Entwicklung eines Screeningverfahrens zum simultanen Nachweis von Opioiden in menschlichen Körperflüssigkeiten, Geweben und Haaren für forensisch-toxikologische und klinische Untersuchungen

Abstract

In den letzten Jahren stieg in Deutschland der Gebrauch bzw. Missbrauch von Opioid-Analgetika zunehmend an. Das entwickelte Verfahren sollte unter Einbeziehung neuer Substanzen möglichst viele verschiedene Opioide und auch ihre pharmakologisch aktiven Stoffwechselprodukte berücksichtigen.rnVor Analyse wurden Blut-, Serum- oder Urinproben mit Phosphatpuffer versetzt und mittels Festphasenextraktion an C18-Säulenmaterial aufgearbeitet. Post-Mortem-Gewebematerial wurde mit isotonischer Kochsalzlösung versetzt, homogenisiert und anschließend durch eine Festphasenextraktion aufgereinigt. Haarproben wurden nach Zerkleinerung mit Methanol unter Ultrabeschallung extrahiert. Die Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (Elektrosprayionisation im positiven Modus) erwies sich als geeignetes Verfahren für die simultane Bestimmung der Opioide in biologischem Probenmaterial (Körperflüssigkeiten, Gewebe und Haaren). Der Multi-Analyt Assay erlaubt die quantitative Analyse von 35 verschiedenen Opioiden. Die Analyten wurden durch eine Phenyl-Hexyl Säule und einen Wasser/Acetonitril Gradienten durch eine UPLC 1290 Infinity gekoppelt mit einem 6490 Triple Quadrupol von Agilent Technologies separiert.rnDie LC/MS Methode zur simultanen Bestimmung von 35 Opioiden in Serum und Haaren wurde nach den Richtlinien der Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie (GTFCh) validiert. Im Fall der Serumvalidierung lagen die Nachweisgrenzen zwischen 0.02 und 0.6 ng/ml und die Bestimmungsgrenzen im Bereich von 0.1 bis 2.0 ng/ml. Die Kalibrationskurven waren für die Kalibrationslevel 1 bis 6 linear. Wiederfindungsraten lagen für alle Verbindungen zwischen 51 und 88 %, außer für Alfentanil, Bisnortiliidn, Pethidin und Morphin-3-Glucuronid. Der Matrixeffekt lag zwischen 86 % (Ethylmorphin) und 105 % (Desomorphin). Für fast alle Analyten konnten akzeptable Werte bei der Bestimmung der Genauigkeit und Richtigkeit nach den Richtlinien der GTFCh erhalten werden. Im Fall der Validierung der Haarproben lagen die Nachweisgrenzen zwischen 0.004 und 0.6 ng/Probe und die Bestimmungsgrenzen zwischen 0.1 ng/Probe und 2.0 ng/Probe. Für die Kalibrationslevel 1 bis 6 waren alle Kalibrationsgeraden linear. Die Wiederfindungsraten lagen für die Opioide im Bereich von 73.5 % (Morphin-6-Glucuronid) und 114.1 % (Hydrocodon). Die Werte für die Bestimmung der Richtigkeit lagen zwischen - 6.6 % (Methadon) und + 11.7 % (Pholcodin). Präzisionsdaten wurden zwischen 1.0 % für Dextromethorphan und 11.5 % für Methadon ermittelt. Die Kriterien der GTFCh konnten bei Ermittlung des Matrixeffekts für alle Substanzen erfüllt werden, außer für 6-Monoacetylmorphin, Bisnortilidin, Meperidin, Methadon, Morphin-3-glucuronid, Morphin-6-glucuronid, Normeperidin, Nortilidin und Tramadol.rnZum Test des Verfahrens an authentischem Probenmaterial wurden 206 Proben von Körperflüssigkeiten mit Hilfe der simultanen LC/MS Screening Methode untersucht. Über 150 Proben wurden im Rahmen von forensisch-toxikologischen Untersuchungen am Instituts für Rechtsmedizin Mainz analysiert. Dabei konnten 23 der 35 Opioide in den realen Proben nachgewiesen werden. Zur Untersuchung der Pharmakokinetik von Opioiden bei Patienten der anästhesiologischen Intensivstation mit Sepsis wurden über 50 Blutproben untersucht. Den Patienten wurde im Rahmen einer klinischen Studie einmal täglich vier Tage lang Blut abgenommen. In den Serumproben wurde hauptsächlich Sufentanil (0.2 – 0.8 ng/ml in 58 Fällen) und Piritramid (0.4 – 11 ng/ml in 56 Fällen) gefunden. Außerdem wurden die Proben von Körperflüssigkeiten und Gewebe von 13 verschiedenen Autopsiefällen mit Hilfe des Multi-Analyt Assays auf Opioide untersucht.rnIn einem zweiten Schritt wurde die Extraktions- und Messmethode zur Quantifizierung der 35 Opioide am Forensic Medicine Center in Ho Chi Minh City (Vietnam) etabliert. Insgesamt wurden 85 Herzblutproben von Obduktionsfällen mit Verdacht auf Opiatintoxikation näher untersucht. Der überwiegende Teil der untersuchten Fälle konnte auf eine Heroin- bzw. Morphin-Vergiftung zurückgeführt werden. Morphin wurde in 68 Fällen im Konzentrationsbereich 1.7 – 1400 ng/ml und der Heroinmetabolit 6-Monoactetylmorphin in 34 Fällen (0.3 – 160 ng/ml) nachgewiesen werden.rnSchließlich wurden noch 15 Haarproben von Patienten einer psychiatrischen Klinik, die illegale Rauschmittel konsumiert hatten, mit Hilfe der simultanen Opioid-LC/MS Screeningmethode gemessen. Die Ergebnisse der Untersuchung wurden mit früheren Auswertungen von gaschromatographischen Analysen verglichen. Es zeigte sich eine weitgehende Übereinstimmung der Untersuchungsergebnisse für die Opioide 6-Monoacetylmorphin, Morphin, Codein, Dihydrocodein und Methadon. Mit der LC/MS Methode konnten weitere Substanzen, wie zum Beispiel Bisnortilidin, Dextromethorphan und Tramadol in den Haarproben gefunden werden, die bislang nicht entdeckt worden waren.rnOpioids are widespread therapeutics for treatment of pain, especially chronic pain syndromes and are also frequently abused. Therefore the aim of the study was to develop an analytical method which enables the detection of large number of opioids simultaneously. The method should also detect pharmacological active metabolites as well as new designer drugs.rnBlood, serum or urine samples were diluted with phosphate buffer and purified by C18 solid-phase extraction. Saline was added to post mortem tissues, thoroughly mixed and purified by solid-phase extraction. Methanol was added to hair samples and incubated in an ultrasonic bath. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method using electrospray ionization in positive ionization mode was developed for the simultaneous detection of multiple opioid-type drugs in biological samples like body fluids, tissues and hair. The presented assay allows the quantitative determination of 35 opioids. The analytes were separated on a phenyl-hexyl column by formic acid/acetonitrile gradient elution using an UPLC 1290 Infinity coupled with a 6490 Triple Quadrupole mass spectrometer.rnThe LC/MS method for the simultaneous detection of 35 opioids in serum and hair samples was validated according the current standards of the German Society of Toxicological and Forensic Chemistry (GTFCh). In case of the serum validation the limits of detection ranged from 0.02 to 0.6 ng/ml and the lower limits of quantification ranged from 0.1 to 2.0 ng/ml. The calibration curves were linear between Calibration Levels 1 to 6 for all 35 substances. Recovery rates ranged between 51 and 88 % for all compounds except alfentanil, bisnortilidine, pethidine and morphine-3-glucuronide. The matrix effect ranged from 86 % (ethylmorphine) to 105 % (desomorphine). Using the validation procedure proposed by the German Society of Toxicological and Forensic Chemistry, acceptable precision and accuracy data for almost all analytes were obtained. In case of the hair validation the limits of detection ranged from 0.004 to 0.6 ng/sample and the lower limits of quantification ranged from 0.1 to 2.0 ng/sample. The calibration curves were linear for all substances between Calibration Level 1 to 6. Recovery data ranged between 73.5 % (morphine-3-glucuronide) und 114.1 % (hydrocodone). Accuracy data ranged from - 6.6 % (methadone) to + 11.7 % (pholcodine). Precision data ranged from 1.0 (dextromethorphan) to 11.5 % (methadone). According to the standards of the GTFCh acceptable matrix effect data for all opioids were obtained, instead of 6-monoacetylmorphine, bisnortilidine, pethidine, methadone, morphine-3-gucuronide, morphine-6-glucuronide, nortilidine and tramadol.rn206 authentic body fluid samples were analyzed to test the applicability of the liquid chromatography tandem mass spectrometry method for opioids. More than 150 samples were provided by police authorities. 25 of the 35 analytes were found in serum samples. Over 50 blood samples were taken from sepsis patients from the intensive care unit (department of anesthesiology, university hospital medical center Mainz) to study the pharmacokinetics of opioids. Blood samples were taken daily for 4 days. Sufentanil and piritramide were the analytes found most frequently in the samples from the intensive care unit. The blood serum concentration of sufentanil detected ranged from 0.2 – 0.8 ng/ml in 58 cases. The blood level concentrations of piritramide ranged from 0.4 - 11 ng/ml in 56 cases. Moreover, the method was used to investigate 13 drug-related deaths. Therefor body fluids and post mortem tissues were analyzed. rnThe extraction and LC/MS multi-analyte assay was well-established in the forensic medicine center in Ho Chi Minh City (Vietnam). Moreover, the method was used to investigate suspected fatal opiate intoxication from autopsy cases. 85 heart blood samples were analyzed. The majority proportion of these cases could be reduced to heroin or rather morphine intoxications. The blood serum concentrations of morphine detected ranged from 1.7 – 1400 ng/ml in 68 case. The blood level of 6-monoacteylmorphine (main metabolite of heroin) ranged from 0.3 – 160 ng/ml in 34 cases. rnThe method presented for the detection of opioids is also an excellent tool for the investigation of hair samples. Furthermore 15 hair samples from patients of a psychiatric hospital were analyzed. The results were compared with previous investigations using gas chromatography/mass spectrometry. The results of the LC/MS and GC/MS measurements were largely identical for the opioids 6-monoacetylmorphine, morphine, codeine, dihydrocodeine and methadone. The presented LC/MS Screening method enables the detection of more analytes comparing GC/MS assy. Bisnortilidine, dextromethorphan and tramadol were now found in the hair samples, too.r

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