Staphylococcus aureus : Plasminogen activation in vitro and prognostic markers in bacteraemic disease

Abstract

Introduction. Staphylococcus aureus is a frequent finding in blood cultures from patients with bacteraemia (presence of bacteria in the blood). S. aureus bacteraemia (SAB) SAB is often complicated by deep infection foci. The invasion mechanisms of S. aureus are incompletely characterised. Several other pathogens use plasmin, proteolytic enzyme, in tissue invasion. Pathogens have the capacity to bind plasminogen (inactive form of plasmin) from the blood circulation to the bacterial cell-surface. Binding of plasminogen to cell-surface facilitates the activation of plasminogen to plasmin by the human plasminogen activators. S. aureus produces plasminogen activator, staphylokinase (SAK) and it can also activate plasminogen to active plasmin. Bacterial cell-surface bound plasmin activity could theoretically be one invasion mechanism of S. aureus. The mortality rate with SAB is around 20%. Prognosis depends on the underlying diseases and treatment, severity of the acute disease and development of deep infection foci. Biomarkers to identify complicated cases to guide treatment decisions are needed. C-reactive protein (CRP) has been used as a marker of inflammation, organ dysfunction and treatment response in systemic bacterial infections. In SAB use of CRP as a prognostic marker is incompletely understood. Single nucleotide variations (SNPs) in the CRP gene determine partly the variation in the basal CRP levels. Impact of CRP gene SNPs to CRP levels in generalised severe infections is mainly unclear. Soluble urokinase plasminogen activator receptor (suPAR) is a novel prognostic biomarker. Elevated suPAR levels in malignant and infectious diseases have been detected to associate with poor prognosis. Study bacteria, population and aims. The study I aimed to clarify the interaction of plasminogen, SAK and S. aureus cells and to characterise potential plasminogen receptor molecules of S. aureus in vitro. The II-IV studies were performed to evaluate CRP, white blood cell (WBC) count and suPAR levels as predictors of prognosis in SAB. The study three aimed to evaluate the impact of CRP gene SNPs to CRP levels and prognosis in SAB. The studies II-IV were based on 430 prospectively followed SAB patients in a multicentre study from 1999-2002. Main results. S. aureus bacterial cells and bacterial cell proteins enhanced the activation of plasminogen to plasmin by SAK. Activation was shown to be protected against the activation inhibitor enzyme. Three tentative bacterial cell-surface bound proteins responsible for plasminogen binding were purified and further characterised. CRP levels were higher in patients with fatal outcome compared to survivors starting from day four. CRP level >103 mg/L on day four and >61 mg/L on day 14 were predictive for a 30-day fatal outcome. WBC count (>8.6 x109/L) was predictive only on day 14. CRP levels on the day one >108 mg/L and on day 14 CRP >22 mg/L predicted the presence of deep infection. Deep infection focus was found in 84% of patients. The highest maximal CRP level was shown to be partly determined by the presence of deep infection focus and by carriage of rare CRP gene SNP. In analysis of CRP gene data, no differences were detected in clinical manifestations of SAB, predisposing factors or underlying diseases. SAB patient fatalities could be distinguished from survivors by suPAR levels starting from day three. This difference persisted for ten days. Presence of deep infection focus was not observed to impact to suPAR levels. The result of study I clarifies complex S. aureus virulence mechanisms and as such is not directly applicable to clinical use. The results of studies II-IV are directly applicable in clinical practice, identifying complicated cases and guiding treatment decisions.Tausta. Staphylococcus aureus on vaikeissa yleisinfektioissa yleisimpiä veriviljelyssä todettavia bakteereja. Bakteremia tarkoittaa bakteerin esiintymistä veressä. S. aureus bakteremiassa (SAB) bakteerit leviävät elimistössä laajalti ja aiheuttavat usein elimistöön syviä infektiopesäkkeitä. S. aureus bakteerin kudoksiin tunkeutumismekanismit tunnetaan puutteellisesti. Monien nopeasti elimistössä leviävien bakteerien tiedetään kykenevän hyödyntämään leviämisprosesseissaan proteiineja hajottavaa plasmiini entsyymia. Plasminogeeni on verenkierrossa esiintyvä plasmiinin epäaktiivinen muoto. S. aureus tuottaa plasminogeenin aktivaattoria staphylokinaasia (SAK). S. aureus bakteerin pintaan sitoutunut aktiivinen plasmiini voisi teoriassa olla merkittävä tekijä yleistyneen infektion syntyä edistävä tekijä. SAB:n ennuste on huono, noin joka viides tautiin sairastuneista potilaista menehtyy. Korkean kuolleisuuden tiedetään liittyvän toisaalta perussairauksiin ja toisaalta yleisinfektion vaikeusasteeseen sekä syvien infektiopesäkkeiden esiintymiseen. C-reaktiivinen proteiini (CRP) on tunnettu elimistön yleistyneen tulehdustilan merkkiaine. CRP on käyttökelpoinen esimerkiksi hoidon vasteen arvioinnissa yleistyneissä bakteeri-infektioissa. SAB:issa hoitoa ohjaavia raja-arvoja ei ole määritetty. CRP:n perustasoon vaikuttavat perintötekijät, kuten CRP geenin yksittäisen nukleotidin monimuotoisuudet (SNP:t). Yleistyneessä infektiossa CRP geenin SNP:ien merkityksestä CRP tasoihin tiedetään kuitenkin vain vähän. Seerumin suPAR on uusi tulehduksen merkkiaine. Infektioissa ja pahanlaatuisissa sairauksissa suPAR:in on havaittu olleen ennusteellinen. Kysymyksenasettelu. Väitöskirjassa on pyritty selvittämään laboratorio-olosuhteissa S. aureus bakteerin mahdollisen taudinaiheuttamistekijän, SAK:n, elimistön plasminogeenin ja bakteerisolujen toimintamekanismeja. Lisäksi prospektiivisesti vuosina 1999-2002 seuratuista 430 SAB potilaasta kerätystä tutkimusaineistosta on pyritty selvittämään SAB potilaiden kuolleisuuden ja syvien infektiopesäkkeiden ilmaantuvuuksien suhdetta CRP tasoihin ja veren valkosoluarvoihin, CRP geenin SNP:ien vaikutuksia SAB:n ennusteeseen ja taudinkulkuun sekä suPAR:in merkitystä SAB:issa kuolemanriskiä tai syvää infektiopesäkettä ennustavana tutkimuksena. Tulokset. S. aureus bakteerisolujen läsnäolo tehosti ja suojasi plasmiinin muodostumista plasminogeenistä. Bakteereihin sitoutuneen plasminogeenin määrä oli verrannollinen mitattuun plasmiinin aktiivisuuteen. Bakteerien pintaproteiinien tutkimuksessa pystyttiin löytämään lisäksi eristämään kolme S. aureus bakteerin plasminogeenia sitovaa rakennetta. CRP yli 103 mg/L oli neljäntenä päivänä ennusteellinen suurentuneelle kuolemanriskille. Koholla olevat veren valkosolutasot olivat ennusteellisia vasta kahden viikon kuluttua. CRP yli 108mg/l veriviljelypäivänä ja CRP yli 22 mg/L kahden viikon kohdalla olivat ennusteellisia syvän infektiopesäkkeen olemassaololle. Syvä infektiopesäke oli havaittavissa suurimmalla osalla potilaista (84%) jo hoidon alkuvaiheessa. Ensimmäisen viikon merkittävästi korkein CRP arvo havaittiin potilailla, joilla oli sekä syvä infektiopesäke että harvinainen CRP geenin SNP. Minkään CRP geenin SNP:in ei kuitenkaan havaittu liittyvän SAB:lle altistaviin tekijöihin, perussairauksien esiintyvyyteen tai kliiniseen taudinkulkuun. Seerumin suPAR tasot olivat merkittävästi korkeammat alkaen kolmannesta päivästä tautiin menehtyvillä kuin taudista selviävillä potilailla. Syvän infektiopesäkkeen olemassaolon ja korkean suPAR tason välillä ei havaittu yhteyttä. Tuloksia voidaan soveltaa suoraan soveltaa S. aureus bakteremia potilaiden komplisoituneen taudin tunnistamisessa ja hoidon ohjaamisessa. Lisäksi tutkimuksen tulos voi auttaa paremmin ymmärtämään S. aureus bakteerin taudinaiheuttamiskykyä