Theileria annulata’nın Kenelere Aktarımını Engelleyebilecek Antijen Adaylarının İn vivo İncelenmesi

Abstract

Amaç: Bu çalışmada, daha önceden tanımlanmış antijen adaylarının (TA17050, TA20855, TA03640, TA10955) T. annulata'nın Hyalomma excavatum kenelerine bulaşmasını engelleme potansiyelinin araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: TA17050, TA20855, TA03640 ve TA10955 gen bölgeleri klonlanarak ilgili proteinler rekombinant olarak üretilmiştir. Takiben dört farklı deney grubu oluşturulmuş ve her bir deney grubundaki hayvanlara ayrı ayrı rekombinant proteinler ve adjuvan karışımı 21 gün arayla iki kez 500 µg dozlarda enjekte edilerek hayvanlar immunize edilmiştir. Kontrol grubundaki hayvanlara PBS + adjuvan karışımı enjekte edilmiştir. Rekombinant proteinlere karşı gelişen bağışık yanıt düzeyleri tüm hayvanlardan alınan serum örnekleri kullanılarak western blot yöntemi ile değerlendirilmiştir. İmmunizasyon sonrası deney ve kontrol grubundaki hayvanlar T. annulata Ankara 279 sporozoite stabilatı ile enfekte edilmiştir. İmmunizasyon ve enfeksiyon boyunca hayvanların tam kan analizleri ve parazitolojik muayeneleri gerçekleştirilmiştir. Antijen adaylarının parazitin kenelere aktarılmasını engelleyebilmedeki etkinliği, deneysel enfeksiyon sonrası hayvanlar üzerinde beslenen H. excavatum kenelerindeki enfekte tükürük bezi asini hücreleri sayılarak araştırılmıştır. Bulgular: Western blot analizleri, deney grubundaki buzağıların ilgili rekombinant proteinler ile başarıyla immunize edildiklerini göstermiştir. Kontrol gruplarında ise proteinlere karşı gelişmiş bir immun yanıt tespit edilmemiştir. İmmunizasyon sonrasında hayvanların beden ısılarında ve tam kan değerlerinde önemli değişiklikler tespit edilmemiş, ancak enjeksiyon yerlerinde lokal reaksiyonlar gelişmiş ve şişkinlikler oluşmuştur. Sporozoit enfeksiyonu sonrasında ise tüm hayvanlarda şiddetli klinik belirtiler gözlenmiştir. Tükrük bezi asini hücrelerinde tespit edilen ortalama enfeksiyon oranı Tams1 ile immunize edilen hayvanlarda %78,12, kontrol grubunda ise bu oran %82,72 olarak belirlenmiştir. TA03640_F1.3, TA10955_F1.2 ve TA20855 rekombinant proteinleri ile immunize edilen hayvanların tükürük bezlerindeki ortalama enfeksiyon oranları sırasıyla %59,44, %26,41 ve %26,24, kontrol gruplarında ise sırasıyla %51,87, %12,56 ve %36,63 olduğu tespit edilmiştir. Sonuç: Yapılan analizlerde kene tükürük bezi enfeksiyon oranlarının deney ve kontrol grubundaki hayvanlar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark oluşturmadığı görülmüştür. TA17050, TA03640, TA10955, TA20855 gen bölgeleri tarafından kodlanan proteinlerin in vivo iletimi bloke etme etkinliğinin istenen düzeyde olmadığı belirlenmiştir.TUBİTAK - 217O399 no'lu projeİÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY i TEŞEKKÜR ii İÇİNDEKİLER iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ viii RESİMLER DİZİNİ xi TABLOLAR DİZİNİ xii ÖZET… xiii ABSTRACT xvi GİRİŞ… 1 GENEL BİLGİLER 4 2.1. Önemli Theileria Türleri 4 2.2. Theileria annulata 5 2.2.1. Theileria annulata’da Vektör 7 2.2.2. Türkiye’de Tropikal Theileriosis’in Epidemiyolojisi 9 2.2.3. Theileria annulata’nın Yaşam Döngüsü 11 2.2.3.1. Omurgalı Konaktaki Yaşam Döngüsü 13 2.2.3.2. Omurgasız Ara Konaktaki (Kene) Yaşam Döngüsü 15 2.2.4. Tropikal Theileriosis’te Teşhis ve Tedavi 24 2.2.5. Tropikal Theileriosis’te Koruma ve Kontrol Yöntemleri 25 2.2.6. Bazı Protozoonlara Karşı Geliştirilen Aktarımı Engelleyici Antijenler 28 2.2.6.1. Plasmodium spp. için Kullanılan Aktarımı Engelleyici Antijenler 28 2.2.6.2. Leishmania spp. için Kullanılan Aktarımı Engelleyici Antijenler 32 2.2.6.3. Babesia spp. Aktarımı Engelleyici Antijenler 35 2.2.6.4. Theileria spp. Aktarımı Engelleyici Antijenler 37 3. GEREÇ VE YÖNTEM 39 3.1. Gereç 39 3.1.1. Hayvan Materyali 39 3.1.2. Parazit Materyali 40 3.1.3. Kene Kolonizasyonu 40 3.2. Yöntem 40 3.2.1. Parazitin Kenelere Aktarımını Engelleyebilme Potansiyeli Sahip Aday Genlerden Primer Tasarlanması 40 3.2.2. Aday Gen Bölgelerinden Tasarlanan Primerlerin Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Çoğaltılması 45 3.2.3. Proteinleri Kodlayan Aday Gen Bölgelerinden Çoğaltılan PZR Ürünlerinin Klonlanması 45 3.2.4. Klonlanan Gen Bölgelerinden Kodlanan Proteinlerin Saflaştırılması 51 3.2.5. In vivo Deneylerde Kullanılacak Saflaştırılmış Rekombinat Proteinlerin Miktarlarının Belirlenmesi 53 3.3. In vivo Deneyler 54 3.3.1. Protein ve Adjuvant Karışımının Hazırlanması 54 3.3.2. İmmunizasyon 55 3.3.3. İmmunizasyonun Western Blot ile Değelerlendirilmesi 56 3.3.4. İmmunizasyon Sonrası Hayvanların Enfekte Edilmesi 58 3.3.5. Enfekte Hayvanlardan Piroplazm Pürifikasyonu ve Protein Ekstraktı Hazırlanması 60 3.3.6. Kene Diseksiyonu ve Tükürük Bezlerinin Metil-Green Pyronin ile Boyanması 61 4. BULGULAR 63 4.1. Aday Proteinlerin Üretilmesi 63 4.1.1. PZR ile Aday Gen Bölgelerinin Çoğaltılması 63 4.1.2. Aday Gen Bölgelerinin Klonlanması 66 4.1.3. Aday Gen Bölgelerinin Dizilim Analizleri 70 4.1.4. Üretilen Rekombinant Proteinlerin Değerlendirilmesi 76 4.2. In vivo Deneyler 81 4.2.1. TA17050 Geni Tarafından Kodlanan Tams1 Proteinin In vivo Etkinliğinin 83 4.2.2. TA10955_F1.2 Gen Bölgesi Tarafından Kodlanan Hipotetikal Proteinin In vivo Etkinliğinin Değerlendirilmesi 95 4.2.3. TA03640_F1.3 Geni Tarafından Kodlanan Hipotetikal Proteinin In vivo Etkinliğinin Değerlendirilmesi 107 4.2.4. TA20855 Geni Tarafından Kodlanan Hipotetikal Proteinin In vivo Etkinliğinin Değerlendirilmesi 119 4.3. In vivo Deneyler Sonucunda Elde Edilen Kenelerin Tükürük Bezi Enfeksiyon Oranları 130 5. TARTIŞMA 136 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 150 KAYNAKLAR 152 EKLER 17