Development of anti-Fn14 antibody variants with intrinsic, FcγR-independent agonism

Abstract

Fn14 ist als Mitglied der TNFRSF im Kontext proinflammatorischer Prozesse und demzufolge auch an Tumorentstehung und -wachstum beteiligt. Aufgrund der Hochregulation von Fn14 und seinem bislang einzig bekannten Liganden „TWEAK“ in Tumorzellen und ihrer Umgebung gilt dieses System für die immunonkologische Forschung als vielversprechend. Durch Fn14 können unter anderem der alternative und klassische NFκB-Signalweg aktiviert werden. Die Signalkaskade des klassischen NFκB-Signalwegs beruht auf der E3-Ligasefunktion rekrutierter cIAP1/2-Moleküle und erfordert daher eine Clusterbildung von zwei oder mehr TWEAK3-Fn143-TRAF23-cIAP1/2-Komplexen. Diese Aggregation kann im Vergleich zu löslichem TWEAK effektiv lediglich durch membrangebundenes TWEAK hervorgerufen werden. Im Rahmen der Entwicklung TWEAK/Fn14-basierter Wirkstoffe geht die Tendenz aktuell hin zur Herstellung TWEAK-unabhängiger, rekombinanter anti-Fn14-Antikörper mit intrinsischer Aktivität, Fn14-assoziierte Signalwege zu stimulieren. Ziel dieser Arbeit war es anti-Fn14-Antikörper mit einem effektiven, intrinsischen, FcγR-unabhängigen Agonismus zu produzieren. Die bereits etablierten, bisher lediglich schwach agonistisch wirksamen anti-Fn14-Antikörper 18D1, PDL192 und P4A8 vom Typ IgG1 wurden dazu im Vorfeld dieser Arbeit institutsintern durch gentechnische Fusion mit scFv jeweils als monospezifische bi-, tetra- und hexavalente Antikörperkonstrukte konzipiert. Durch die zusätzlichen Antigenbindungsstellen wurden die oligovalenten anti-Fn14-Antikörpervarianten ohne Applikation zusätzlicher Reagenzien oligomerisiert. Um potenzielle Fcγ-Rezeptor-vermittelte Interaktionen zu minimieren, wurde außerdem in jedes Antikörperkonstrukt die Punktmutation N297A eingefügt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die entstandenen neun Antikörpervarianten mittels transienter Transfektion in HEK293 Zellen produziert und deren Wirkung in verschiedenen molekularbiologischen Assays untersucht. Bei allen drei bivalenten Varianten konnte höchstens ein schwacher agonistischer Effekt an Fn14 verzeichnet werden. Alle oligovalenten anti-Fn14-Antikörpervarianten hingegen induzierten in HT1080 Zellen nachweislich den alternativen NFκB-Signalweg und verstärkten außerdem den TNF-TNFR1-vermittelten Zelltod in HeLa-RIPK3-FADD-KO Zellen. Eine effektive Aktivierung des klassischen NFκB-Signalwegs gelang jedoch lediglich durch die oligovalenten Varianten von 18D1 und PDL192. Durch diese wurde eine Wirkstärke vergleichbar der von membrangebundenem TWEAK erreicht, weshalb von einem FcγR-unabhängigen, intrinsischen Agonismus dieser anti-Fn14-Antikörpervarianten ausgegangen werden kann. Hinsichtlich Expressionsniveau und Stabilität unterschieden sich die produzierten anti-Fn14-Antikörper deutlich, weswegen vor allem die tetravalenten Varianten von 18D1 und PDL192 für weitere Untersuchungen und eine potenzielle klinische Anwendung infrage kommen.As a member of the TNFRSF family Fn14 is involved in proinflammatory processes, and consequently, also in tumor formation and growth. Due to the upregulation of Fn14 and its only known ligand "TWEAK" in tumor cells and their environment, this system is considered promising in immuno-oncology research. Fn14 can activate both the alternative and classical NFκB signaling pathway. The signaling cascade of the classical NFκB pathway relies on the E3 ligase function of recruited cIAP1/2 molecules and, therefore, requires the formation of clusters of two or more TWEAK3-Fn143-TRAF23-cIAP1/2 complexes. This aggregation can be effectively induced only by membrane-bound TWEAK in comparison to soluble TWEAK. In the development of TWEAK/Fn14-based therapeutics, the current trend is moving towards the production of TWEAK-independent recombinant anti-Fn14 antibodies with intrinsic activity to stimulate Fn14-associated signaling pathways. The goal of this work was to produce anti-Fn14 antibodies with efficient, intrinsic, FcγR-independent agonism. The previously established, weakly agonistic anti-Fn14 antibodies, 18D1, PDL192, and P4A8 of the IgG1 type, were designed as monospecific bi-, tetra-, and hexavalent antibodies by genetically fusing them with scFv in advance of this work. The additional antigen-binding sites allowed the oligovalent anti-Fn14 antibody constructs to be oligomerized without the application of additional reagents. To minimize potential Fcγ receptor-mediated interactions, the N297A point mutation was also introduced into each antibody construct. In the context of this work, the resulting nine antibody variants were produced through transient transfection in HEK293 cells, and their effects were examined in various molecular biology assays. In all three bivalent variants, at most, a weak agonistic effect on Fn14 was observed. However, all oligovalent anti-Fn14 antibody variants demonstrably induced the alternative NFκB signaling pathway in HT1080 cells and also enhanced TNF-TNFR1-mediated cell death in HeLa-RIPK3-FADD-KO cells. Efficient activation of the classical NFκB signaling pathway was achieved only by the oligovalent variants of 18D1 and PDL192. These variants reached a potency comparable to that of membrane-bound TWEAK, suggesting an FcγR-independent, intrinsic agonism of these anti-Fn14 antibody variants. The produced anti-Fn14 antibodies differed significantly in terms of expression levels and stability, making the tetravalent variants of 18D1 and PDL192 particularly suitable for further investigations and potential clinical applications