Transcriptomic changes in response to treatment with C-MANF in different models of myelination

Abstract

Multippeliskleroosi eli MS-tauti on keskushermoston tulehduksellinen neurodegeneratiivinen sairaus, jota sairastaa maailmanlaajuisesti yli 2 miljoonaa ihmistä. MS-taudissa autoimmuunireaktio aksoneita ympäröivää myeliiniä vastaan aiheuttaa laajan kirjon neurologisia oireita, ja ajan myötä progressiivisesti heikentyvää toimintakykyä. Tällä hetkellä ei ole olemassa parantavaa hoitoa, vaan ainoastaan taudin kulkua muokkaavia lääkehoitoja. Tässä tutkimuksessa, arvioitiin C-MANF:in (C-terminaalinen mesenkefalinen astrosyyteistä peräisin oleva neurotrofinen tekijä) vaikutusta laskostumattomien proteiinien vasteeseen (UPR), neuroinflammaatioon sekä myelinaatioon, erilaisissa myelinaatiomalleissa analysoimalla geenien ekspressiota käyttäen kvantitatiivista polymeraasiketjureaktiota (qPCR). C-MANF on C-terminaalinen fragmentti solulimakalvostossa (ER) sijaitsevasta MANF-proteiinista, jonka on havaittu suojaavan soluja ER-stressin indusoimalta apoptoosilta. UPR on solunsisäinen puolustusmekansimi ER-stressiä vastaan, joka pitkittyneenä ohjaa solut apoptoosiin. C-MANF:in vaikutuksia tutkittiin ER-stressatuilla Oli-neu soluviljelmillä, sekä erilaistumattomilla että erilaistetuilla. Soluille annettiin thapsigargiinia aiheuttamaan ER-stressiä ja samanaikaisesti C-MANF:ia viiden tunnin ajan. Erilaistetuilla soluilla tutkittiin myös pidempiaikaista, 24 tunnin altistusta. C57BL/6 hiirien poikasista valmistetut organotyyppiset pikkuaivojen aivoleikkeet demyelinoitiin lysofosfatidyylikoliinilla (LPC) 17 tunnin ajan, minkä jälkeen aivoleikkeille annettiin C-MANF:ia 5 päivän remyelinaatiojakson ajan. Kokeiden päätyttyä RNA eristettiin ja muutettiin cDNA:ksi SYBR Green hyödyntävää qPCR-menetelmää varten. Lisäksi, aiemmin suoritetusta kokeellisesta autoimmuunisesta enkefalomyeliittikokeesta (EAE), jossa hiiret saivat C-MANF:ia ihonalaisesti, otettiin mukaan selkäydinnäytteitä tähän tutkimukseen, ja niille suoritettiin myös qPCR. Tämä tutkimus osoitti merkittäviä muutoksia UPR-geenien ekspressiossa erilaistetuilla Oli-neu soluilla ja EAE-hiirillä, mikä viittaa siihen, että C-MANF:illa saattaa olla UPR-signalointia lievittävä vaikutus ja siten soluja suojaava vaikutus. Neuroinflammaatiota arvioitiin aivoleikkeillä sekä EAE-hiirillä, ja molemmat mallit osoittivat merkittäviä muutoksia neuroinflammaation liittyvien geenien ekspressiossa, mikä viittaa siihen, että C-MANF:illa voi olla neuroinflammaatiota vähentäviä vaikutuksia. C-MANF:illa ei näyttänyt olevan merkittäviä vaikutuksia myelinaatioon tässä tutkimuksessa. Yksi tuloksiin mahdollisesti vaikuttanut tekijä oli suuri variaatio aivoleikkeistä saaduissa tuloksissa, mikä saattoi johtua haasteista RNA:n eristyksessä ja vaikuttaa saatuihin tuloksiin. Kuitenkin, saadut tulokset viittaavat siihen, että C-MANF:illa on potentiaalia terapeuttisena hoitona sairauksiin, joihin liittyy kohonnut UPR-signalointi sekä korkean asteen neuroinflammaatio, kuten MS-tautiin. Lisätutkimusta sekä erilaisia metodologioita tarvitaan kuitenkin näiden löydösten vahvistamiseksi.Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory neurodegenerative disease of the central nervous system, that affects over 2 million people worldwide. In MS, there is an autoimmune reaction against the myelin surrounding axons, causing neurological deficits and progressive neurological deterioration over time. Currently, there is no curative treatment for MS; only disease-modifying treatments are available. In this study, the effect of C-MANF (C-terminal mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor) on unfolded protein response (UPR), neuroinflammation and myelination was investigated in different models of myelination by analyzing gene expression with quantitative polymerase chain reaction (qPCR). C-MANF is a C-terminal fragment of endoplasmic reticulum (ER) located protein MANF, which has been shown to protect cells against ER-stress induced apoptosis. UPR is a cellular defense mechanism against ER stress, but when prolonged, it can direct cells into apoptosis. The effect of C-MANF was investigated in ER-stressed Oli-neu cell cultures, both undifferentiated and differentiated. Cells were treated for 5 hours with thapsigargin to induce ER stress and simultaneously with C-MANF. In differentiated cells, a longer 24 hour exposure to ER stress and C-MANF was also investigated. Organotypic cerebellar brain slices from C57BL/6 P10 mice were demyelinated with lysophosphatidylcholine (LPC) for 17 hours, after which C-MANF was given during 5 day remyelination period. After the experiments were conducted, RNA was isolated and converted to cDNA for quantitative polymerase chain reaction (qPCR) using SYBR green. In addition, spinal cords from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) animal experiment, where mice were given C-MANF subcutaneously, were included in this study, and qPCR was performed on them. This study showed significant changes in UPR gene expression in differentiated Oli-neu cells and EAE mice, indicating that C-MANF could alleviate UPR signaling and thus protect cells. Neuroinflammation was assessed with cerebellar brain slices and EAE mice; both models showed significant changes in gene expression related to neuroinflammation, indicating reduced neuroinflammation in response to C-MANF treatment. C-MANF did not seem to have an effect on myelination in this study. Large variation in between different groups in cerebellar brain slices may be due to challenges in RNA isolation an may have affected the results. However, these findings suggest the potential of C-MANF as a therapeutic for diseases associated with upregulated UPR signaling and a high degree neuroinflammation, such as MS. Further research and additional methodologies are needed to confirm these findings