Extracellular lipid particles in atherosclerosis and aortic stenosis

Abstract

Aortic stenosis and athrosclerosis are slowly progressing diseases. Being clinically silent, as they start developing decades before they cause symptoms, cardiovascular diseases and atherosclerosis in particular, are the leading cause of morbitidy and mortality in the Western world. Lipid accumulation begins both in the artery walls and in the aortic valves before any clinical signs of atherosclerosis or aortic stenosis can be detected. While atherosclerotic lesions are characterized with cells filled with lipid droplets i.e. foam cells, and they are found to be calcified only in the late stages of atherosclerosis, the stenotic aortic valve leaflets contain both lipid droplets and calcified nodules already in early lesions. The proteoglycan matrix common to artery wall and aortic valve leaflets retains the entering lipoprotein particles that are then enzymatically and oxidatively modified. Such modifications have an ability to transform the non-inflammatory plasma lipoprotein particles into crystals and particles that can induce sterile inflammation in the various intimal and valvular cells. This thesis was set to study the distribution and characteristics of the extracellular lipid and to reveal the origin of the extracellular lipid particles. Prior to the analyses of the isolated extracellular lipid particles, the human carotid artery plaques were imaged with three-dimensional electron microscopy and sections of human coronary arteries were analyzed with imaging mass spectrometry to study the spatial distribution of lipids in different stages of atherosclerosis. In the human coronary arteries, the lipid domains found in advanced atherosclerotic lesions were different from the domains found in atheroma-stage artery sections, and even more different from healthy sections of coronary arteries. In the human carotid artery plaques, cholesterol crystals were found to be large sheets or needle-like structures, and they appeared to be growing out from large lipid particles in the intima. For the purpose of studying the chemical and physical characteristics of the extracellular lipid particles, the extracellular particles were isolated from aortic valve leaflets and coronary artery plaques. The lipid particles were examined with multiple tools to study their lipid composition, protein composition, protein structure, size, and density. The extracellular lipid particles, both in human aortic valve leaflets and human carotid arteries, were found to be derived from plasma lipoproteins, mainly from low density lipoprotein (LDL) or very low density lipoprotein (VLDL). Apart from multiple small exchangeable lipoproteins, like apolipoprotein (apo) E, apoA-family, and apoC-family, the particles contained mainly apolipoprotein B-100 (apoB-100), the integral protein of LDL and VLDL, and they contained features which suggest that they were multiply modified. Another goal was to find which modifications would change the intimal or valvular extracellular lipid particles to such fused and aggregated lipid particles that were found in the valves and intimal plaques, and which modifications would induce a sterile inflammatory response similar to the response the extracellular lipid particles induce. To study the possible culprit modifications, both the extracellular lipid particles, in vitro-generated cholesterol crystals, and LDL that was modified by lipolysis, proteolysis, and oxidation, were applied to human primary monocyte-derived macrophages. Both the isolated extracellular lipid particles and LDL modified with a combination of phospholipolysis by PLA2 and cholesterol esterase were found to be able to activate a multiprotein complex inflammasome in human primary monocyte-derived macrophages in vitro, and to induce the secretion of proinflammatory cytokines. According to the results of this thesis, the lipid particles in the arterial intima and in the aortic valve are active components of atherosclerosis and aortic stenosis. They can induce the cells in the intima and in the valve to produce inflammatory cytokines and thus can affect the progress of these diseases.Aorttastenoosi eli aorttaläpän kalkkinen kovettumatauti ja ateroskleroosi eli valtimokovettumatauti ovat hitaasti eteneviä tauteja. Koska nämä sydän- ja verisuonitaudit kehittyvät piilossa oireita aiheuttamatta jopa vuosikymmenten ajan, ne ovat yhä edelleen suomalaisten ja läntisen maailman kuolinsyytilastojen kärjessä. Lipidit eli rasva-aineet alkavat kertyä sekä aorttaläppään että valtimoiden seinämään jo paljon ennen kuin mitään kliinisiä merkkejä on havaittavissa. Ateroskleroosissa plakit ovat tyypillisesti täynnä rasvapartikkeleita eli lipidipartikkeleita ja soluja, jotka ovat täynnä rasvapisaroita (vaahtosoluja) ja ne kalkkiintuvat vasta taudin myöhäisvaiheessa. Aorttaläpissä on sen sijaan yhtä aikaa sekä lipidipartikkeleita ja kiteytynyttä kalkkia. Sekä aorttaläpässä että valtimon seinämässä on proteoglykaanikerros, johon lipidipartikkelit tarttuvat kiinni. Kiinni tarttuneet lipidipartikkelit voivat voivat muokkaantua entsyymien vaikutuksesta tai hapettumisen seurauksena. lipidipartikkelien muokkaantuminen voi saada aorttaläpän tai valtimon sisäkerroksen solut reagoimaan steriilillä tulehdusreaktiolla tai muokkaantuneet lipidipartikkelien sisältämä kolesteroli voi kiteytyä suuriksi kolesterolikiteiksi. Tässä väitöskirjassa tutkittiin solunulkoisten lipidipartikkeleiden ominaisuuksia ja niiden levittäytymistä solujen väliseen tilaan. Siten pyrittiin selvittämään solunulkoisten lipidipartikkeleiden alkuperä. Ihmisen kaulavaltimoiden seinämästä valmistettiin malleja kolmiulotteisten elektronimikroskooppikuvien avulla ja ihmisen sepelvaltimoleikkeitä tutkittiin kuvantavalla massaspektrometrilla. Näin saatiin selville, kuinka lipidipartikkelit sijaitsivat valtimoiden seinämässä. Terveiden sepelvaltimoiden lipidipartikkelikertymien laatu ja paikka erosivat aterooma-vaiheen plakkien lipidipartikkelikertymistä ja vielä enemmän ne erosivat pitkälle edenneestä ateroskleroottisesta plakista. Ihmisen kaulavaltimoiden plakeissa kolesterolikiteet olivat sekä neulamaisia että suuria levyjä ja ne näyttivät kasvavan suoraan suurista lipidipartikkeleista. Kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien selvittämiseksi lipidipartikkelit eristettiin sekä aorttaläpistä että kaulavaltimoista. Niistä tutkittiin lipidikoostumusta, proteiinikoostumusta, proteiiniosan rakennetta, partikkelien kokoa ja tiheyttä. Sekä aorttaläpän että kaulavaltimon lipidipartikkeleiden havaittiin olevan peräisin plasman apolipoproteiini (apo)B-100:aa sisältävistä lipoproteiinipartikkeleista, todennäköisimmin joko kevyen lipoproteiinin (LDL) tai erittäin kevyen lipoproteiinin (VLDL) partikkeleista. Partikkelit sisälsivät apoB-100:n lisäksi myös pieniä vaihdettavia apolipoproteiineja, kuten apolipoproteiini (apo) E:tä, apoA-proteiiniperheen ja apoC-proteiiniperheen apolipoproteiineja. ApoB-100 (LDL:n ja VLDL:n tärkein rakenneproteiini) oli yleisin löydetty proteiini. Lipidipartikkeleissa nähtiin merkkejä moninkertaisesta muokkautumisesta. Tutkimuksen toisena tavoitteena oli saada selville, miten aorttaläpän ja valtimon sisäseinämään jääneet lipidipartikkelit muuntuvat plasman lipoproteiineista suuriksi fuusioituneiksi ja aggregoituneiksi lipidipartikkeleiksi. Lisäksi haluttiin tietää, mitkä muokkausmekanismit muuntaisivat lipoproteiinit niin, että solut reagoisivat steriilillä tulehdusreaktiolla eli inflammasomi-kompleksin aktivaatiolla. Mahdollisia muuntumismekanismeja tutkittiin muokkaamalla LDL-partikkeleita lipolyyttisillä ja proteolyyttisillä entsyymeillä ja hapettamalla niitä. Näin muokattuja LDL-partikkeleita ja kaulavaltimoista eristettyjä lipidipartikkeleita annettiin ihmisen plasmasta eristetyistä monosyyteistä erilaistetuille makrofageille. Sekä solunulkoiset lipidipartikkelit että fosfolipolyysillä muokatut plasman lipoproteiinit saivat koeolosuhteissa makrofagit reagoimaan inflammasomin aktivaatiolla ja tuottamaan tulehdusvälittäjäaineita. Väitöskirjan tulosten mukaan voidaan todeta, että lipidipartikkelit aorttaläpässä ja valtimon sisäseinämässä ovat oleellinen osa aorttastenoosin ja ateroskleroosin syntyprosessissa. Ne saavat aorttaläpän ja valtimon sisäseinämän solut tuottamaan tulehdusvälittäjäaineita ja vaikuttavat siten sekä aorttastenoosin että ateroskleroosin etenemiseen