Generierung und Charakterisierung von Saccharomyces cerevisiae-Ganzzellsensoren für die Detektion von Essigsäure

Abstract

Im Bereich der Biosensorik nehmen Sensoren auf der Grundlage lebender Zellen eine besondere Rolle ein: Mit ihrer Hilfe ist es möglich ohne großen technischen Aufwand die Bioverfügbarkeit eines spezifischen Analyten zu detektieren. Aufgrund ihrer Robustheit und der Einfachheit der Kultivierung eignet sich die Hefe S. cerevisiae in besonderem Maß zur Generierung von Ganzzellsensoren. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes dieses eukaryotischen Mikroorganismus ist die Möglichkeit der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf höhere Organismen. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung hefebasierter Ganzzellsensoren für die Detektion von Essigsäure. Als Referenzanwendung diente der Biogasprozess, denn dort ist die Essigsäure sowohl ein Zwischenprodukt als auch ein Indikator für Prozessstörungen. Zur Optimierung der Produktion und einer besseren Steuerung von Biogasanlagen ist daher eine kontinuierliche Überwachung der Essigsäurekonzentration im Prozess sinnvoll. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit 5`-YGP1, 5`-TPO2 und 5`-YRO2 drei Essigsäure-spezifische Promotoren identifiziert werden. Durch Kopplung mit einem rot-fluoreszierenden Protein entstanden Reportergenkonstrukte, die in Hefezellen verbracht wurden. Entsprechende Transformanden wurden initital charakterisiert. Das Reportergenkonstrukt 5`-YGP1-tRFP erwies sich aufgrund der Stärke und des Verlaufs des Fluoreszenzsignals für die Generierung eines Ganzzellsensors als besonders geeignet. Die erzeugten rekombinanten Hefen fluoreszierten in Anwesenheit von Essigsäure abhängig von der eingesetzten Konzentration der Säure in einem Bereich von 1,5 bis 35 mM. Beispielsweise konnte bei Zugabe von 30 mM Essigsäure eine bis zu 20-fache Induktion der Fluoreszenzsignale beobachtet werden. Im weiteren Verlauf erfolgten unter anderem Analysen zur Regeneration des entwickelten hefebasierten Sensors. Die Regenerationszeit betrug ca. 8 h. Die erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Möglichkeit einer Mehrfachanwendung besteht. Zur Optimierung des Sensors wurde der Einsatz von Stämmen, bspw. mit der Deletion spezifischer Transporter zum Import von Essigsäure bzw. dem Export von Acetationen, untersucht. Hinsichtlich einer erhöhten Signalstärke oder kürzeren Reaktionszeit war jedoch kein Einfluss einer Deletion nachweisbar. Zur Untersuchung der Querempfindlichkeit wurden andere, ebenfalls im Biogasprozess vorkommende, flüchtige Fettsäuren getestet. Dabei konnte die Spezifität des entsprechenden Ganzzellsensors für die Essigsäure gezeigt werden. Testungen von Realproben aus dem Biogasprozess, die vom Projektpartner bereitgestellt worden waren, verliefen vielversprechend. Für den Einsatz von Ganzzellsensoren in der Praxis ist eine lange Standzeit von Vorteil. Aus diesem Grund wurde im weiteren Verlauf der Arbeit dazu übergegangen, Reportergenkonstrukte stabil im Genom der Hefe zu integrieren um die Langzeitstabilität dieser generierten Ganzzellsensoren zu untersuchen. Durch Paarung und Sporulation wurden Sporen erzeugt, aus denen nach der Lagerung über einen Zeitraum von bis zu sechs Monaten vegetative Hefezellen erfolgreich reaktiviert werden konnten. Dabei fluoreszierten die Ganzzellsensoren in Anwesenheit von Essigsäure mit der gleichen Stärke und Konzentrationsabhängigkeit wie zu Beginn der Lagerung. Durch den Einsatz des auf dem Hefe-Pheromonsystem basierenden Verstärkersystems für zelluläre Signale, welches bereits in der Arbeitsgruppe etabliert ist, konnte das nach der Integration abgeschwächte Fluoreszenzsignal erfolgreich 30 bis 40-fach amplifiziert werden

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