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Adsortpion einzelner Proteinsorten und kompetetive Adsorption aus Proteinmischungen auf polymeren Grenzflächen

By Michael Oberle


Spherical nanoparticles with polymer coatings or entirely composed of polymers have their own technological importance as drug carriers. These nanostructures can be constructed as stimuli-responsive devices that deliver a drug in spatial-, temporal- and dosage-controlled fashion. The nanoparticles rapidly form a protein corona as soon as they get immersed in biological fluids like blood or plasma. Ultimately, the composition of the protein corona will modify the physical/chemical properties of the nanoparticle and will determine its biological fate. The fact is that competitive and cooperative adsorption of different proteins play a pivotal role in this process. In this thesis charged core-shell microgels were used as model systems to study single and competitive protein adsorptions. The microgels consist of a solid polystyrene core, a highly swollen poly- (N-isopropylacrylamide) shell and defined amounts of acrylic acid to introduce charge. Experimental data for the adsorption of single type proteins were obtained by Isothermal Titration Calorimetry (ITC). The challenges of using ITC as a method to characterize protein nanoparticle interactions are discussed. Finally, the evaluation of ITC data with the Langmuir model and a cooperative binding model are compared. In contrast to the Langmuir model this model offers a more quantitative interpretation of binding isotherms with the advantage to show more details regarding the driving forces contributing to the adsorption process. In a second part experimental data for the competitive adsorption from binary mixtures were obtained by fluorescence spectroscopy and compared to the predictions from the cooperative binding model. It was demonstrated that for the proteins lysozyme, papain, RNase and cytochrome c the experimental data are in good agreement with the predictions and the expansion to multi-component mixtures is possible. The remaining parts of the thesis are concerned with the structural properties of the core-shell microgels. For this purpose the polymers were investigated by Atomic Force Microscopy (AFM) and Anomalous Small Angle X-ray Scattering (ASAXS). The AFM images in air revealed a strongly collapsed structure on a silicon surface. Moreover, the adsorption of lysozyme onto the shell of the microgel changed the phase of the AFM signal indicating a change in the mechanical properties. For the measurements in liquid it was shown that the microgels can be attached via electrostatic interactions with a functionalized silicon surface. Upon protein adsorption the shell of the surface-attached microgels began to shrink. For the ASAXS part cytochrome c, an iron containing protein, was adsorbed onto the microgel and analyzed in the energy range of the K-absorption edge of Fe at three different energies. From the pure-resonant scattering contribution the thickness of the protein layer is determined and correlated with the corresponding protein concentration.Sphärische Nanopartikel mit Polymerbeschichtungen oder vollständig aus Polymeren zusammengesetzte Nanopartikel haben eine große technologische Bedeutung als Trägermaterialien für Medikamente. Diese Nanostrukturen können so konstruiert werden, dass durch einen äußeren Reiz die Wirkstofffreisetzung zeitlich und räumlich kontrolliert erfolgen kann. Ebenso kann über diesenWeg die Dosierung kontrolliert werden. Sobald Nanopartikel mit biologischen Flüssigkeiten wie Blut oder Plasmaplasma in Kontaktkommen, bildet sich um diese eine Protein Korona. Die Zusammensetzung der Protein Korona bestimmt jetzt die physikalischen- und chemischen Eigenschaften der Nanopartikel und die Wechselwirkungen mit einem Organismus. In diesem Prozess spielt die kompetitive und kooperative Adsorption verschiedener Proteine eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurde die Adsorption von einzelnen Proteinsorten und die kompetitive Adsorption aus Proteinmischungen auf geladene Kern-Schale Mikrogele untersucht. Die Mikrogele bestehen aus einem festen Polystyrol-Kern, einer stark gequollenen Schale aus Poly-(N-isopropylacrylamide) und definierten Mengen des Copolymers Acrylsäure, welches eine geladene Carboxylgruppe in das Mikrogel einführt. Die Adsorptionsisothermen einzelner Proteinsorten wurden mit der Isothermalen Titrationskalorimetrie (ITC) gemessen. In diesem Zusammenhang wurden die Herausforderungen dieser Methode zur Charakterisierung von Protein-Nanopartikel-Wechselwirkungen diskutiert. Ferner wurde die Auswertung der ITC-Daten mit dem Langmuir-Modell und einem "kooperativen" Bindungsmodell verglichen. Im Gegensatz zum Langmuir-Modell bietet dieses Bindungsmodell eine quantitative Analyse der Bindungsisothermen, mit der Möglichkeit mehr Details zu den treibenden Kräften, die zur Adsorption beitragen, zu verarbeiten. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die kompetitive Adsorption aus binären Proteinmischungen mit Fluoreszenzspektroskopie gemessen und mit Vorhersagen durch das "kooperative" Bindungsmodell verglichen. Es wurde gezeigt, dass die die experimentellen Daten für die Proteine Lysozym, Papain, RNase und Cytochrome c in guter Übereinstimmung mit den Vorhersagen sind. Die weiteren Teile der Dissertation beschäftigen sich mit den strukturellen Eigenschaften der Kern-Schale Mikrogele. Zu diesem Zweck wurden die Polymere mit Rasterkraftmikroskopie (AFM) und anomaler Kleinwinkelröntgenstreuung (ASAXS) untersucht. Die AFM-Bilder in Luft zeigten eine stark zusammengeschrumpfte Struktur auf einer Siliziumoberfläche. Darüber hinaus konnte bei der Adsorption von Lysozym auf die Schale des Mikrogels eine Phasenänderung des AFM-Signals festgestellt werden, welches auf eine Änderung der mechanischen Eigenschaften des Polymers hinweist. Für die AFM Messungen in Flüssigkeit wurde gezeigt, dass die Mikrogele über elektrostatische Wechselwirkungen auf einer funktionalisierten Siliziumoberfläche immobilisiert werden können. Zusätzliche konnte gezeigt werden, dass die Proteinadsorption zu einem Schrumpfen des auf der Oberfläche gebundenen Mikrogels führt. Für die ASAXS Messungen wurden die Fe-haltige Proteine Cytochrom c auf das Mikrogel adsorbiert und die Probe wurde bei drei verschiedenen Energien am Rand der K-Kante von Eisen gemessen. Aus dem Betrag der rein resonanten Streuung der eisenhaltigen Proteins konnte sowohl die Dicke der Proteinschicht ermittelt werden als auch die entsprechende Proteinkonzentration pro Nanopartikel

Topics: 541 Physikalische Chemie, competitive protein adsorption, thermodynamics, microgels, isothermal ttration calorimetry, targeted drug delivery, kompetetive Protein-Adsorption, Thermodynamik, Mikrogele, isothermale Tirtationskalorimetrie, gezielte Wirkstofffreisetzung
Year: 2016
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