Evaluation of the immunogenicity conferred on BALB/c mice against Leishmania chagasi after immunization with recombinant LPG3 protein associated with the eugenol derivative MR1

Abstract

As leishmanioses são ocasionadas por protozoários do gênero Leishmania em decorrência da picada do inseto flebotomíneos infectado pelo parasito. Sua incidência global é de 700 mil a 1,2 milhão de casos de leishmaniose cutânea (LC) e 200 a 400 mil casos de leishmaniose visceral (LV). Dessa forma, são necessários esforços em busca de uma vacina que proporcione o controle da doença. O presente trabalho, foi dividido em dois capítulos, sendo o primeiro referente à avaliação do perfil de resposta conferido a camundongos Balb/c imunizados com proteína recombinante lipofosfoglicano-3, presente em Leishmania chagasi, associada com um derivado do eugenol, o bis-eugenol (MR1). Para avaliação da imunogenicidade da vacina, foram avaliadas a produção de citocinas (IFN-γ, TNF, IL-6, IL-17, IL-10, IL-2 e IL-4) e de óxido nítrico (NO). Também foi avaliada a produção de anticorpos IgG1 e IgG2a após imunização com rLPG3 associada ao MR1. Os camundongos Balb/c foram vacinados pela via subcutânea, o esquema vacinal consistiu em três doses em intervalos de 15 dias entre elas. Nossos resultados mostraram que o grupo imunizado com rLPG3 combinado com MR1 elevou a produção das citocinas IFN-γ, TNF, IL-6, IL-17, IL-2 e IL-10, quando os esplenócitos foram cultivados na presença de rLPG3 em comparação com as culturas de esplenócitos não estimulados pelos animais imunizados com a formulação vacinal completa. Foi observado aumento na produção dos anticorpos IgG1 e IgG2a séricas dos grupos imunizados com a rLPG3 combinada com MR1 em relação ao grupo controle PBS, além de menor razão de IgG1/IgG2a em comparação com o mesmo grupo controle. Os resultados apresentados indicam um perfil imunológico Th1/Th17, sendo um perfil desejado para o controle da doença. O segundo capítulo desse projeto se refere a uma revisão sistemática onde avaliamos evidências pré- clínicas sobre a eficácia de proteínas recombinantes em formulações vacinais para tratamento de LV em modelo murino. O protocolo de pesquisa foi baseado nas diretrizes do PRISMA. Os registros de pesquisa foram identificados nas plataformas Medline, Scopus e Web of Science. Para nossas análises, foram analisados o estágio na qual a proteína é expressa no parasito, protocolos de imunização e tratamento, acompanhamento pós-infecção, perfil de resposta imune e resultados parasitológicos. Nossa pesquisa selecionou, pelos critérios de exclusão, 33 artigos. Os resultados encontrados nos 33 estudos indicaram que o uso de proteínas recombinantes na formulação de vacinas induziu aumento em perfil de resposta Th1 por meio do aumento de citocinas inflamatórias (IFN-γ, IL-12, IL-2 e TNF) associado ao aumento da razão IgG2a/IgG1. Foi constatada redução na carga parasitária na maior parte dos trabalhos: apenas um estudo não indicou se houve ou não redução na carga parasitária após a imunização. Em suma, os resultados apresentados pela vacinação com proteínas recombinantes podem abrir portas para potenciais candidatos a serem testados em outros modelos animais pré-clínicos a fim de se encontrar um potencial candidato profilático para LV. Palavras-chave: Leishmania chagasi. Lipofosfoglicano-3. Leishmaniose visceral. Vacina. Proteína recombinanteLeishmaniasis is caused by protozoa of the genus Leishmania as a result of the bite of sandflies infected by the parasite. Its global incidence is 700 thousand to 1.2 million cases of cutaneous leishmaniasis (CL) and 200 to 400 thousand cases of visceral leishmaniasis (VL). Therefore, efforts are needed to find a vaccine that provides control of the disease. The present work was divided into two chapters, the first referring to the evaluation of the response profile conferred on Balb/c mice immunized with recombinant protein lipophosphoglycan-3, present in Leishmania chagasi, associated with a eugenol derivative, bis-eugenol. (MR1). To evaluate the immunogenicity of the vaccine, the production of cytokines (IFN-γ, TNF, IL-6, IL-17, IL-10, IL-2 and IL-4) and nitric oxide (NO) were evaluated. The production of IgG1 and IgG2a antibodies after immunization with rLPG3 associated with MR1 was also evaluated. Balb/c mice were vaccinated subcutaneously, the vaccination schedule consisted of three doses with 15-day intervals between them. Our results showed that the group immunized with rLPG3 combined with MR1 increased the production of the cytokines IFN-γ, TNF, IL-6, IL-17, IL-2 and IL-10, when splenocytes were cultured in the presence of rLPG3 in comparison with unstimulated splenocyte cultures from animals immunized with the complete vaccine formulation. An increase in the production of serum IgG1 and IgG2a antibodies was observed in the groups immunized with rLPG3 combined with MR1 in relation to the PBS control group, in addition to a lower IgG1/IgG2a ratio compared to the same control group. The results presented indicate a Th1/Th17 immunological profile, which is a desired profile for disease control. The second chapter of this project refers to a systematic review where we evaluate pre- clinical evidence on the efficacy of recombinant proteins in vaccine formulations for the treatment of VL in a murine model. The research protocol was based on the PRISMA guidelines. Research records were identified on the Medline, Scopus and Web of Science platforms. For our analyses, we analyzed the stage at which the protein is expressed in the parasite, immunization and treatment protocols, post-infection monitoring, immune response profile and parasitological results. Our research selected, based on the exclusion criteria, 33 articles. The results found in the 33 studies indicated that the use of recombinant proteins in vaccine formulation induced an increase in the Th1 response profile through an increase in inflammatory cytokines (IFN-γ, IL-12, IL-2 and TNF) associated with an increase in IgG2a/IgG1 ratio. A reduction in parasite load was found in most of the studies: only 1 of them did not indicate whether there was a reduction in parasite load after immunization. In short, the results presented by vaccination with recombinant proteins can open doors for potential candidates to be tested in other preclinical animal models in order to find a potential prophylactic candidate for VL. Keywords: Leishmania chagasi. Lipophosphoglycan-3. Visceral leishmaniasis. Vaccine. Recombinant protei