Der Effekt von Akt (PKB) an der Aktivitaet von mTOR (mammalian target of rapamycin)

Abstract

Es wurde gezeigt, dass die Serine/Threonine-Kinase Akt, oder auch PKB genannt, mTOR (mammalian target of rapamycin) durch direkte Phosphorylierung aktiviert. Kuerzlich erschienene Reporte zeigten, das mTOR Aktivitaet vom intrazellulaeren ATP-Level und von der AMPK-Aktivitaet abhaengt. AMPK- Aktivitaet inhibiert dabei mTOR durch Phosphorylierung von TSC2. In Skelettmuskelzellen von Akt1/Akt2 DKO Maeusen konnte starke Muskelatrophie und eine Reduzierung der Zellgroesse festgestellt werden. Dieses Ergebnis etabliert, dass die Kinase Akt notwendig fuer das Zellwachstum und die Zellmasse in Saeugetierzellen (Skelettmuskelzellen) ist. mTOR ist ein zentraler Regulator von Zellwachstum und Proliferation, das haben zunehmende Beweise in letzter Zeit deutlich gezeigt. Die Kinase mTOR phosphoryliert die beiden downstream gelegenen Proteine 4EBP und S6K, deren Phosphorylierung zur erhoehten Proteinsynthese fuehrt. Unter Verwendung von biochemischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass mTOR-Aktivitaet in Akt1/Akt2 DKO MEFs sehr stark reduziert ist, und das liefert den ersten genetischen Beweis, dass Akt notwendig ist fuer mTOR-Aktivierung. Es hat sich auch gezeigt, dass die Phosphorylierung von TSC2 durch Akt nicht ausreicht, um mTOR vollenstaendig zu aktivieren. Genetische und biochemische Methoden wurden verwendet, um Akt als einen Regulator des Energiegleichgewichtes zu etablieren. Zusaetzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Akt unbedingt notwendig fuer die Beibehaltung eines basalen Levels von intrazellulaerem ATP ist. AMPK-Aktivitaet ist abhaengig vom AMP/ATP-Verhaeltnis und nicht ausschliesslich vom ATP- Level. Obwohl bereits demonstriert worden ist, dass Ueberexprimieren von aktiviertem Akt zu einem erhoehten intrazellularen ATP-Level fuehrt, wurde nicht gezeigt, welche Auswirkungen dieses auf das AMP/ATP-Verhaeltnis und die AMPK-Aktivitaet hat. In dieser Promotion wurde der erste genetische Beweiss erbracht, dass Akt fuer die Erhaltung des intrazellulaeren ATP-Levels, zur Herunterregulierung des AMP/ATP-Verhaeltnisses und zur Deaktivierung von AMPK notwendig ist. Die Funktion von Akt ist notwendig fuer die vollstaendige Aktivierung von mTOR. Expression von dominant negativer AMPK fuehrte zur fast vollstaendigen Wiederherstellung der mTOR-Aktivitaet in Akt1/Akt2 DKO Zellen. Zusaetzlich wurden wichtige Beobachtungen in TSC2-KO Zellen gemacht, denn es zeigte sich, dass in diesen Zellen auf Grund stark reduzierter Akt-Aktivitaet der intrazellulaere ATP-Level reduziert und die AMPK-Aktivitaet dadurch stark erhoeht ist. Weiterhin ist festzustellen, dass TSC2 Phosphorylierung durch Akt nicht ausreicht, um mTOR vollstaendig zu aktivieren; ein zusaetzlicher Pathway, der AMPK-Aktivitaet inhibiert, wurde notwendig. Um diesen Mechanismus zu untermauern, wurde ein fuer Akt konstitutiv aktiviertes TSC2 Protein in TSC2-KO Zellen ueberexprimiert. Diese Zelllinie war nicht inert gegenueber ATP Reduzierung hervorgerufen durch Inhibitoren im Vergleich zur TSC2-KO Zelllinie. Interessanterweise konnte ein zusaetzliches Ueberexpremieren von aktiviertem Akt in dieser Zelllinie, durch Deaktivierung der AMPK, diesen Effekt umkehren. Die in dieser Forschungsarbeit herausgestellten Informationen haben zur Entdeckung einer neuen Verbindung im Pathway Akt-TSC2-mTOR gefuehrt, der linear von Akt zur Inhibierung von AMPK fuehrt. In der Literatur wird die Aktivierung von mTOR durch die Inhibierung von AMPK und durch die direkte Phosphorylierung von TSC2 als zwei separate Pathways dargestellt. Es wurde gezeigt, dass Akt mTOR durch AMPK und direkte Phosphorylierung von TSC2 aktiviert. Ein Schema des etablierten Akt-TSC2-mTOR Pathways ist in Abbildung 27, Kapitel 6.4., dargestellt.The serine/threonine kinase Akt was shown to activate the mammalian target of rapamycin (mTOR) through direct phosphorylation and inhibition of tuberous sclerosis complex 2 (TSC2). Recent reports show that mTOR activity is also dependent on the intracellular level of ATP and reduced AMPK activity, thereby AMPK inhibits mTOR through the phosphorylation and inactivation of TSC2. Skeletal muscle cells of Akt1/Akt2 DKO mice show severe atrophy and a decrease in cell size. This result established that Akt is required for determining the cell growth or cell mass in mammalian (skeletal muscle) cells. Increasing body of evidence placed mTOR as a central regulator of cell growth (size) and proliferation. The kinase mTOR affects its downstream targets 4EBP1 and S6K1, both are phosphorylated by its kinase activity and increasing protein synthesis. Biochemical experiments in this thesis show that the activity of mTOR is impaired in Akt1/Akt2 DKO cells, and this provided first genetic evidence that Akt is required for mTOR activity. TSC2 has been shown to be directly phosphorylated by Akt, however, it appears that phosphorylation of TSC2 by Akt is not sufficient to fully activate mTOR. Genetic and biochemical approaches have been applied to establish that Akt is a regulator of energy homeostasis and is required to maintain a threshold level of ATP in the cell. AMPK activity is dependent on AMP/ATP ratios and not solely on the ATP level. Although it has been demonstrated before that cells over-expressing activated Akt display a higher ATP level, it has never been established that the AMP/ATP level is reduced in those cells, neither their low AMPK activity. This thesis provided for the first time genetic evidence that Akt is required to maintain the intracellular level of ATP, a low AMP/ATP ratio and low AMPK activity. This function of Akt is required in order to fully activate mTOR. Expression of DN-AMPK in Akt deficient cells that display a high AMPK activity restored mTOR activity in those cells. Additionally, it has been observed for the first time that the ATP level is low and AMPK activity is up-regulated due to a low Akt activity in TSC2-null cells. Finally, the results have proven that direct phosphorylation of TSC2 by Akt is not sufficient to fully activate mTOR and that Akt activates mTOR through an additional pathway that inhibits AMPK. Using expression of an Akt-phosphomimetic mutant of TSC2 in TSC2-null cells showed that this mutant is not inert to ATP depletion and still inhibits mTOR activity. However, ectopically expression of activated Akt inhibits the activity of the phosphomimetic mutant of TSC2 via downregulation of AMPK. In summary, this work revealed a linear pathway downstream of Akt that inhibits AMPK, which otherwise activated the TSC2-mTOR pathway. Currently, the activation of mTOR via inhibition of AMPK and through phosphorylation of TSC2 by Akt are viewed as two separate pathways leading to the activation of mTOR. The findings establish a new pathway from Akt via AMPK to mTOR and challenged the current knowledge by showing that Akt is activating mTOR through both AMPK and through direct phosphorylation of TSC2. The regulation of the Akt-TSC2-mTOR pathway is demonstrated in the scheme in Figure 27 CHAPTER 6.4

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Last time updated on 15/11/2016

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