Development of peptide-rich extracts from yeast by-products for nutraceutical application

Abstract

Ao longo dos anos, a biologia sintética cresceu com o uso de leveduras geneticamente modificadas para produção de ingredientes sustentáveis. À semelhança da indústria cervejeira, é gerada uma quantidade considerável de levedura excendentária, que possui um valor nutricional notável como fonte proteica alternativa. Considerando o aumento da população global e o consequente aumento da procura de proteína, a presente tese visa valorizar os péptidos de leveduras geneticamente modificadas, produzindo extratos ricos em péptidos quer da sua extração direta, quer a partir dos resíduos de extração de β-glucanas e mananas (componentes da parede celular das leveduras) numa abordagem de economia circular para a indústria nutracêutica. Relativamente à extração de péptidos diretamente da levedura, foram usadas metodologias escaláveis e sustentáveis como a homogeneização a alta pressão, sonicação, hidrólise enzimática e autólise. Os extratos de leveduras geneticamente modificadas mostraram excelentes perfis nutricionais, semelhantes aos das estirpes não-modificadas. A autólise destacou-se como uma abordagem promissora, embora outras métricas de sustentabilidade ainda precisem ser estudadas para a implementação industrial desse processo. Para aprofundar as propriedades biológicas dos péptidos do autolisado, testaram-se dois métodos de purificação: ultrafiltração e cromatografia por exclusão de tamanho. As frações resultantes exibiram diversos teores de proteína, distribuições de pesos moleculares e sequências de péptidos, apresentando uma elevada capacidade de inibição da enzima conversora da angiotensina, atividade antioxidante, e uma maior inibição da 3-hidroxi-3- metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase do que o autolisado original, sugerindo a importância da purificação para produzir suplementos alimentares com efeito anticolesterolémico. Até onde sabemos, a inibição da HMG-CoA redutase associada a péptidos de levedura é aqui reportada pela primeira vez. Considerando o custo-benefício, a ultrafiltração parece ser o método mais adequado para a produção de extratos ricos em péptidos destinados ao mercado nutracêutico. A ultrafiltração foi também aplicada aos sobrenadantes dos resíduos de extração de β-glucanas e mananas da levedura, maximizando a abordagem de economia circular para a produção de extratos ricos em péptidos. Estes extratos apresentaram um desempenho nutricional e bioativo comparável aos obtidos diretamente da levedura, tornando-os excelentes ingredientes para o setor nutracêutico. Considerando a composição dos aminoácidos nos extratos peptídicos, identificou-se potencial para formar complexos Fe-péptidos com a fração Gpep > 1 kDa (fração peptídica com peso molecular maior que 1 kDa proveniente dos resíduos de extração de β-glucanas) em condições anóxicas. Do desenho fatorial aplicado mostrou-se que as condições ótimas de reação ocorrem a pH 6,0 durante 30 min, sendo a complexação confirmada por análise química e estrutural. Finalmente, os complexos foram submetidos à simulação in vitro da digestão gastrointestinal humana, e sua absorção foi analisada numa linha celular de adenocarcinoma do cólon humano, avaliando a absorção de Fe. Os resultados revelaram que os complexos se comportaram similarmente aos sais de Fe e bisglicinato de Fe comercial, indicando o seu potencial promissor para a suplementação dietética de Fe. Além disso, os péptidos dos complexos demonstraram atividade antioxidante, sugerindo a proteção do Fe contra a oxidação em diferentes ambientes gastrointestinais. Em suma, esta tese promove a valorização de levedura excedentária geneticamente modificada, explorando tanto a biomassa diretamente, como os resíduos de extração de outros dos seus componentes. Isso resulta na produção de diversos extratos peptídicos que podem servir como fonte alternativa de alimento e/ou suplementos para controlo da anemia, bem como para outras áreas, tais como a cosmética, ou ingredientes na produção de microrganismos por fermentação.Over the years, synthetic biology has grown through the use of engineered yeasts for sustainable ingredients production. Similar to the brewing industry, a considerable amount of spent yeast has been generated, which holds a significant nutritional value as an alternative protein source. Considering the increase of global population and the consequent rise in protein demand, this thesis aims to valorise peptides from engineered yeast by producing peptide-rich extracts. These extracts are derived either directly from yeast or from the waste residues of β-glucan and mannan extractions (yeast cell wall components), following a circular economy approach to be applied to nutraceutical industry. For the direct extraction of peptides from yeast, scalable and sustainable methodologies such as high-pressure homogenization, sonication, enzymatic hydrolysis, and autolysis were employed. Engineered yeast extracts exhibited excellent nutritional profiles, similar to wild-type. Autolysis emerged as a promising approach, although additional sustainability metrics need to be studied for the industrial implementation of this process. To further explore the biological properties of autolysate peptides, two purification methods were applied: ultrafiltration and size exclusion chromatography. The resulting fractions displayed diverse protein content, molecular weight distributions and peptide sequences, demonstrating high angiotensin-converting enzyme inhibition capacity, antioxidant activity, and greater inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase than the original autolysate. This suggests the importance of purification in producing a cholesterol-reducing dietary supplement with these properties. To best of our knowledge, this thesis reports the first demonstration of yeast peptide associated HMG-CoA reductase inhibition. Considering cost-effectiveness, ultrafiltration appears to be the most suitable method for producing peptide-rich extracts for the nutraceutical market. Ultrafiltration was also applied to the supernatants of β-glucan and mannan extraction residues, maximizing the circular economy approach for peptide-rich extract production. These extracts exhibited similar nutritional and bioactive performance to those directly obtained from yeast, making them excellent ingredients for the nutraceutical sector. Considering the amino acid composition within the peptide extracts, the production of Fe-peptide complexes was studied and the complexes produced with Gpep > 1 kDa fraction (peptide fraction with molecular weight higher than 1 kDa derived from β-glucan extraction residues) under anoxic conditions were identified as the most adequate. From the applied factorial design, the reaction conditions were optimized (pH 6.0 for 30 min), and complexation was confirmed through chemical and structural analysis. Finally, the complexes were subjected to an in vitro simulation of human gastrointestinal tract, and Fe absorption was analysed using a human colon adenocarcinoma cell line. The results revealed that the complexes behaved similarly to Fe salts and commercial Fe bisglycinate, indicating their promising potential for dietary Fe supplementation. Additionally, the peptides from the complexes demonstrated antioxidant activity, suggesting protection of Fe against oxidation in different gastrointestinal environments. In summary, this thesis promotes the valorisation of spent engineered yeast, exploring the production of peptides extracts directly from biomass or from residues arising from other components extraction. Indeed, this production can represent an alternative food source and/or dietary supplements for managing anaemia, as well as providing peptide extracts for several other areas such as cosmetics or ingredients for microorganisms’ fermentation