one to detect the carcinoembryonic human protein (CEA). The sensitivity increased in both surfaces treated with tetrazine in comparison with the standard unmodified surface. The c-myc-GST-IL8h detection was around 10-fold more sensible on both tetrazine surfaces, while CEA ELISA detection increased 12-fold on surfaces coated with Tz-BSA. In conclusion, we show that it is possible to improve the ELISA sensitivity using this immobilization system, where capture antibodies bond covalently to surfaces.Compra Publica Precomercial, Ministerio de Economia y Competitividad, Espana 2012/00006

    A Biosensor-CMOS Platform and Integrated Readout Circuit in 0.18-őľm CMOS Technology for Cancer Biomarker Detection

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    This paper presents a biosensor-CMOS platform for measuring the capacitive coupling of biorecognition elements. The biosensor is designed, fabricated, and tested for the detection and quantification of a protein that reveals the presence of early-stage cancer. For the first time, the spermidine/spermine N1 acetyltransferase (SSAT) enzyme has been screened and quantified on the surface of a capacitive sensor. The sensor surface is treated to immobilize antibodies, and the baseline capacitance of the biosensor is reduced by connecting an array of capacitors in series for fixed exposure area to the analyte. A large sensing area with small baseline capacitance is implemented to achieve a high sensitivity to SSAT enzyme concentrations. The sensed capacitance value is digitized by using a 12-bit highly digital successive-approximation capacitance-to-digital converter that is implemented in a 0.18 őľm CMOS technology. The readout circuit operates in the near-subthreshold regime and provides power and area efficient operation. The capacitance range is 16.137 pF with a 4.5 fF absolute resolution, which adequately covers the concentrations of 10 mg/L, 5 mg/L, 2.5 mg/L, and 1.25 mg/L of the SSAT enzyme. The concentrations were selected as a pilot study, and the platform was shown to demonstrate high sensitivity for SSAT enzymes on the surface of the capacitive sensor. The tested prototype demonstrated 42.5 őľS of measurement time and a total power consumption of 2.1 őľW

    Screen Printed Carbon Electrode Based Microfluidic Biosensor for Sweat Cortisol Detection

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    A simple, cost-effective, microfluidic, field-deployable biosensor with screen printed carbon electrode (SPCE) was developed for detection of sweat cortisol with point of care applications. Cortisol detection in artificial sweat is an important screening tool for diagnosis and monitoring of various health conditions like Addison’s disease, stress disorder, and Cushing’s syndrome. A self-assembled monolayer of graphene oxide (GO) is functionalized on SPCE electrode, onto which cortisol antibodies are immobilized for cortisol detection. Microfluidic system ensured precise and controlled flow of reagents and antibodies. Electrochemical measurement is done using cyclic voltammetry, as a function of cortisol concentrations. Cyclic voltammetry measurement gives current magnitude with applied voltage as a function of time. Scanning Electron Microscopy (SEM) imaging shows the change in surface morphology with the addition of antibody, compared to bare electrode functionalized with GO. The images confirm the antibody binding to selfassembled GO nanosurface on the working electrode. Raman imaging also supports the advantages of surface functionalization with antibodies. It shows presence of GO and antibodies on the biosensor surface suggesting GO self-assembly and antibodies immobilization. Atomic Force Microscopy (AFM) imaging shows surface topography of the developed sensor upon immobilization of self-assembled GO. The evenly distributed GO provided more surface area for antibodies immobilization. Cortisol was detected in the linear range of 0.1 ng/ml to 150 ng/ml, where current magnitude decreased with increasing cortisol concentration due to reduction in number of free electrons. The developed microfluidic biosensor for cortisol detection formed the base for sweat cortisol sensor with POC applications, and can also be used in personalized health diagnosis or monitoring

    Subtractive Inhibition Assay for the Detection of E. coli O157:H7 Using Surface Plasmon Resonance

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    A surface plasmon resonance (SPR) immunosensor was developed for the detection of E. coli O157:H7 by means of a new subtractive inhibition assay. In the subtractive inhibition assay, E. coli O157:H7 cells and goat polyclonal antibodies for E. coli O157:H7 were incubated for a short of time, and then the E. coli O157:H7 cells which bound antibodies were removed by a stepwise centrifugation process. The remaining free unbound antibodies were detected through interaction with rabbit anti-goat IgG polyclonal antibodies immobilized on the sensor chip using a BIAcore 3000 biosensor. The results showed that the signal was inversely correlated with the concentration of E. coli O157:H7 cells in a range from 3.0 √ó 104 to 3.0 √ó 108 cfu/mL with a detection limit of 3.0 √ó 104 cfu/mL. Compared with direct SPR by immobilizing antibodies on the chip surface to capture the bacterial cells and ELISA for E. coli O157:H7 (detection limit: both 3.0 √ó 105 cfu/mL in this paper), the detection limit of subtractive inhibition assay method was reduced by one order of magnitude. The method simplifies bacterial cell detection to protein-protein interaction, which has the potential for providing a practical alternative for the monitoring of E. coli O157:H7 and other pathogens

    Mesoporous immunosensor applied to zearalenone determination in Amaranthus cruentus seeds

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    We describe an electrochemical immunosensor for zearalenone (ZEA) determination in Amaranthus cruentus seeds by an enzyme immunoassay sandwich type. The device is based on a screen-printed carbon electrode (SPCE) modified with amino mesoporous silica (MCM-41) synthetized with Fe2O3 in situ. Mesoporous material enlarges the surface available for anti-ZEA antibodies immobilization. SPCE/MCM-41-Fe2O3 was characterized by scanning electron microscopy, energy dispersive X-ray spectroscopy, and cyclic voltammetry. ZEA in the sample previously pretreated was recognized and captured by anti-ZEA on SPCE/MCM-41-Fe2O3. Then, the horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-ZEA-antibody was added, and the substrate solution (H2O2 + 4-terbutylcatechol (4-TBC)) reacted with the HRP that catalyzed the oxidation of 4-TBC to 4-terbutylbenzoquinone (TBQ). Finally, the enzymatic product was detected at ‚ąí100 mV, and the current was proportional to the ZEA present in the sample. The calibration plot exhibited a linear range from 1.88 to 45 ng mL‚ąí1, and the limit of detection was 0.57 ng mL‚ąí1 (r2 = 0.998). The coefficient of variation inter- and intra assay was below 6%. Our method achieved a good selectivity, stability and reproducibility for ZEA detection in A. cruentus seeds.Fil: Regiart, Daniel Matias Gaston. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; Argentina; ArgentinaFil: Fern√°ndez, Odil Nancy. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Ingenier√≠a y Ciencias Agropecuarias; ArgentinaFil: Vicario, Ana Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; ArgentinaFil: Villarroel Rocha, Jhonny. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de F√≠sica Aplicada "Dr. Jorge Andr√©s Zgrablich". Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Ciencias F√≠sico Matem√°ticas y Naturales. Instituto de F√≠sica Aplicada "Dr. Jorge Andr√©s Zgrablich"; ArgentinaFil: Sapag, Manuel Karim. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de F√≠sica Aplicada "Dr. Jorge Andr√©s Zgrablich". Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Ciencias F√≠sico Matem√°ticas y Naturales. Instituto de F√≠sica Aplicada "Dr. Jorge Andr√©s Zgrablich"; ArgentinaFil: Messina, Germ√°n Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; ArgentinaFil: Raba, Julio. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; ArgentinaFil: Bertolino, Franco Adri√°n. Consejo Nacional de Investigaciones Cient√≠ficas y T√©cnicas. Centro Cient√≠fico Tecnol√≥gico Conicet - San Luis. Instituto de Qu√≠mica de San Luis. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Qu√≠mica, Bioqu√≠mica y Farmacia. Instituto de Qu√≠mica de San Luis; Argentin

    Disposable immunosensor for diagnosis of human cytomegalovirus congenital infection

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    Human cytomegalovirus is a herpes virus which can cause pneumonia, retinitis, colitis and encephalopathies in immunosuppress individuals, as transplanted ones, persons infected by HIV, and individuals with immature immune system, like fetuses and newborns. In the last ones microcephaly, small body size, hepatomegaly, blindness, deafness and mental retardation can also be observed. This infection is the most frequent cause of embryogenic and fetal pathology induced by a virus. In the actuality, the diagnosis of HCMV is based on clinical and immunologic data. There are several methods for HCMV detection: the virus isolation in fibroblasts culture, the shell-vial method, the PCR technique, the ELISA test and the western blotting technique. However all of them require a long period of time to perform or are costly which is problematic for diagnosis. Therefore, an immunosensor was developed for human cytomegalovirus glycoprotein B detection based on electrochemical stripping analysis of silver nanoparticles. In this sandwich type immunosensor, the silver deposition solution is added to the electrode surface where the gold nanoparticles attached to antibodies, will catalyze the reduction reaction of silver ions, leading to the formation of silver nanoparticles. The higher concentration of analytes means that more amounts of gold nanoparticles are capture on the sensor surface, producing more silver nanoparticles. The silver nanoparticles are dissolved and measured by anodic stripping voltammetry. This method allows a faster and, we expect, a more sensitive way to detect HCMV.O Citomegalov√≠rus humano √© um v√≠rus que pode causar pneumonia, renite, colite e encefalopatias em indiv√≠duos immunosuprimidos, como sujeitos transplantados, infectadas com o v√≠rus VIH e com sistema imune imaturo, como fetos e rec√©m-nascidos. Nestes √ļltimos, pode-se observar microcefalia, pequeno tamanho corporal, hepatomegalia, cegueira, surdez e atraso mental. Esta infec√ß√£o √© a causa mais frequente de patologias embriog√©nicas e fetais induzidas por um v√≠rus. Na infe√ß√£o aguda por HCMV s√£o gerados anticorpos espec√≠ficos para um grande n√ļmero de prote√≠nas estruturais e n√£o estruturais. Embora o v√≠rus codifique mais de 100 prote√≠nas apenas as glicoprote√≠nas B e H induzem anticorpos capazes de neutralizar o v√≠rus e eliminar c√©lulas infetadas (anticorpos neutralizantes). A glicoprote√≠na B (gB) √© o ant√≠geno dominante existente na c√°psula de HCMV e aproximadamente 100% dos indiv√≠duos infetados com HCMV desenvolvem anticorpos contra esta prote√≠na. Na glicoprote√≠na B foram identificados tr√™s s√≠tios de liga√ß√£o ao anticorpo: dom√≠nio antig√©nico 1 (AD-1),2 (AD-2) e 3 (AD-3). O dom√≠nio AD-2 compreende dois locais, local I (res√≠duos 68-77) e local II (res√≠duos 50-54). Dos tr√™s dom√≠nios, apenas o dom√≠nio AD-1 e o local II do dom√≠nio AD-2 s√£o capazes de induzir anticorpos neutralizantes do v√≠rus durante a infec√ß√£o natural. O dom√≠nio AD-1 representa o local imunodominante da gB. Na verdade, cerca de 100% dos indiv√≠duos infectados que s√£o seropositivos para gB t√™m anticorpos contra o dom√≠nio AD-1 enquanto o dom√≠nio AD-2 √© apenas reconhecido por 47%. AD-1 √© um dom√≠nio estrutural muito complexo, que tem entre 552-635 res√≠duos de gB. A liga√ß√£o de anticorpos requer a presen√ßa da sequ√™ncia completa de AD-1 e a forma√ß√£o de uma liga√ß√£o disulfureto intramolecular entre a ciste√≠na 573 e ciste√≠na 610. Sup√Ķe-se que a liga√ß√£o dos anticorpos a AD-1 n√£o √© afectada por glicosila√ß√£o da gB, uma vez que os anticorpos tamb√©m reconhecem a prote√≠na n√£o glicosilada. Al√©m disto, enquanto outros dom√≠nios da mol√©cula mostram uma varia√ß√£o significativa entre os isolados, o dom√≠nio AD-1 parece ser das regi√Ķes da gB mais altamente conservada. Assim, o dom√≠nio de AD-1 pode ser visto como uma fra√ß√£o promissora a ser usada em testes de diagn√≥stico para verificar a presen√ßa de anticorpos neutralizantes e pode ser utilizado para estabelecer uma rela√ß√£o entre a presen√ßa destes anticorpos e a ocorr√™ncia de sintomas. Atualmente, o diagn√≥stico de citomegalov√≠rus humano (HCMV) √© baseado em informa√ß√Ķes cl√≠nicas e imunol√≥gicas. Existem v√°rios m√©todos para a dete√ß√£o de HCMV. O isolamento do v√≠rus em cultura de fibroblastos √© o m√©todo convencional. Neste, √© feito o isolamento do v√≠rus a partir de um tecido de biopsia ou de um fluido corporal, tal como a urina. Ap√≥s isolamento, o HCMV √© replicado ‚Äúin vitro‚ÄĚ, incubado com fibroblastos a 36 ¬įC durante uma a tr√™s semanas e posteriormente a incuba√ß√£o √© analisada com o objetivo de identificar inclus√Ķes de HCMV em fibroblastos. Este m√©todo, que requer assepsia total, n√£o √© utilizado pois requer um longo per√≠odo de tempo para sua execu√ß√£o, dificultando assim o diagn√≥stico. O m√©todo ‚ÄúShell-vial‚ÄĚ √© muito similar ao anterior, mas o tempo de revela√ß√£o (feito por imunofluoresc√™ncia indireta) diminui para 24, 48 ou 72 horas, devido √† utiliza√ß√£o de anticorpos monoclonais contra diferentes antig√©nios de HCMV e √† utiliza√ß√£o de centrifuga√ß√£o que facilita o processo da penetra√ß√£o do v√≠rus em fibroblastos. Outro m√©todo alternativo para an√°lise de amostras cl√≠nicas √© o PCR (Polimerase Chain Reaction). √Č uma t√©cnica r√°pida (~ 6h) que apresenta uma elevada sensibilidade, baseada na amplifica√ß√£o seletiva de sequ√™ncias espec√≠ficas de √°cidos nucleicos, permitindo a detec√ß√£o de ADN viral. A sensibilidade e especificidade deste m√©todo √© semelhante ao m√©todo de isolamento viral, mas o PCR apresenta algumas vantagens, tais como a velocidade de obten√ß√£o do resultado e a possibilidade de uso de amostras congeladas. Esta t√©cnica √© bastante utilizada apesar do seu custo elevado e dificuldade de realiza√ß√£o. Pode ser utilizada tanto qualitativamente (diagn√≥stico por PCR) como quantitativamente atrav√©s da medi√ß√£o da carga viral, que √© proporcional ao n√≠vel de ADN de HCMV. Outra t√©cnica √© a de ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay), esta apresenta uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 86% na dete√ß√£o de anticorpos no sangue. No entanto, existe a possibilidade de resultados falso-positivos, causados por rea√ß√Ķes cruzadas com algum v√≠rus da fam√≠lia Herpesviridae, fator reumat√≥ide e anticorpos antinucleares. Finalmente, outro m√©todo que pode ser usado para a dete√ß√£o √© o ‚ÄúWestern Blotting‚ÄĚ, que permite a medida da afinidade do anticorpo para o antig√©nio. No entanto, este m√©todo tamb√©m apresenta uma disponibilidade comercial question√°vel, porque igualmente alguns resultados falso-positivos podem ser observados. Como descrito, todas estas t√©cnicas de ensaio envolvem, por vezes, ou equipamentos caros e/ou procedimentos igualmente caros, demorados, complicados e conducentes a falsopositivos. As c√©lulas eletroqu√≠micas s√£o de grande interesse na an√°lise de subst√Ęncias devido √† sua robustez, fabrico f√°cil e econ√≥mico. Uma das t√©cnicas mais utilizadas no fabrico dos el√©trodos que se utilizam nas c√©lulas eletroqu√≠micas √© a serigrafia. Esta t√©cnica permite construir sensores qu√≠micos com uma alta reprodutibilidade e uma infraestrutura m√≠nima. A serigrafia √© um m√©todo de impress√£o direta, tamb√©m denominado de impress√£o por penetra√ß√£o. A deposi√ß√£o de tintas √© realizada por camadas sobre um substrato. A qualidade dos sensores qu√≠micos assim fabricados depende, em grande medida, dos materiais utilizados. Mediante a tecnologia de el√©trodos serigrafados, √© poss√≠vel a miniaturiza√ß√£o dos sensores, que oferecem a vantagem de terem baixo custo, serem vers√°teis, poderem ser fabricados com configura√ß√Ķes de el√©trodo distintas e com diferentes tintas. Devido √†s suas caracter√≠sticas, esta tecnologia ajusta-se bem √† produ√ß√£o em massa de el√©trodos descart√°veis. Para aumentar a seletividade dos el√©trodos, estes s√£o modificados por diferentes m√©todos, por exemplo imobilizando uma subst√Ęncia na sua superf√≠cie. O m√©todo de imobiliza√ß√£o √© muito importante pois influencia o tempo de vida do sensor e a sua sensibilidade. Existem diferentes tipos de imobiliza√ß√£o, designadamente: adsor√ß√£o, aprisionamento, reticula√ß√£o e liga√ß√£o covalente. O dispositivo desenvolvido neste trabalho, atrav√©s da sua simplicidade, baixo custo e tempo de an√°lise relativamente curto, tem como objectivo superar todas as desvantagens referidas anteriormente para as t√©cnicas de diagn√≥stico normalmente utilizadas, pois combina as vantagens dos dispositivos electr√≥dicos com o uso de anticorpos espec√≠ficos para a detec√ß√£o de glicoprote√≠na B. Neste trabalho, desenvolveu-se um immunosensor do tipo sandwich. Neste √© adicionada uma solu√ß√£o de deposi√ß√£o de prata √† superf√≠cie onde, os anticorpos marcados com nanopart√≠culas de ouro ir√£o catalisar a reac√ß√£o de redu√ß√£o dos i√Ķes de prata, levando a forma√ß√£o de nanopart√≠culas de prata. Uma maior concentra√ß√£o de analito significa que uma maior quantidade de nanopart√≠culas de ouro ser√£o capturadas na superf√≠cie do el√©ctrodo que, por sua vez, ir√£o levar √† produ√ß√£o de mais nanopart√≠culas de prata. As nanopart√≠culas de prata s√£o depois dissolvidas e medidas por voltametria de redissolu√ß√£o an√≥dica. Este m√©todo permite uma forma mais r√°pida, econ√≥mica e sens√≠vel para a detec√ß√£o de glicoprote√≠na B

    Development of a Plasmonic Biosensor for Bacterial Recognition for Food Safety

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    La Tesi ha come obiettivo la caratterizzazione delle fasi di sviluppo di un biosensore SPR. Dopo la descrizione teorica dei plasmoni di superficie e della loro eccitazione, la Tesi espone i risultati sperimentali ottenuti misurando dei dispositivi flat d'argento con un banco in configurazione Kretschmann. I dispositivi vengono misurati nella loro condizione metallo/aria, metallo funzionalizzato con PEG tiolato e metallo funzionalizzato PEG sui cui sono stati immobilizzati anticorp
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