Potilaasta johdettujen indusoitujen pluripotenttien kantasolujen käyttö liikunnasta aiheutuvan hyperinsulinismin (EIHI) tautimallinnuksessa

Abstract

Liikunnasta aiheutuva hyperinsulinismi (EIHI) on sairaus, joka ilmenee epänormaalina insuliinin erityksenä rasituksen aikana. Monokarboksylaattien kuljettajaproteiini (MCT1), jota koodaa SLC16A1-geeni, on laajalti ilmentynyt lähes kaikissa kudoksissa paitsi haiman saarekesoluissa. Henkilöillä, jotka sairastavat EIHI:ä, SLC16A1 säätelyalueen deleetion uskotaan johtavan MCT1:n virheelliseen ilmenemiseen beta soluissa, mikä mahdollistaa kohonneiden laktaatti- ja pyruvaattipitoisuuksien virtauksen solukalvon läpi rasituksen aikana. Nämä substraatit käynnistävät Krebsin kierron, mikä lisää insuliinin eritystä. Ylimääräinen insuliinin eritys aiheuttaa alhaisen verensokeritason rasituksen aikana, mikä johtaa heikkouteen, pyörtymiseen ja sekavuuteen. Koska EIHI sairauden mekanismia ei ole aikaisemmin mallinnettu, tämän Pro-gradu tutkielman tavoitteena oli mallintaa taudin toimintamekanismeja sairaasta henkilöstä johdettujen indusoitujen pluripotenttien (iPS) kantasolujen avulla. Työssä uudelleenohjelmoitiin EIHI:ä sairastavan henkilön fibroblasteja iPS-soluiksi käynnistäen pluritpotenssia säätelevät geeniverkostot uudelleen. Tämän jälkeen sairaan henkilön sekä terveen henkilön (kontrolli) iPS solut erilaistettiin toiminnallisiksi haiman saarekesoluiksi in vitro ympäristössä rinnakkain. Seuraavassa vaiheessa soluja siirrettiin immuunipuutteisiin hiiriin, jolloin solut kypsyivät edelleen in vivo ympäristössä. Erilaisia laadunvalvontamittauksia (virtaussytometria) tehtiin erilaistamisprosessin aikana. Lisäksi tutkittiin SLC16A1-geenin ilmentymistä erilaistamisen eri vaiheissa. Lopuksi haiman betasoluiksi erilaistettujen solujen ominaisuuksia tutkittiin muun muassa mittaamalla insuliinin eritystä, sekä glukoosi-että pyruvaattistimulaation jälkeen, sekä MCT1-proteiinin immunohistokemiallisella analyysillä. Vastoin oletuksia, tutkielman tulokset osoittivat, että SCL16A1 promoottorialueen deleetiosta huolimatta sairaan henkilön beta solut erittivät insuliinia samalla tavalla kuin terveen henkilön kontrollisolut. SLC16A1-geenin ilmentyminen myös aleni vastoin odotuksia samalla tavalla kuin kontrollisoluilla. MCT1-proteiinin immunohistokemialliset värjäykset hiiren munuaiskapselin alle siirretyistä kantasolusaarekkeista kuitenkin osoitti selkeän eron; deleetion sisältävät solut ilmensivät MCT1:stä selkeästi enemmän kuin kontrollisolut. Yhteenvetona voidaan todeta, että sairauden oletetut patologiset piirteet eivät olleet selkeästi havaittavissa in vitro -mallissa. Kuitenkin munuaiskapselin alle tehtävän siirron jälkeen, in vivo -mallissa, mutanttisoluissa havaittiin MCT1:n ilmentymisen lisääntyneen huomattavasti. Tämä löydös viittaa siihen, että MCT1-ilmentymistä säätelee erillinen mekanismi, johon vaikuttaa ympäristöolosuhteet. Tulokset luovat hyvän pohjan tulevaisuudessa näitä mekanismeja tutkiville tutkimuksille.Exercise-induced hyperinsulinism (EIHI) is a pathological condition characterized by aberrant insulin secretion triggered by physical exercise or pyruvate exposure. The monocarboxylate transporter protein (MCT1), encoded by SLC16A1, is ubiquitously expressed in almost all cell types except pancreatic islet cells. In patients with EIHI, mutations in the regulatory regions of the SLC16A1 gene are thought to lead to the unwanted expression of MCT1 on the beta cell membrane, allowing the influx of elevated lactate and pyruvate blood levels during exercise. These substrates feed into the Krebs cycle, increasing insulin release. This excessive insulin secretion can lead to hypoglycemia during exercise, causing weakness, syncope, and confusion. Since EIHI has never been studied using a human stem cell-derived islets, this thesis aims to establish a robust model in which to investigate the disease mechanism in detail. To achieve this, we reprogrammed EIHI patients’ fibroblasts into a stable pluripotent state and further differentiated them into functional pancreatic stem cell-derived islets (SC-islets) in vitro. These SC-islets were then matured further in vivo (in immunocompromised mice) and compared to healthy SC-islet controls. Rigorous quality control measures were implemented throughout the differentiation process to ensure its efficacy and the expression regulation of SLC16A1 was studied during SC-islet development. Extensive phenotypic characterization was conducted using immunohistochemistry, quantitative gene expression level analysis, and insulin secretion assays with glucose and pyruvate. Contrary to expectations, the results of this study demonstrated that despite the SLC16A1 promoter mutation, the expression of SLC16A1 was downregulated similarly to the control cell line during development in vitro, resulting in similar pyruvate-stimulated insulin secretion to the control cells. Interestingly, immunohistochemical analysis of in vivo implanted SC-islets showed a clear phenotype with an increased number of MCT1-positive cells only in the mutant grafts, some of which were endocrine cells. In conclusion, the phenotypic manifestations of EIHI were not visible in the setting of in vitro modeling, which was attributed to the similar expression levels of MCT1 in both the mutant and control cell lines. However, following in vivo implantation, there was a noticeable increase in MCT1 expression exclusively in the mutant cells. This finding suggests a distinct regulatory mechanism of MCT1 expression, which might be impacted by the in vivo surroundings and the maturation state of human islets