In Vitro Cell Expansion and CTLA4 in Advanced T-Cell Therapies

Abstract

T cells are a promising therapeutic target and remedy in modern medicine. Various ways of modifying T-cell response are under development with a view to treating cancer, autoimmune diseases, and transplantation-related complications. T-cell function can be steered by altering target recognition or cosignaling receptors as well as by inducing immunological memory or regulatory T cells (Tregs). Unwanted immune responses can be curtailed by administering Tregs and, perhaps, long-lasting immunological tolerance can be induced. Cytotoxic T cells can be directed against cancer cells. Considerable T-cell numbers are required for clinical efficacy. Therefore, in vitro cell expansion is often necessary and cultures are commonly supplemented with interleukin (IL)-2. As T-cell activation, proliferation, effector differentiation, and the development of memory are inherently coupled to each other, excessive stimulation during expansion may lead to exhaustion. Hence, cells with weaker therapeutic potency may be produced. In this thesis, various methods of T-cell activation and in vitro cell expansion were evaluated particularly in the context of personalized medicine and cell therapy. Good therapeutic response to T-cell therapy in cancer depends in part on the survival of T cells and T-cell memory. The present study demonstrated that the proportion of memory T cells could be increased by limiting the length of in vitro T-cell expansion and by reducing the amount of IL-2. This study further showed that as a result of in vitro expansion Tregs expressed higher levels of the Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA4) cosignaling receptor. CTLA4 is a central molecule for the Treg-mediated inhibition. The level of CTLA4 expression in Tregs correlated with higher inhibitory function of the cells. Apparently, high CTLA4 receptor expression after cell expansion was in part a result of changes in the alternative splicing of CTLA4 messenger RNA (mRNA). It was also found that the splicing preferences and the expression levels of CTLA4 mRNAs were associated with genetic variation in the T-cell cosignaling receptor gene region. This thesis provides new knowledge that can be applied in the evaluation of individual variation in T-cell immunity and the production of therapeutic T cells. The T-cell expansion method that was developed here is directly applicable in T-cell manufacturing, and the findings may have substantial clinical relevance.T-solut ovat lymfosyyttejä, veren valkosoluja, jotka ovat välttämättömiä immuunipuolustuksellemme. Niillä on kolme päätehtävää: auttaja T-solut toimivat yhtenä immuunivasteen alkuunpanijoista aktivoimalla muita immuunisoluja, sytotoksiset T-solut tappavat epänormaaleja, esimerkiksi viruksen infektoimia tai syövän seurauksena muuntuneita omia solujamme, ja regulatoriset T-solut (Treg) hillitsevät immuunivastetta ja toimivat immunologisen tasapainon ylläpitäjinä. Modernissa lääketieteessä T-solut ovat sekä lupaava terapian kohde että parannuskeino. Syövän, autoimmuunitautien ja elin- ja kudossiirtoihin liittyvien komplikaatioiden hoitoon on kehitteillä useita tapoja muovata potilaan T-solujen toimintaa. Yksi uusimmista kokeellisista hoitomuodoista on T-soluterapia, jossa potilaan kehoon annosteltava lääke on laboratorio-olosuhteissa (in vitro) käsiteltyjä T-soluja. Sytotoksiset T-solut voidaan suunnata tunnistamaan ja tappamaan syöpäsoluja tavanomaista tehokkaammin. Lymfosyyttien immunologista muistia hyödyntäen voidaan mahdollisesti saada aikaan pysyvämpiä hoitovasteita. Ei-toivottuja immuunivasteita taas voidaan rajoittaa antamalla potilaille Treg-soluja, jotka vähentävät omiin tai siirrettyihin kudoksiin kohdistuvaa immunologista solutuhoa. Hoitovasteen aikaan saamiseksi potilaille täytyy yleensä antaa T-soluja huomattava määrä. Siksi solujen määrän lisäämiseksi laboratorio-olosuhteissa suoritettava soluviljelyvaihe eli solujen ekspansio on usein välttämätön. Tavallisesti tällaisissa soluviljelmissä käytetään T-solujen kasvutekijänä interleukiini-2 (IL-2) sytokiinia. T-solujen aktivaatio, jakaantuminen, toiminnallisiksi soluiksi erilaistuminen ja muistisolujen syntyminen ovat luontaisesti kytkeytyneet toisiinsa, jolloin liiallinen solumäärän lisääminen soluviljelmässä saattaa johtaa solujen toiminnallisuuden vähenemiseen. Täten on riskinä tuottaa soluja, joiden terapeuttinen kyky on heikentynyt. Tässä väitöskirjassa arvioitiin T-solujen aktivointi- ja viljelymenetelmiä yksilöllisen lääkehoidon ja soluterapian näkökulmasta. Syövän hoidossa hyvä hoitovaste T-soluterapialle riippuu osaltaan T-solujen annostelun jälkeisestä eloonjäännistä ja muisti T-soluista. Tämä tutkimus osoitti, että muisti T-solujen lukumäärää voidaan lisätä lyhentämällä T-solujen soluviljelyvaiheen pituutta sekä vähentämällä IL-2:n pitoisuutta. Osoitimme myös, että lukumäärää lisäävän soluviljelyvaiheen seurauksena Treg-solut ilmensivät enemmän CTLA4 (Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4) proteiinia, joka on keskeinen molekyyli niiden välittämässä immuunivasteen säätelyssä. CTLA4:n ilmenemistaso liittyi Treg-solujen parempaan inhibointikykyyn. Ilmeisesti korkea CTLA4:n ilmeneminen soluviljelyn jälkeen oli osittain seurausta muutoksista CTLA4:n lähetti-RNA:n (mRNA) vaihtoehtoisessa silmukoinnissa. Myös perinnöllinen vaihtelu CTLA4 geenialueella vaikutti silmukointiin ja siten eri CTLA4 muotojen ilmenemiseen. Tämän väitöstutkimuksen tuomaa uutta tietoa voidaan soveltaa yksilöllisen T-soluimmuniteetin arvioinnissa ja hoitoon tarkoitettujen T-solujen valmistuksessa. Tutkimuksessa kehitetty soluviljelymenetelmä T-solujen lukumäärän lisäämiseksi on suoraan sovellettavissa T-solujen tuotantoon ja näin ollen tutkimustuloksilla voi olla todellista kliinistä merkitystä