Caprine mastitis for Staphylococcus warneri: a multifactorial approach in the study of the infection

Abstract

A mastite, inflamação da glândula mamária, emerge como um desafio na pecuária leiteira, impactando negativamente a produção e a qualidade do leite. Este trabalho aborda essa questão complexa em três capítulos em formato de artigo, cada um com foco específico e contribuições distintas para o entendimento da dinâmica da infecção na mastite caprina. Para isso, trabalhamos com 112 amostras de leite oriundas de sete cabras primíparas da raça Parda Alpina, das quais seis foram submetidas à infecção experimental intramamária com uma dose de 1,2 × 108 UFC/ml do isolado de S. warneri e uma serviu como controle negativo. O primeiro capítulo investigou o impacto da infecção experimental por Staphylococcus warneri nas alterações dos elementos químicos do leite bem como na presença de patógenos nos caprinos infectados. Utilizou-se PCR em tempo real para detecção de patógenos e utilizamos a Contagem de Células Somáticas (CCS) e Contagem Bacteriana Total (CBT) como parâmetros de infecção. Elementos químicos foram analisados via Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS) acoplada ao MEV. Os resultados revelaram diferenças entre o lado do úbere infectado e o não infectado durante os dias de desenvolvimento da infecção tanto para os elementos quanto para a presença de patógenos. O cloro apresentou maior concentração no lado infectado do úbere no segundo dia, enquanto cálcio e ferro exibiram variações ao longo dos dias de infecção. Correlações específicas foram estabelecidas entre diferentes patógenos e elementos químicos. A infecção experimental por S. warneri impactou a microbiota, com uma maior variedade de patógenos nos animais infectados bem como no úbere infectado, além de variações entre os elementos químicos entre o lado do úbere infectado e não infectado, sendo um trabalho pioneiro nessa abordagem. No segundo capítulo, abordamos a atividade da enzima N-acetil-β-glucosaminidase (NAGase) como uma ferramenta diagnóstica para mastite caprina. Amostras oriundas da infecção experimental e 49 amostras de animais naturalmente infectados foram utilizados neste estudo. Aplicamos o método fluorométrico para quantificar a enzima NAGase além de citometria de fluxo para a CCS e CBT que foram utilizados como parâmetro da evolução da infecção. A análise revelou aumento da NAGase em cabras infectadas com S. warneri, destacando-se como uma ferramenta útil para o monitoramento da doença. Além disso, ao combinarmos o NAGase com a CCS, obtivemos um melhor resultado na classificação da mastite em amostras de campo. Essa abordagem multidimensional contribui para aprimorar estratégias de diagnóstico e tratamento da mastite. O terceiro capítulo investigou a liberação de Neutrophil Extracellular Traps (NETs) por neutrófilos caprinos estimulados in vitro por Staphylococcus aureus e S. warneri. Neste capítulo, sangue de cabras adultas saudáveis foram coletados e utilizado no isolamento de neutrófilos polimorfonucleares caprino (PMNs). Avaliamos a formação NETs caprinos induzindo as células sob estímulos de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), citocalasina para inibição da fagocitose, S. warneri e S. aureus. Esses dois patógenos comuns da mastite caprina desencadearam a formação de NETs, sugerindo um mecanismo de defesa celular contra a mastite, sendo um achado inédito na literatura. Essa resposta dos neutrófilos destaca nuances distintas na defesa imunológica, oferecendo uma perspectiva valiosa para futuras estratégias terapêuticas. Em conclusão, esses achados contribuem significativamente para avanços na compreensão e no manejo sanitário caprino, destacando a necessidade contínua de abordagens multidisciplinares para enfrentar esse desafio complexo na pecuária leiteira. Palavras-chave: Ruminantes. Mastite. Leite. Diagnóstico. Resposta imune.Mastitis, inflammation of the mammary gland, emerges as a challenge in dairy farming, negatively affecting milk production and quality. This work addresses this complex issue in three article-style chapters, each with a specific focus and distinct contributions to understanding the dynamics of infection in goat mastitis. To achieve this, we worked with 112 milk samples from seven primiparous goats of the Parda Alpina breed, of which six were subjected to experimental intramammary infection with a dose of 1.2 × 108 CFU/ml of the Staphylococcus warneri isolate and one served as negative control. The first chapter investigated the impact of experimental infection by S. warneri on changes in chemical elements in milk as well as the presence of pathogens in infected goats. Real-time PCR was used to detect pathogens and we used Somatic Cell Count (SCC) and Total Bacterial Count (CBT) as infection parameters. Chemical elements were analyzed via Energy Dispersive Spectroscopy (EDS) coupled to SEM. The results revealed differences between the infected and non-infected side of the udder during the days of infection development for both the elements and the presence of pathogens. Chlorine showed a higher concentration on the infected side of the udder on the second day, while calcium and iron showed variations over the days of infection. Specific correlations have been established between different pathogens and chemical elements. Experimental infection by S. warneri impacted the microbiota, with a greater variety of pathogens in infected animals as well as in the infected udder, in addition to variations between chemical elements between the infected and non-infected side of the udder, being a pioneering work in this approach. In the second chapter, we address the activity of the enzyme N-acetyl-β-glucosaminidase (NAGase) as a diagnostic tool for goat mastitis. Samples from experimental infection and 49 samples from naturally infected animals were used in this study. We applied the fluorometric method to quantify the NAGase enzyme in addition to flow cytometry for CCS and CBT, which were used as a parameter for the evolution of the infection. The analysis revealed an increase in NAGase in goats infected with S. warneri, highlighting it as a useful tool for monitoring the disease. Furthermore, by combining NAGase with CCS, we obtained a better result in classifying mastitis in field samples. This multidimensional approach contributes to improving mastitis diagnosis and treatment strategies. The third chapter investigated the release of Neutrophil Extracellular Traps (NETs) by goat neutrophils stimulated in vitro by Staphylococcus aureus and S. warneri. In this chapter, blood from healthy adult goats was collected and used in the isolation of goat polymorphonuclear neutrophils (PMNs). We evaluated the formation of goat NETs by inducing cells under stimuli of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), cytochalasin for inhibition of phagocytosis, S. warneri and S. aureus. These two common pathogens of goat mastitis triggered the formation of NETs, suggesting a cellular defense mechanism against mastitis, an unprecedented finding in the literature. This neutrophil response highlights distinct nuances in immune defense, offering a valuable perspective for future therapeutic strategies. In conclusion, these findings contribute significantly to advances in goat health understanding and management, highlighting the continued need for multidisciplinary approaches to address this complex challenge in dairy farming. Keywords: Ruminants. Mastitis. Milk. Diagnosis. Immune Response.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerai