Investigation of the adipogenic differentiation potential of ASCs on peptide-functionalized fiber constructs

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Vitalität, Integrität und Differenzierung von adipogenen Stammzellen (ASCs) auf biofunktionalisierten Faserkonstrukten unter Einsatz diverser biochemischer Methoden untersucht. Dabei stellen die Faserkonstrukte ein Gerüst (eng. scaffold) dar, worauf sich die Zellen anheften und vorzugsweise proliferieren können, um damit potenzielle lokale Schäden eines Organismus zu beheben. Dafür wurde das Fasergerüst mit drei verschiedenen Laminin-Peptidsequenzen funktionalisiert zur Steigerung der Zelladhäsion via Integrine und die Zellen schließlich in vitro zur Differenzierung angeregt. Nach qualitativer Auswertung der biofunktionalisierten Scaffolds ohne Zellen, wie auch Scaffolds mit Zellen ohne induzierten Differenzierungsreiz, schien die RGDS-Sequenz sowohl bezüglich der Makrostruktur der Fasern als auch der produzierten EZM-Fläche auf dem Gerüst die besten Resultate erzielt zu haben. Darüber hinaus wurden die höchsten Werte für den Zellmetabolismus anhand des WST-1 Assays und die höchsten relativen DNA-Mengen für RGDS festgestellt. Nach Zugabe der Differenzierungsinduktoren zur Untersuchung der Adhäsion für ASCs konnte qualitativ kein Unterschied anhand der Fluoreszenzmikroskopie zwischen den Peptidsequenzen oder Medienzusammensetzungen erkannt und interpretiert werden. Hingegen konnte mit Hilfe der qPCR von adipogenen Markergenen eine höhere Expressionsrate für PPARγ und PLIN1 auf RGDS-IKVAV- und RGDS-YISGR-Konstrukten im Vergleich zu RGDS-Konstrukten bestimmt werden. Diese Tatsache bekräftigt das Potential von IKVAV bzw. YIGSR als mögliche Adhäsions-Ankerpunkten für (Prä-)Adipozyten für ausgewählte Einsatzgebiete in der regenerativen Medizin. Basierend auf den vorliegenden Daten weist bisher RGD(S) dennoch das höchste Potential als nahezu universelle Zell-Adhäsionssequenz auf und bekräftigt erneut die umfassende Anzahl an Publikationen und das hohe Forschungsinteresse diese Sequenz zu integrieren, die weit über das Elektrospinning hinausgehen.In the present study, the vitality, integrity and differentiation of adipogenic stem cells (ASCs) on biofunctionalized fibrous constructs were investigated using various biochemical methods. The fiber constructs represent a scaffold on which the cells can attach and preferably proliferate in order to repair potential local damage to an organism. For this purpose, the fibre scaffold was functionalized with three different laminin peptide sequences to increase cell adhesion via integrins and the cells were finally stimulated to differentiate in vitro. After qualitative evaluation of the biofunctionalized scaffolds without cells, as well as scaffolds with cells without induced differentiation stimulus, the RGDS sequence appeared to have achieved the best results in terms of both the macrostructure of the fibers and the area of ECM produced on the scaffold. In addition, the highest values for cell metabolism using the WST-1 assay and the highest relative DNA amounts were found for RGDS. After addition of the differentiation inducers to study adhesion for ASCs, no qualitative difference could be detected and interpreted by fluorescence microscopy between the peptide sequences or media compositions. In contrast, qPCR of adipogenic marker genes revealed a higher expression level for PPAR “γ” and PLIN1 on RGDS-IKVAV and RGDS-YISGR constructs compared to RGDS constructs. This fact confirms the potential of IKVAV or YIGSR as possible adhesion anchor points for (pre-)adipocytes for selected applications in regenerative medicine. Based on the available data, RGD(S) still shows the highest potential as a nearly universal cell adhesion sequence and reaffirms the extensive number of publications and the high research interest in integrating this sequence, which goes far beyond electrospinning