Smart hybrid compounds to target the respiratory electron transport chain of mycobacterium tuberculosis

Abstract

Tese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A tuberculose, apesar de ser uma doença evitável e curável, mantém-se como uma epidemia global. Estima-se que em 2021, a tuberculose tenha sido a décima terceira maior causa de morte global e a segunda maior causa de morte induzida por um agente infecioso e que determinou, aproximadamente, 1,6 milhões de mortes. No mesmo ano, 10,6 milhões de pessoas terão contraído a doença e estimativas recentes indicam que um quarto da população mundial está infetado com o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o seu agente etiológico. O Mtb é um agente patogénico humano obrigatório, com várias características distintivas que o tornam um agente infecioso de excelência. Esta bactéria aproveita a resposta imunitária do hospedeiro para aumentar o grau de transmissão. Para além disso, possuí um arsenal metabólico extenso capaz de metabolizar os xenobióticos e uma parede celular única, com um elevado número de bombas de efluxo, que lhe confere uma alta impermeabilidade, permitindo-lhe adaptar-se às múltiplas pressões ambientais criadas pelo hospedeiro, adquirindo assim uma elevada resistência natural a fármacos. Por fim, esta micobactéria possui uma capacidade única de permanecer no hospedeiro num estado latente, caracterizado por uma fisiologia e metabolismo distinto, crescimento reduzido, tolerância a fármacos aumentada, e uma capacidade de não se deixar detetar pelo sistema imunitário. Um regime terapêutico anti-tubercular tem como objetivo diminuir a severidade da doença, evitar reincidências e o desenvolvimento de resistência, e para tal, necessita eliminar todas as populações de bacilos do hospedeiro. Devido às características próprias das bactérias latentes, os regimes terapêuticos anti-tuberculares têm durações bastante prolongadas e características de polimedicação, apresentando por isso efeitos adversos cumulativos. Consequentemente, os regimes terapêuticos anti-tuberculares têm baixa adesão e tolerância por parte dos doentes, podendo resultar na emergência de tuberculose resistente a fármacos, que está associada a uma maior letalidade, e a um sucesso terapêutico inferior. Desta forma, o desenvolvimento de um regime terapêutico curto, potente, e eficiente em todas as formas de infeção é uma prioridade no controlo da tuberculose. Para tal, é essencial desenvolver novos fármacos que sejam eficientes, seguros, e bem-tolerados, e que preferencialmente atuem por novos mecanismos de ação, de forma a evitar a emergência de resistência. Esta premência não foi considerada nos últimos anos, sendo que apenas três fármacos anti-tuberculares (bedaquilina, delamanida e pretomanida) foram aprovados nos últimos quarenta anos, todos com efeitos secundários que comprometem a sua utilização prolongada. Assim, é crucial investir na descoberta e desenvolvimento de novos fármacos ativos contra a tuberculose latente e resistente, preferencialmente com novos mecanismos de ação e alvos diferentes. A cadeia de transporte de eletrões do Mtb surgiu recentemente como um alvo promissor para novos fármacos anti-tuberculares. Atualmente, cerca de 30% dos novos fármacos em ensaios clínicos têm como alvo um elemento da cadeia de transporte de eletrões, e cerca de 65% dos regimes farmacológicos em ensaios clínicos de fase III incluem um fármaco que inibe a cadeia de transporte de eletrões. Como ambas as formas bacterianas, latentes e replicantes, requerem um fornecimento contínuo de ATP, o metabolismo energético é um alvo apelativo, já que a sua inibição e consequente disrupção do fornecimento de ATP permite eliminar eficientemente as populações replicantes e latentes, e consequentemente, diminuir a duração dos regimes terapêuticos e a emergência de resistência. Este projeto inclui a síntese e caracterização de uma pequena biblioteca de ferramentas farmacológicas híbridas, capazes de inibir o citocromo bc1-aa3, a oxidase principal do Mtb, e, em simultâneo, o citocromo bd, uma oxidase alternativa que o bacilo utiliza em situações de hipoxia. Deste modo, pretende-se que estes compostos consigam inibir eficientemente a produção de ATP, e eliminar ambas as populações bacterianas replicantes e latentes. Os compostos híbridos têm uma estrutura comum, com um esqueleto de pirroloquinolona, provavelmente capaz de inibir o citocromo bc1-aa3 uma vez que é inibidor do citocromo bc1 do Plasmodium falciparum, uma proteína com alta homologia com o citocromo bc1-aa3 do Mtb; e um esqueleto de nitrofurano, que podendo ser reduzido in vivo pelas nitroreductases do Mtb, liberta óxido nítrico capaz de inibir o citocromo bd. As duas estruturas serão ligadas por um braço de ligação, que será a porção variável da biblioteca de compostos. Os compostos foram sintetizados por uma estratégia de síntese divergente, iniciada com a síntese do esqueleto da pirroloquinolona, com rendimentos elevados. De seguida, vários braços de ligação foram acoplados, com rendimentos moderados. Quando necessário, foi efetuada uma redução das funções químicas do braço de ligação (grupos nitro e nitrilo), por forma a garantir a presença de um grupo amina livre. Por fim, o esqueleto de nitrofurano foi acoplado, com rendimentos baixos, através de dois tipos de ligação: ligações amida (7a – 7d) e ligações imina (8a – 8c). Todos os compostos foram obtidos puros, exceto o composto 7d, cujas tentativas de purificação não foram bem sucedidas. Na síntese do composto 7c, isolou-se um produto de degradação – uma nitrofuranilamida (composto 7c’) – que foi caracterizado. Como o composto 7c foi somente obtido puro posteriormente, por restrições temporais não foram efetuados os ensaios subsequentes para este composto. A solubilidade aquosa dos compostos foi determinada por HPLC para os compostos 7c’ e 8c. Este ensaio não foi efetuado com os restantes compostos ((7a), (7b), (8a) e (8b)) por se ter verificado que tinham sofrido degradação extensiva. Ambos os compostos 7c’ e 8c demonstraram ter boa solubilidade aquosa, que juntamente com as propriedades físico-químicas previstas indicam que estes compostos, provavelmente, terão uma boa biodisponibilidade oral. Também se avaliou a estabilidade química (em tampão PBS), em plasma, e metabólica (em microssomas de ratinho), por HPLC para os compostos 7c’ e 8c. Ambos demonstraram ter um bom perfil farmacocinético, sendo que o composto 7c’ demonstrou ser mais estável que o composto 8c nos três meios testados. Comparando a estabilidade do composto 7c’ com outros compostos híbridos, nenhuma correlação foi identificada entre a ausência do esqueleto da pirroloquinolona e uma melhoria no perfil farmacocinético. A atividade anti-micobacteriana dos compostos 7c’, 8c, e de alguns intermediários foi testada contra duas estirpes de M. tuberculosis (uma estirpe nativa, H37Rv, e uma estirpe mutante, cydKO). Os resultados estão de acordo com o mecanismo de ação proposto em que os compostos híbridos têm como alvos ambos os citocromos, bc1-aa3 e bd, e a necessidade do grupo nitro ser substituinte num ciclo heteroaromático. O composto 8c apresentou atividade anti-micobacteriana com valores de MIC na gama micromolar, demonstrando que estes compostos híbridos são agentes anti-tuberculares promissores. O composto 7c’ foi o composto mais ativo, apresentando atividade anti-micobacteriana com valores de MIC na gama sub-micromolar, podendo indicar um mecanismo de ação distinto, uma vez que esta molécula não contém a subunidade pirroloquinolona. A toxicidade dos compostos 7c’ e 8c, tal como do percursor 6c, foi testada contra a linha celular HEK293. Os compostos 7c’ e 6c não apresentaram citotoxicidade, enquanto o composto 8c apresentou citotoxicidade superior, apesar de demonstrar alguma seletividade para as células bacterianas. Deste modo, os próximos passos deste projeto incluem a realização de ensaios de atividade dos compostos 7c’ e 8c em outras bactérias, de forma a avaliar a seletividade destes compostos; a avaliação biológica e farmacocinética dos restantes compostos híbridos; e o aumento da biblioteca de compostos híbridos.While tuberculosis (TB) is curable and preventable, it continues to be a global epidemic, with a quarter of the world’s population estimated to be infected with Mycobacterium tuberculosis (Mtb), its causative agent. Global TB control has been hampered by multiple factors, such as the emergence of drug-resistant tuberculosis and an inefficient targeting of latency. The discovery of effective, safe, and compliance-friendly antitubercular (anti-TB) drugs remains a largely unmet medical need in the last 40 years. Although three drugs (bedaquiline, delamanid, and pretomanid) were recently approved, their displayed side-effects undermine widespread use. Therefore, new drugs active against drug-resistant and latent TB are urgently needed. The mycobacterial electron transport chain (ETC) has emerged recently as an interesting target for novel anti-TB drugs. As both replicant and latent bacteria require a sustained supply of ATP, it is believed that the inhibition of the ETC is an effective strategy to eliminate latent populations and therefore improve TB control. This project includes the synthesis and characterization of a small library of hybrid pharmacological tools that combine a structural feature designed to target cytochrome-bc1-aa3 with a nitric oxide releasing group, capable of inhibiting cytochrome bd. These tools thus offer the potential to block two key components of mycobacterial respiration. In this thesis, the synthesis and structural characterization of a small library of hybrid compounds are presented. Compound aqueous solubility and stability was evaluated by HPLC, the antimycobacterial activity was tested against Mtb H37Rv and Mtb cydKO, and the toxicity was tested in HEK293 cell lines. The hybrid compounds’ proposed mechanism of action was corroborated by the activity assays and compound 8c presented itself as a promising anti-TB agent. Additionally, a nitrofuranylamide (7c’) was isolated and presented itself has a very interesting lead molecule for anti-TB therapy, with sub-micromolar activity, no cytotoxicity, and a good pharmacokinetic and physicochemical profile.Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa