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Synthesis and characterization of novel self-delivering amino acid-RNA conjugates for the development of potent siRNA prodrugs

By Jovanka Bogojeski

Abstract

Small interfering RNA (siRNA) has the ability to silence virtually any gene of interest. The canonical structure, however, is negatively charged and hydrophilic. It is thus repulsed by the negatively charged phosphodiesters of the cellular membrane and prevented from penetrating the lipophilic membrane core. The main goal of this thesis is to synthesize siRNA conjugates containing 2'-sugar modifications that reduce the overall negative charge of the molecule and cause its unassisted cellular uptake, and to utilize these modifications to synthesize a biolabile analogue (a promoiety) in a prodrug siRNA (proRNA) construct. To this end, RNA conjugates were synthesized containing various 2'-O-amino acid acetal ester (2'-O-AAE) promoieties. The 2'-O-phenylalanine (2'-O-Phe) AAE was most stable in the aqueous and alcoholic RNA purification and handling conditions to which the 2'-O-AAEs investigated were exposed. A comparison of hydrolysis rates between the 2'-O-Phe AAE and a 2'-O-hydrocinnamic acetal ester suggested that 2'-O-Phe AAE hydrolysis occurs in aqueous buffer due to the alpha amino group acting as a general acid catalyst. Anhydrous and aprotic deprotection and handling solutions were employed, including FMOC and cyanoethyl elimination with dry triethylamine/acetonitrile, to yield a poly-thymidine oligonucleotide containing a 2'-O-Phe AAE insert, with minimal evidence of premature cleavage. In order to validate the incorporation of the 2'-O-Phe AAE modification in a self-delivering proRNA construct, the analogous 2'-N-acyl-L-phenylalanine modification was assessed for its ability to cause RNA conjugates to penetrate cellular membranes. Using flow cytometric fluorescence resonance energy transfer (FCET), naked cyanine-3/5 labeled RNA conjugates containing 2'-N-acyl-L-phenylalanine modifications were found to penetrate human glial cells to a much greater extent than the unmodified counterpart. This work suggests that the analogous 2'-O-Phe AAE modification could also cause increased cellular uptake of RNA conjugates.2'-N-acyl-L-phenylalanine modification was incorporated into internal positions of siRNAs targeting endogenous genes B-cell lymphoma-2 (bcl-2) and downregulated in renal cell carcinoma (drr), and the siRNAs were transfected into human colonic cells and human glial cells, respectively. Downregulation was dependent on the placement of these inserts; insertion of biolabile 2'-O-Phe AAEs at positions particularly vulnerable to modification may improve potencies. A self-delivering siRNA construct comprised of a phosphorothioate tail and thirteen 2'-N-acyl-L-phenylalanine inserts achieved potent DRR downregulation in comparison to the unmodified siRNA containing only a phosphorothioate tail. Delayed onset of silencing by our highly modified asymmetric siRNA suggests that the construct's silencing kinetics diverges from that of canonical siRNA, and thus selective insertion of 2'-O-Phe AAEs may extend the duration of action of the self-delivering tailed siRNA. Finally, high-purity RNA was synthesized using a solid support linker and protecting groups that are orthogonal to the 2'-O-Phe AAE modification in preparation for the synthesis of proRNA. This work lays the foundation for the rational design of self-delivering and potent asymmetric proRNA.Les petits ARN interférents (siARN) ont la possibilité d'inhiber l'expression de pratiquement n'importe quel gène d'intérêt. L'objectif principal de cette thèse est de synthétiser des conjugués de siARNs comportant des modifications chimiques sur la position 2ʹ du sucre réduisant sa charge globale négative et susceptibles d'entraîner une pénétration cellulaire sans assistance. Pour ce faire, des brins d'ARN contenant des progroupes d'acétalesters d'acides aminés en position 2ʹ ont été synthétisés (2ʹ-O-AAE). L'acétalester de la phénylalanine en position 2ʹ (2ʹ-O-Phe AAE) était la plus stable des modifications étudiées, en milieu aqueux et alcoolique nécessaires à la purification d'ARN et face aux conditions expérimentales de manipulation. En comparant les taux d'hydrolyse des AAE 2ʹ-O-Phe et d'acide hydrocinnamique, nous avons estimé que l'hydrolyse des 2ʹ-O-Phe AAE en milieu aqueux s'effectue à l'aide de la fonction -amine jouant le rôle d'un catalyseur acide. Sous des conditions de déprotection et de manipulation anhydres et aprotiques, et ce pendant la déprotection des groupements Fmoc et cyanoéthyles requérant l'utilisation de triéthylamine/acétonitrile secs, nous avons pu isoler un polythymidylate contenant une modification 2ʹ-O-Phe AAE en minimisant son hydrolyse prématurée. Afin de valider l'intérêt de l'incorporation d'une modification 2ʹ-O-Phe AAE dans un siARN capable de s'auto-administrer dans une cellule, nous avons testé la capacité d'une modification analogue, la 2ʹ-N-acyl-L-phénylalanine, à induire la pénétration cellulaire d'un conjugué d'ARN. En utilisant la technique de transfert d'énergie entre molécules fluorescentes suivi par cytométrie en flux (FCET « flow cytometric fluorescence resonance energy transfer »), il a été possible de voir que des conjugués « nus » d'ARN, possédant un marqueur fluorescent cyanine3 ou 5 ainsi que des modifications 2ʹ-N-acyl-L-phénylalanine étaient capables de pénétrer des cellules gliales humaines en plus grande proportion que les versions d'ARN non-modifié. Cette étude suggère que la modification analogue 2ʹ-O-Phe AAE aurait un effet similaire sur la pénétration cellulaire de conjugués d'ARN.La modification 2ʹ-N-acyl-L-phénylalanine fut ensuite intégrée à des siARNs ciblant les gènes des lymphomes à cellule B (B-cell lymphoma 2, bcl-2) de cellules humaines du côlon et les oncogènes de carcinomes à cellules rénales (downregulated in renal cell, drr) dans des cellules gliales humaines. La régulation négative s'est révélée dépendante du positionnement de ces insertions et la présence de groupements biolabiles 2ʹ-O-Phe AAE à des positions particulièrement sensibles aux modifications pourrait améliorer l'efficacité des siARNs. Un siARNs modifié avec treize incorporations de 2ʹ-N-acyl-L-phénylalanine ainsi que des liens phosphorothioate sur la partie terminale de la chaîne oligonucléotidique (queue) s'est montré capable de régulation négative de drr en l'absence d'agent de transfection, contrairement à des siARNs ne contenant que des liens phosphorothioate en queue de chaîne. L'action retardée de silençage de l'expression génétique induite par nos siARN largement modifiés suggère que la cinétique du silençage diffère de celle des siARNs non-modifiés, et laisse ainsi entrevoir la possibilité que l'insertion sélective de 2ʹ-O-Phe AAEs puisse accroître la durée d'action de siARNs auto-délivrants. Enfin, la synthèse d'ARN de grande pureté s'est effectuée à l'aide d'un lien sur support solide et de groupements protecteurs orthogonaux à la modification 2ʹ-O-Phe AAE, et ce en préparation de la synthèse de prodrogues de siARN. Le travail de cette thèse représente ainsi un dévelopement important vers la conception méthodique et la préparation de prodrogues auto-délivrantes et efficaces de siARN

Topics: Chemistry
Publisher: McGill University
Year: 2017
OAI identifier: oai:digitool.library.mcgill.ca:146863
Provided by: eScholarship@McGill
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