Strategies for detecting DNA hybridisation using surface plasmon fluorescence spectroscopy

Abstract

Die Anregung und Emission von Fluorophoren nahe planaren Metalloberflächen und schiefen Gittern wurde mittels Oberflächenplasmonen Fluoreszenz Spektroskopie (SPFS) untersucht. Die Fluorophore konnten durch das evaneszente Plasmonenfeld angeregt und die einzelnen Abregungskanäle identifiziert werden.Die Sensorarchitektur für den Nachweis der Hybridisierung bestand aus auf einer Streptavidin-Matrix immobilisierten unmarkierten Sondensträngen. Cy5 markierte Zielsequenzen wurden aus der Lösung hybridisiert und die Adsorptionskinetiken konnten oberflächensensitiv detektiert werden.Ein neues Detektionsschema für unmarkierte Zielstränge wurde mittels fluoreszenzmarkirten Sondensträngen realisiert. Die Hybridisierung führte zu der Bildung von steifen helikalen Bereichen in der Probe und separierte den Farbstoff von der Metalloberfläche. Reduzierte Fluorezenzlöschung zeigte daher das Hybridisierungsereignis an.Die Verwendung eines potentiellen Förster-Paares zur Detektion von DNA Hybridisierung wurde untersucht. Donor und Akzeptor wurden an Ziel- und Sondenstrang immobilisiert und das Hybridisierungsereignis konnte anhand der Auslöschung der Donor-Fluorezenz nachgewiesen werden.Schließlich wurde der Einsatz von einzelstrangbindenden Proteinen (SSB) zur Steigerung der Sensitivität bezüglich Basenfehlpaarungen betrachtet. Verdrängungsreaktionen zwischen Proteinen und markierten Zielsträngen wurden anhand von SPS und Fluorezenzkinetiken studiert.The excitation and emission of fluorescent molecules on planar metal surfaces and blazed metal gratings was investigated using surface plasmon fluorescence spectroscopy (SPFS). Fluorescent molecules were excited in the evanescent surface plasmon field and the different decay mechanisms for fluorescence were identified.The sensor architecture used for the detection of hybridisation consisted of an unlabelled oligonucleotide probe sequence immobilised on a streptavidin matrix. Cy5 labelled target sequences were hybridised from solution and online adsorption kinetics were monitored surface sensitive.A novel detection scheme for unlabelled targets was developed using immobilised Cy5 labelled probe sequences. Hybridisation to the unlabelled target sequence caused the formation of stiff helical structures in the probe and separated the dye from the surface. Reduced quenching by the metal surface hence indicated the hybridisation event.A potential Förster pair was investigated for the detection of hybridisation. Donor and acceptor dyes were immobilised on the probe and target strands, respectively. The hybridisation between probe and target thus caused a quenching of the donor fluorescence.Finally, the use of single strand binding proteins (SSB) for the enhancement of the mismatch discrimination sensitivity was analysed. Replacement reactions between fluorescently labelled targets and the proteins were studied on the basis of SPS and fluorescence kinetics