Variante de splicing 2 da TBCCD1 : um elemento chave na formação dos cinetocoros?

Abstract

Tese de Mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO gene humano tbccd1 sofre splicing alternativo e origina as proteínas TBCCD1v1 e TBCCD1v2. Enquanto a TBCCD1v1 é uma proteína centrossomal com um interatoma de proximidade vasto e enriquecido noutras proteínas relacionadas com o centrossoma, a TBCCD1v2 tem uma localização citoplasmática e tem um interatoma de proximidade com apenas 19 proteínas. Estudos sobre a função da TBCCD1v1 realizados no grupo mostraram que é uma proteína importante na estabilização da ligação dos microtúbulos ao centrossoma. Contudo, a função da TBCCD1v2 continuava desconhecida. Este trabalho teve como objetivo distinguir funcionalmente as duas variantes da TBCCD1 através do estudo quer da sua depleção individual quer do interatoma de proximidade da TBCCD1v2. Através da tecnologia CRISPR/Cas9 geraram-se três linhas celulares mutantes, sendo que duas delas tinham como alvo a depleção de TBCCD1v1 e na terceira o alvo foi a TBCCD1v2. Com esta nova ferramenta, obtiveram-se evidências de que os fenótipos centrossomais e no Aparelho de Golgi previamente descritos se devem, provavelmente, à depleção de TBCCD1v1. A observação de micronúcleos e núcleos morfologicamente alterados nas linhas criadas sugerem o papel da TBCCD1 na progressão do ciclo celular e na precisão da divisão celular. O interatoma de proximidade da TBCCD1v2 está enriquecido em proteínas associadas com o citoesqueleto de microtúbulos e com a divisão celular. De acordo com este facto, observou-se que a depleção de TBCCD1v2 causa o aumento do tamanho da célula e afeta a densidade e acetilação do seu citoesqueleto de microtúbulos. Além disso, observou-se que a sobreexpressão de TBCCD1v2 diminui os níveis de CENP-M, uma proteína do cinetocoro, cuja sobreexpressão tem sido associada com a tumorigénese. Este trabalho sugere que a TBCCD1v1 e a TBCCD1v2 possam ter funções semelhantes nas células, mas em diferentes locais, sendo importantes na divisão celular e na estabilização de microtúbulos no centrossoma ou no cinetocoro, respetivamente.The human tbccd1 gene undergoes alternative splicing and originates the TBCCD1v1 and TBCCD1v2 proteins. While TBCCD1v1 is a centrosomal protein with a vast proximity interactome enriched in other centrosome-related proteins, TBCCD1v2 localizes in the cytoplasm and has a smaller proximity interactome of 19 proteins. The functional role of TBCCD1v1 has been extensively studied in the group and it is known that TBCCD1v1 is important for microtubule stabilization and anchoring to the centrosome. However, TBCCD1v2 function remained unclear. This work aimed to functionally distinguish both TBCCD1 variants by studying the effects of their individual depletion and by exploring the TBCCD1v2 proximity interactome. Employing the CRISPR/Cas9 technology led to the isolation of three mutant cell lines, being that in two of those lines the depletion target was TBCCD1v1 and in the other line the target was TBCCD1v2. With this new tool, we gathered evidence that the previously described phenotypes affecting the centrosome and Golgi Apparatus were likely due to the depletion of TBCCD1v1. Additionally, in this work we observed that depletion of TBCCD1v1 causes an increase in cells that present micronuclei or abnormal nuclear shapes suggesting defects in cell cycle progression and in the accuracy of cellular division. As for TBCCD1v2 its proximity interactome is enriched in proteins associated with the microtubule cytoskeleton and cellular division. Accordingly, it was observed that TBCCD1v2 depletion affects the cell size and the microtubule cytoskeleton density and acetylation. Furthermore, it was observed that TBCCD1v2 overexpression downregulates the expression of kinetochore protein CENP-M, whose overexpression has been widely associated with tumorigenesis. Altogether, this work suggests that TBCCD1v1 and TBCCD1v2 may have a similar role in the cell but in different locations, having an impact in cellular division and microtubule stabilization either in the centrosome or in the kinetochore, respectively

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Last time updated on 06/10/2022

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