Beschreibung und Charakterisierung von Bakterien aus Schwebstoffflocken (river snow) der Elbe in Deutschland und des South Saskatchewan Rivers in Kanada

Abstract

In den Schwebstoffflocken der Fliessgewässer spielen Bakterien neben Algen, Pilzen, Protozoen, anorganischen Partikeln und organischem Detritus eine wesentliche Rolle. Am Beispiel der Elbe wurde die phylogenetische Diversität und Physiologie dieser aquatischen Bakterien mittels molekularbiologischer Methoden (in situ Hybridisierung, 16S rDNS Sequenzanalyse), aerober und anaerober Kultivierung, sowie konfokaler laser scanning Mikroskopie untersucht. Im Jahresverlauf zeigte sich, dass die mikrobielle Lebensgemeinschaft der Schwebstoffflocken in Frühjahresproben durch eine grosse bakterielle Diversität gekennzeichnet war. In Sommerproben dagegen dominierten unterschiedliche Cyanobakterien und Grünalgen. Herbst- und Winterproben wiesen eine deutliche Abnahme der bakteriellen Gesamtzellzahl auf. Mehr als 70% aller mit DAPI nachgewiesenen Bakterien konnten mit der Eubakterien spezifischen Sonde EUB338 detektiert werden. Die in situ Analyse der Schwebstoffflocken mit unterschiedlichen Oligonukleotid Sonden, zeigte, dass die überwiegende Mehrheit der phylogenetischen Bakteriengruppen jahreszeitlichen Schwankungen mit Werten von 2% für die Planktomyceten bis zu 36% für die Cytophagen-Flavobakterien Gruppe unterlagen. Im Gegensatz dazu, waren die beta-Proteobakterien in allen Jahreszeiten anzutreffen, und erreichten mit Werten zwischen 50-54% von der Gesamtzellzahl die höchsten Zellzahlen überhaupt. Statische Schwebstoffflockenkulturen, angesetzt mit steril filtriertem Elbewasser und angereichert mit Spuren verschiedener Substrate, führten zu morphologischen und phylogenetischen Veränderungen der mikrobiellen Lebensgemeinschaft. Zugabe von N-acetylglucosamin ergab einen deutlichen Anstieg der beta-Proteobakterien. Die aerobe und anaerobe Kultivierung auf einer Vielzahl verschiedener Medien führte zur Isolierung von 40 Bakterienreinkulturen aus unterschiedlichen phylogenetischen Gruppen. Mit Hilfe neu entwickelter, spezifischer Oligonukleotidsonden, konnten die isolierten Bakterien als relevante und dominante Vertreter der mikrobiellen Lebensgemeinschaft ermittelt werden. Für die gleichzeitige Erfassung zellulärer Komponenten und extrazellulärer polymerer Sustanzen (EPS) wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neue kombinierte Technik aus Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Lektin-Bindungs-Analyse (FISH-LBA) entwickelt. Die Schwebstoffflocken wurden direkt aus dem Elbewasser in Objektträgerkammern überführt, in denen die komplette Präparation, bestehend aus Fixierung, FISH, LBA und anschließender mikroskopischer Analyse, durchgeführt wurde. Anorganische Partikel aus den Schwebstoffflocken, wie auch die Autofluoreszenz von photosynthetischen Organismen, hatten keinen störenden Einfluß auf die neue Methode. FITC markierte Lektine von Triticum vulgaris, Limulus polyphemus, Arachis hypogaea, Phaseolus vulgaris und Pseudomonas aeruginosa konnten durch Bindung an die jeweils spezifischen Zucker in der EPS-Matrix der Schwebstoffflocken bestimmte Bereiche innerhalb der Flocken sichtbar machen. Die neue Methode ermöglichte die Detektion von einzelnen Bakterien und Mikrokolonien unterschiedlicher phylogenetischer Gruppen mit den sie umgebenden EPS Komponenten in verschiedenen Bereichen der Flocken. Darüber hinaus war auch die chemische Identifizierung von Bestandteilen der Schleimkapseln und Zellhüllen einzelner eukariontischer und prokariontischer Zellen möglich. Kultivierung der bakteriellen Lebensgemeinschaft der Schwebstoffflocken aus dem South Saskatchewan River in Saskatchewan, Kanada, auf verschiedenen Medien führte zur Isolierung der bakteriellen Reinkultur F8. Durch 16S rDNS Sequenzierung und phylogenetische Analyse konnte die Zugehörigkeit des Isolates F8 zur Gruppe der gamma-Proteobakterien ermittelt werden. Stamm F8 fiel bei mikroskopischen Beobachtungen durch eine bemerkenswerte Interaktion der einzelnen bakteriellen Zellen entlang eines selbst produzierten filamentösen Netzwerkes auf. Der koordinierte Bewegungsablauf startete mit der Akkumulierung eines von den Zellen produzierten Materials, was sich im weiteren Verlauf zu Filamenten unterschiedlicher Länge umformte. Diese Filamente bildeten daraufhin ein komplexes Netzwerk, an dem sich die Zellen entlang bewegten. Die Zellen schlossen sich zunächst in kleineren und später in größeren Gruppen zusammen. Der Prozess endete mit grossen Zellanhäufungen und einem zellfreien Netzwerk aus Filamenten. Dieser Prozess konnte sowohl bei Kultivierung auf Fest- als auch in Flüssigmedien beobachtet werden. Obwohl der Stamm F8 in der Lage war, auf einer Vielzahl unterschiedlicher Medien zu wachsen, trat die Bildung von Filamenten nur in nährstoffarmen Medien auf. Die Filamente konnten mit verschiedenen Farbstoffen angefärbt werden. Ihre Anwesenheit konnte sowohl lichtmikroskopisch als auch durch konfokale laser scanning Mikroskopie und Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden.Aerobic and anaerobic cultivation techniques, 16S rDNA based phylogeny, and fluorescent in situ hybridization (FISH) were used to describe the phylogenetic diversity and physiological versatility of lotic microbial aggregates (river snow) obtained from the river Elbe. In the course of the year, the river snow community was characterized by a great bacterial diversity in spring with total bacterial cell counts of 2.5 x 108 cells per ml, the predominant occurrence of algae in summer (total bacterial cell counts 2.0 x 108), and the reduction of total bacterial cell counts in autumn 1.2 x 108 and winter 1.4 x 108 (all mean values). In all river snow samples, more than 70% of the bacteria, counted with the general DNA stain DAPI, also hybridized with the Bacteria specific probe EUB338. In situ analysis of the bacterial river snow community with a comprehensive suite of specific rRNA targeted probes revealed population dynamics to be governed by seasonal factors. During all seasons, beta-Proteobacteria constituted the numerically most important bacterial group forming up to 54% of the total cell counts. In contrast to this, the relative abundance of other major bacterial lineages ranged from 2% for the order Planctomycetales to 36% for Cytophaga-Flavobacteria. Batch cultures of river snow samples fed with sterile Elbe river water (0.2-µm-pore-size filtered) and supplemented with minimal amounts (0.1% w/v) of different substrates resulted in remarkable changes of the microbial community composition, with N-acetylglucosamine favouring the growth of beta-Proteobacteria. Cultivation of river snow under aerobic and anaerobic conditions with a variety of different media resulted in the isolation of 40 bacterial strains. Phenotypical and phylogenetical analysis revealed them as mostly unknown organisms affiliated to different bacterial phyla. Application of newly developed specific oligonucleotide probes proved the cultivated bacteria, including Aeromonadaceae, affiliated to the gamma-Proteobacteria, clostridia and the numerically abundant beta-Proteobacteria, as in situ relevant members of the river snow community. For the simultaneous detection of cellular components and extracellular polymeric substances (EPS) in lotic microbial aggregates (river snow) a new technique combining fluorescent in situ hybridization and lectin-binding-analysis (FISH-LBA) was developed. River snow aggregates were directly collected from the bulk water phase into coverslip chambers, in which the complete procedure including fixation, fluorescent in situ hybridization, lectin-binding and optical analysis by confocal laser scanning microscopy was performed. Neither autofluorescence originating from photosynthetic organisms nor inorganic particles did negatively interfere with the FISH-LBA technique. In Elbe river snow samples distinct compartments of the river snow structure could be visualized with FITC-labelled lectins from Triticum vulgaris, Limulus polyphemus, Arachis hypogaea, Phaseolus vulgaris and Pseudomonas aeruginosa, each binding to frequently occurring different saccharide residues in the EPS matrix. The analysis could be performed on different levels of complexity. The new combined technique visualized bacteria of different phylogenetic groups in the entire river snow structure as well as EPS components linked with various microcolonies. Slime-layers and cell-envelopes of individual eucaryotic and procaryotic cells could also be observed. Cultivation and isolation of members of the bacterial river snow community of the Canadian South Saskatchewan River on the oligotrophic medium FBM led to the discovery of the bacterial strain F8. 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis revealed this isolate as a deep branching gamma-Proteobacterium. Strain F8 was generally noticed by a remarkable kind of a self-produced filamentous network. The process started with rod shaped bacterial cells, accumulating a self-produced material around them, followed by the formation of filaments of different length. Filament formation developed into a network in form of a sponge like pattern. Cells moved along this network assembling firstly small and subsequently larger clusters. The process ended with large aggregates of cells, leaving an empty network of filaments behind which could be observed in cultures growing on solid and/or liquid media. Although strain F8 was able to grow in a variety of different media, filament formation occurred only in low nutrient media. Filaments could be stained with different dyes. The presence of filaments could be revealed by light microscopy, confocal laser scanning microscopy (CLSM) as well as by transmission electron microscopy (TEM)