Étude fonctionnelle des domaines d'adressage aux Gouttelettes Lipidiques (GL)pour améliorer la purification de protéines recombinantes

Abstract

The production of hydrophobic recombinant proteins, such as transmembrane proteins, is complex due to their association with lipid environments, making their purification costly and difficult, accounting for up to 80% of production costs. This thesis proposes an innovative approach exploiting the properties of plant lipid droplets (GLs) to facilitate the folding and flotation purification of hydrophobic proteins, via anchoring by AtOLE1 oleosin, a major protein in seed GLs. While this method has been validated for soluble proteins, it remains unexplored for transmembrane proteins.GLs are dynamic structures composed of a core of triacylglycerols (TAGs) surrounded by a monolayer of phospholipids, with which proteins from the endoplasmic reticulum (ER) or cytosol are associated. Some of these proteins, involved in GL biogenesis, attach early to their surface. Addressing of proteins to GLs does not depend on a conserved domain, but rather on specific structural motifs. However, as these motifs are also present on proteins not associated with GLs, the study of their specificity remains complex.This thesis explored protein-GL interactions, identifying the factors influencing their specificity and affinity for the GL surface, with the aim of developing biotechnological applications. Proof of concept was achieved using SARS-CoV-2 transmembrane proteins E and M fused to AtOLE1. In Nicotiana benthamiana, which transiently overproduces GLs, microscopic observation showed that E and M proteins specifically target GLs through AtOLE1. A colocalization pipeline was developed to quantify this specificity.The E and M proteins were then expressed in Camelina sativa seeds. Analysis of purified GLs confirmed their surface presence, enhanced by fusion to AtOLE1. This work has shown that GL addressing efficiency varies according to the plant frame used, revealing mechanisms that are still poorly understood.To investigate these mechanisms further, the interaction specificity of various proteins and domains was assessed by microscopy in N. benthamiana. The results were then compared with the structural properties of the proteins, such as charge and hydrophobicity. No direct correlation was observed, suggesting that protein specificity for GLs is more influenced by their function in GL biogenesis or their arrival kinetics. Proteins that localize early to the GL surface show increased specificity.Assessing the affinity of proteins for GLs, defined by their ability to remain associated despite increasingly stringent washings, required the production of a new N. benthamiana chassis stably overaccumulating GLs, with a 22- to 23-fold increase in the number of GLs compared with the wild type. Isolated GLs were subjected to rigorous washing conditions, and associated proteins were detected by biochemical techniques. The results showed that some proteins, in the form of oligomers, remained attached, regardless of the stringency of the treatments.These observations were validated in C. sativa seeds, notably with the production of HsFGF2, a commercial growth factor. The results highlight the key role of arrival kinetics and protein function in GL biogenesis in determining their specificity and affinity. This understanding of the mechanisms of interaction between proteins and GLs opens the way to optimizations for biotechnological applications, notably in the production and purification of hydrophobic proteins.La production de protéines recombinantes hydrophobes, telles que les protéines transmembranaires, est complexe en raison de leur association avec des environnements lipidiques, rendant leur purification coûteuse et difficile, représentant jusqu'à 80 % des coûts de production. Cette thèse propose une approche innovante exploitant les propriétés des gouttelettes lipidiques (GLs) végétales pour faciliter le repliement et la purification par flottaison de protéines hydrophobes, via un ancrage par l'oléosine AtOLE1, protéine majeure des GLs de graines. Si cette méthode a été validée pour des protéines solubles, elle reste inexplorée pour les protéines transmembranaires.Les GLs sont des structures dynamiques composées d'un cœur de triacylglycérols (TAGs) entouré d'une monocouche de phospholipides, à laquelle s'associent des protéines issues du réticulum endoplasmique (RE) ou du cytosol. Certaines de ces protéines, impliquées dans la biogenèse des GLs, s'attachent précocement à leur surface. L'adressage des protéines aux GLs ne dépend pas d'un domaine conservé, mais plutôt de motifs structurels spécifiques. Cependant, ces motifs étant également présents sur des protéines non associées aux GLs, l'étude de leur spécificité reste complexe.Cette thèse a permis d'explorer les interactions protéines-GLs, en identifiant les facteurs influençant leur spécificité et leur affinité pour la surface des GLs, avec pour objectif de développer des applications biotechnologiques. Une preuve de concept a été réalisée en utilisant les protéines transmembranaires E et M du SARS-CoV-2 fusionnées à AtOLE1. Dans Nicotiana benthamiana, surproduisant transitoirement des GLs, l'observation par microscopie a montré que les protéines E et M ciblent spécifiquement les GLs grâce à AtOLE1. Un pipeline de colocalisation a été développé pour quantifier cette spécificité.Ensuite, les protéines E et M ont été exprimées dans des graines de Camelina sativa. L'analyse des GLs purifiées a confirmé leur présence en surface, améliorée par la fusion à AtOLE1. Ce travail a montré que l'efficacité d'adressage aux GLs varie selon le châssis végétal utilisé, révélant des mécanismes encore mal compris.Pour approfondir ces mécanismes, la spécificité d'interaction de diverses protéines et domaines a été évaluée par microscopie dans N. benthamiana. Les résultats ont ensuite été comparés aux propriétés structurales des protéines, comme la charge et l'hydrophobicité. Aucune corrélation directe n'a été observée, suggérant que la spécificité des protéines pour les GLs est davantage influencée par leur fonction dans la biogenèse des GLs ou leur cinétique d'arrivée. Les protéines qui se localisent tôt à la surface des GLs montrent une spécificité accrue.L'évaluation de l'affinité des protéines pour les GLs, définie par leur capacité à rester associées malgré des lavages de plus en plus stringents, a nécessité la production d'un nouveau châssis de N. benthamiana suraccumulant de manière stable des GLs, avec une augmentation de 22 à 23 fois du nombre de GLs par rapport au type sauvage. Les GLs isolées ont été soumises à des conditions de lavage rigoureuses, et les protéines associées ont été détectées par des techniques biochimiques. Les résultats ont montré que certaines protéines, sous forme d'oligomères, restaient attachées, quelle que soit la stringence des traitements.Ces observations ont été validées dans des graines de C. sativa, notamment avec la production de HsFGF2, un facteur de croissance commercial. Les résultats mettent en évidence le rôle clé de la cinétique d'arrivée et de la fonction des protéines dans la biogenèse des GLs pour déterminer leur spécificité et leur affinité. Cette compréhension des mécanismes d'interaction entre protéines et GLs ouvre la voie à des optimisations pour des applications biotechnologiques, notamment dans la production et la purification de protéines hydrophobes